Helicobacter pylori lipopoliszacharid módosítása, Lewis antigén expresszióját, és a gyomor kolonizáció koleszterin-függő

Helicobacter pylori katalógusa lipopoliszacharid módosítása, Lewis antigén expresszióját, és a gyomor kolonizáció koleszterin-függő katalógusa Abstract Background katalógusa katalógusa Helicobacter pylori katalógusa kifejezetten felveszi a koleszterin, és magában foglalja azt a bakteriális membránt, mégis keveset jelenleg ismert koleszterin élettani szerepét. Összehasonlítottuk fenotípusok és in vivo
kolonizációs képességét a H. pylori katalógusa termesztett egy meghatározott, a szérum-mentes tápközeg, F12, 1 mg /ml albumin tartalmazó 0-50 ug /ml koleszterin.
Eredmények
Míg kétszeresére voltak alig befolyásolja a koleszterin, más nyílt fenotípusos változásokat figyeltünk meg. H. pylori katalógusa törzs SS1 termesztett meghatározott közegben koleszterin sikeresen gyarmatosították a gyomor futóegér, míg SS1 nélkül termesztett koleszterin nem gyarmatosítani. A H. pylori
lipopoliszacharid gyakran jeleníti Lewis X és /vagy Y antigének. Expression ezen antigének által mért teljes-sejt ELISA-t jelentősen fokozott válaszul növekedés törzs SS1, 26695, vagy G27 koleszterinszint. Ezen túlmenően, elektroforetikus analízissel lipopoliszacharid vad típusú G27 és mutánsok hiányzik az O-lánc feltárta szerkezeti változások belül az oligoszacharid mag /lipid-A-csoport. Ezek a válaszok Lewis antigén szintek és a lipopoliszacharidot profilok koleszterin rendelkezésre álló voltak nagyon specifikus, mert változás nem történt, amikor koleszterin helyére β-szitoszterol vagy epe-sók. Roncsolása kódoló gének koleszterin α-glikozil-vagy iipid A foszfoetanol transzferáz nem volt hatása a Lewis expresszióját, sem a lipopoliszacharid profilok, sem a koleszterin reagálóképességét ezeket a tulajdonságokat. Megzavarják a lipid A-1-foszfatáz gén megszüntette a hatása a koleszterin lipopoliszacharid profilok, de nem annak hatását Lewis kifejezést.
Következtetések
Együttesen ezek az eredmények azt sugallják, hogy a koleszterin kiürülését vezet aberráns formáinak LPS hogy függnek defoszforiláció a lipid a, az 1-helyzetben. A kísérleti modell a megfigyelt hatások a koleszterin tárgyalja, amelyben egymás utáni lépéseket lipopoliszacharid biogenezis és függetlenül bemutatása Lewis antigén a sejt felületén, függ membrán összetételét. Ezek az új eredmények azt mutatják, hogy a koleszterin a rendelkezésre álló megengedi H. pylori katalógusa, hogy módosítsa a sejt boríték oly módon, hogy hatással lehet kolonizáció befogadó szövet in vivo katalógusa.
Háttér katalógusa Helicobacter pylori katalógusa van egy nagyon szűk -adapted kórokozó, hogy él az emberi gyomorban, továbbítjuk elsősorban a családokon belül, és nincs ismert környezeti tározó. Krónikus fertőzés tünetmentes lehet, vagy okozhat gyomorhurut, gyomorfekély, vagy gyomorrák. Annak megállapítására, fertőzés, baktérium kell túlélni átutazás savas gyomor rekesz [1]. Ez behatol, és létrehozza tartózkodási a védő nyálka réteg, egy lipid és koleszterin-gazdag környezetben [2, 3]. Ezen belül a rést a baktérium alkalmaz a különböző mechanizmusok, hogy elkerüljék a gazda immunválaszát.
Lipopoliszacharidok (LPS) a felszínen a H. pylori katalógusa vannak módosítva, hogy megjelenítse bizonyos humán vércsoport antigének, elsősorban Lewis antigének X és Y [ ,,,0],4-7], és kevésbé gyakran H típus 1, I-antigén, vércsoport, vagy Lewis-antigének A vagy B [8-10]. Ezek a felületi LPS antigének létrehozásához szükséges a fertőzés, mivel a mutáns törzsek hibás LPS O-antigén szintézise vagy Lewis-X /Y kifejezés nem megtelepedni egerekben [11-13]. Bizonyíték van arra, hogy Lewis expresszált antigének a bakteriális felszíni hozzájárulnak tapadását a H. pylori katalógusa gyomor hámsejtek [10, 14], és szerepet játszanak a szövet tropizmus [15-17]. Gyomor epiteliális sejtek is expresszálnak, Lewis antigének [18, 19], ami arra utal, hogy a kijelző a Lewis antigének a bakteriális felszíni szolgálhat a mimikri stratégia. Tanulmányok a klinikai izolátumok [18, 20], valamint a kísérleti állatokban fertőzések [21] támogatja ezt a szerepet a bakteriális Lewis antigének immunrendszer kijátszása. Az emberi fertőzés, a H. pylori
Lewis antigéneket kapcsolódik a súlyosságát gyomorfekély és duodenitis [16, 22]. Egy másik fontos jellemzője a H. pylori katalógusa LPS a módosított lipid A szerkezet, a csökkent acilezési és kevesebb töltött csoportok, mint jellemző enterobaktériumok [23]. Ezek a lipid-A módosítások minimalizálása endotoxikus és gyulladásgátló tulajdonságokkal a H. pylori katalógusa LPS (áttekintve [24]).
Koleszterin egy nem esszenciális tápanyag H. pylori katalógusa, bár ez elősegíti a növekedést a szérum-mentes közegben [ ,,,0],25, 26]. A H. pylori
kifejezetten magukba foglalják a koleszterin a bakteriális membrán [27], csakúgy, mint a korlátozott számú patogén és kommenzális baktériumok, beleértve a Proteus mirabilis, a Lactobacillus acidophilus katalógusa, Borrelia sp katalógusa., És a Mycoplasma
[ ,,,0],28-30]. Koleszterin erősítheti a membrán ezek a szervezetek [30-32]. A H. pylori
is egyedileg alkotnak koleszterin α-glikozid [33, 34], és ez a metabolit tovább módosítható acilezéssel vagy phosphatidylation [34]. Alfa-glucosylated koleszterin felforgatja gazda immunválaszát, hogy a baktérium egy egérmodelljében, keresztül elnyomása fagocitózis és a T-sejt-aktiválás [35]. Más szerepek koleszterin és a koleszterin metabolitok bakteriális membránt kell még felfedezésre vár. Ebben a jelentésben, azt bizonyítják, hogy a bioszintézis lipopoliszacharid, beleértve a Lewis-antigén expressziója és az LPS mag /lipid A módosítás, megváltoztat a rendelkezésre álló koleszterin a táptalajban. Bemutatjuk adat azt jelzi, hogy ezek a változások a sejt boríték jelentősen befolyásolhatja a kórokozó /host kölcsönhatás egy állati modellben a fertőzés.
Módszerek
Baktériumtörzsek és tenyésztési körülmények
törzsek H pylori katalógusa tartalmazza a laboratóriumi törzs ATCC43504 (származás: Ausztrália), 26695 (UK), klinikai izolátum G27 (Olaszország [36], feltéve, hogy N. Salama), és az egér adaptált törzs SS1 (Ausztrália, feltéve, Adrian Lee [37]). A baktériumokat 37 ° C-on, mikroaerob atmoszférában, 5% O 2/10% CO 2 Campylobacter vér agar (CBA). A baktériumokat passzáltuk, minden 2-3 napig, és nem több, mint 25 nap, hogy minimálisra csökkentsék a genetikai sodródás. Növekedési kémiailag definiált közegben [26], a baktériumok oltottunk CBA szövettenyésztő lombikokban tartalmazó Ham-féle F12 (Gibco), 1 mg /ml szarvasmarha-szérumalbumint (zsírsav-mentes, Sigma A7906), a továbbiakban az egész meghatározott közegben. Folyékony tenyészeteket passzáltuk napi hígítással friss tápközegben kezdeti sűrűségben 1-2 × 10 6 /ml, és a használt átjáró 3 és 5 Sejtkultúra grade koleszterin (> 99%, Sigma) adtunk F12 mint egy stabil 10 × emulzió, amely 500 ug /ml koleszterin diszpergáljuk 10 mg /ml albumin, amely szerint állítottuk elő [38]. Az alábbi média kiegészítések végeztük hasonló módon: B-szitoszterin (szintetikus, 95%), nátrium-taurokolát, nátrium-glikokolát, β-ösztradiol, progeszteron (mind a Sigmától), dehidroepiandroszteron (Calbiochem) és β-koprosztanol (Matreya) .
megduplázása idők során meghatározott log fázisú növekedés mennyiségi életképes sejtek felhasználásával, a Cell titer Glo reagenssel (Promega) hitelesített és leírt [39]. Mérése biomassza CFU, celluláris fehérje, vagy az ATP mind termelt következetes eredményeket. Az 1 érték attomol ATP cellánként [40] feltételezték rutin folyosón. Lehetséges pontatlansága ez az érték nem alapvetően befolyásolják az adatok értelmezése.
Izogén gén zavarok értek behelyezésével Campylobacter coli
kloramfenikolrezisztencia elem (cat katalógusa) szerint által leírt stratégia Chalker munkatársai
[41]. Primereket gondosan tervezni, hogy célszekvenciával belül nyitott leolvasási kereteket, és az 1. táblázatban felsorolt ​​fúziós PCR reakciókat PCR Extender Rendszer (5Prime) tartalmazott 2,3 nM mindegyik gélen tisztítottuk sablon, 50 um primert, 1 × tuning puffer, 1,25 mm kiegészítő Mg ++, 0,2 mM mindegyik dNTP-ből, és 0,01 egység /ml koncentrációjú polimeráz. A fúziós ciklus körülmények a következők voltak: 94 ° C 2,5 perc, 10 ciklus [94 ° C-on 15 másodpercig, 45 ° C 60 másodperc, 68 ° C-on 60 másodperc per kb], 25 ciklusban [94 ° C-on 15 másodpercig, primer-specifikus Tm 30 másodperc, 68 ° C-on 60 másodperc után kb], végső extenzió 68 ° C 6-8 percig. A fúziós termékeket ismét amplifikáltuk Pfx50 (Invitrogen), hogy növelje mennyiséget, majd tisztítjuk a Qiaquick PCR Purification Kittel (Qiagen). Befogadó törzs termesztett 1 nap CBA transzformáltunk 500 ng végső amplikon természetes transzformáció [42, 43], majd kiválasztás 7-10 napig CBA tartalmazó 15 ug /ml klóramfenikolt. Annak biztosítása érdekében, allélikus csere, a kapott törzseket értékeltük PCR a genomi DNS-t használva GoTaq (Promega) primerekkel az 1. táblázat PCR-stratégiát és eredményeket az ábrán 1.Table 1. Primer szekvenciákat.
primerek allél zavar katalógusa egy Matton CAT fwd [41] katalógusa GATATAGATTGAAAAGTGGAT katalógusa F5B katalógusa CAT rev [41] katalógusa TTATCAGTGCGACAAACTGGG katalógusa cgtfwd
atggttattgttttagtcgtgga katalógusa cgtM3 katalógusa ATCCACTTTTCAATCTATATCatatggtggatatagcggtaatg katalógusa cgtM5 katalógusa CCCAGTTTGTCGCACTGATAAttaaaaacttgcaccctttatgt katalógusa cgtrev katalógusa ctctgatcgcttcttcataaact katalógusa pmifwd katalógusa atgaaaattaaaaatatcttactgagtggg katalógusa pmiM3 katalógusa ATCCACTTTTCAATCTATATCatctaaaccattagggctttcaatatac katalógusa pmiM5 katalógusa CCCAGTTTGTCGCACTGATAActttagtgaacgaggtagaaacaaac
pmirev
ttttgtctgttaaaatcatcatcaat katalógusa lpxE fwd katalógusa atgaaaaaattcttatttaaacaaaaattttgtgaaagc katalógusa lpxEM3 katalógusa ATCCACTTTTCAATCTATATCcccaaacgctgatcgttgat katalógusa lpxEM5 katalógusa CCCAGTTTGTCGCACTGATAAcgagcgcccttatggag katalógusa lpxErev katalógusa ttaaggctttttggggcttgtaaa katalógusa eptAfwd katalógusa ttggcatcattattccatctgaggt
eptAM3 katalógusa ATCCACTTTTCAATCTATATCgcaacaccccaaaaacaacgata katalógusa eptAM5 katalógusa CCCAGTTTGTCGCACTGATAAagcctgattaacgcctatgaca katalógusa eptArev katalógusa ttactcttttttgtgtttaagcagatctaaagaa katalógusa további primert megerősítését génelrontási
G27_951fwd
agtgattcaagatggcgtgaaaa
F1
G27_953rev
ccaagctcaatcatttctttgtcttt
R1
G27_37fwd
cggcatggggatcaatcaag
F2
G27_39rev
ctcccgtcttgcccggtaac
R2
G2719fwd
gggcgataaaatcgtgtttca
F3
G2721rev
tcccctttatcgtttatgctaatga
R3
G2720fwd
cccaaactgagcgctaaca
F4
G2722rev
aagaaatttcaaggtataatagtttccaag
R4
aRespective gén számok nyilvános adatbázisok 26695 és G27 a következők: [KBRT: hp0421, G27_952 katalógusa], [PMI katalógusa (rfbM katalógusa): hp0043, G27_38 katalógusa], [lpxE: hp0021, G27_20 katalógusa], [EPTA: hp0022, G27_21 katalógusa].
bRighthand oszlop felsorolja a rövid primer használt megnevezések 1. ábra katalógusa 1. ábra PCR vizsgálata allél zavarok H. pylori törzzsel G27. Genomi DNS-t preparáltunk génroncsolt G27 törzsek következő három átjárók alatt kloramfenikol szelekció, majd PCR-rel amplifikáljuk, amint az egyes rendszer. Primerek szekvenciákat 1. táblázatban adjuk meg: A. roncsolása CGT. Öt példa látható a hét egyedi klónok, amelyek mind azonos eredményt adott a képernyőn. B. roncsolása PMI (rfbM). Az egész chloramphenicol-rezisztens populáció passzáltuk minden fordulóban a kiválasztás, anélkül klónszelekció. C. roncsolása lpxE és EPTA. Az egész chloramphenicol-rezisztens populáció passzáltuk minden fordulóban a kiválasztás, anélkül klónszelekció.
Gyomor kolonizáció katalógusa Állatkísérletek jóváhagyta az LSUHSCS Institutional Animál Care and Use Committee. Nő mongol futóegér tartottuk szokásos étrend ad libitum katalógusa. Ahhoz, hogy megőrizzük motilitás, a H. pylori
törzset SS1 tenyésztettük egy éjszakán át mikroaerob körülmények T75 palackokban, amely 40 ml F12-es táptalajon 0,4 mg /ml albumin és 0 vagy 50 ug /ml koleszterin. A motilis planktonikus baktériumokat centrifugálással összegyűjtöttük, és újra szuszpendáljuk izotóniás sóoldatban. Telepképző egységek (CFU) mértük ezek inokulumok sorozatos hígítással és galvanizáló a CBA, és ezek a mérések megerősítik egyenlő adagolási életképes baktériumok között a két növekedési körülmények között. Körülbelül 10 8 CFU per 30

• A segédprogram a citokeratin 7 és 20 (CK7 /20) immunhisztokémiai a különbséget a rövid szegmens Barrett oesophagus gyomor- bélrendszeri metaplasiaként Vajon megbízható-e?
• A hozzáadott egy pH-érzékeny gél javítja mikroemulzió stabilitását a megcélzott eltávolítására vastagbél ammónia