Helicobacter pylori modifica lipopolisaccaride, espressione dell'antigene Lewis, e la colonizzazione gastrica sono colesterolo-dependent

Helicobacter pylori
modifica lipopolisaccaride, espressione dell'antigene Lewis, e la colonizzazione gastrica sono colesterolo-dipendenti
Abstract
sfondo
Helicobacter pylori
prende specificamente il colesterolo e incorpora nella membrana batterica, ma poco si sa circa attualmente ruoli fisiologici di colesterolo. Abbiamo confrontato fenotipi e in vivo
capacità di colonizzazione di H. pylori
cresciuto in un definito, terreno di coltura privo di siero, F12 con 1 mg /ml di albumina contenente da 0 a colesterolo 50 mg /ml.
Risultati
Mentre cicli di raddoppio erano in gran parte influenzato da colesterolo, sono stati osservati altri cambiamenti fenotipici evidenti. H. pylori
SS1 ceppo cresciuto in media definita con colesterolo colonizzato con successo lo stomaco di gerbilli, mentre SS1 coltivato senza colesterolo non è riuscita a colonizzare. H. pylori
lipopolisaccaride spesso mostra Lewis X e /o antigeni Y. L'espressione di questi antigeni misurati da cellula intera ELISA è stata notevolmente migliorata in risposta alla crescita del ceppo SS1, 26695, o G27 in colesterolo. Inoltre, l'analisi elettroforetica di lipopolisaccaride nel tipo di G27 natura e in mutanti privi del O-chain rivelato cambiamenti strutturali all'interno del nucleo oligosaccaride /lipide A frazioni. Queste risposte dei livelli di antigene Lewis e nei profili lipopolisaccaridi alla disponibilità di colesterolo erano altamente specifico, perché nessun cambiamento ha avuto luogo quando il colesterolo è stato sostituito da sali beta-sitosterolo o biliari. Turbativa dei geni codificanti colesterolo α-glucosiltransferasi o lipide A transferasi fosfoetanolamina avuto alcun effetto sulla espressione Lewis, né sui profili lipopolisaccaridi, né la capacità di risposta del colesterolo di queste proprietà. Turbativa del lipide A gene 1-fosfatasi eliminato l'effetto di colesterolo sui profili lipopolisaccaridi, ma non il suo effetto sulla espressione Lewis.
Conclusioni
Insieme, questi risultati suggeriscono che la deplezione di colesterolo porta a forme aberranti di LPS che dipendono defosforilazione di lipide a nella posizione 1. Un modello sperimentale per gli effetti osservati di colesterolo è discusso in quali fasi sequenziali di lipopolisaccaride biogenesi e, indipendentemente, presentazione di Lewis antigeni sulla superficie cellulare, dipendono composizione della membrana. Questi nuovi risultati dimostrano che la disponibilità del colesterolo permette H. pylori
di modificare la sua busta cellula in modi che possono avere un impatto colonizzazione del tessuto ospite in vivo
.
Sfondo
Helicobacter pylori
è altamente di nicchia patogeno -adapted che abita la stomaco umano, viene trasmesso in primo luogo all'interno delle famiglie, e non ha conosciuto serbatoio ambientale. Infezioni croniche possono essere asintomatiche o causare gastrite, ulcera, o il cancro gastrico. Per stabilire l'infezione, il batterio deve sopravvivere transito attraverso il vano gastrico acido [1]. Esso penetra e stabilisce residenza nello strato di muco protettivo, un ambiente lipid- e ricca di colesterolo [2, 3]. All'interno di questa nicchia il batterio impiega una varietà di meccanismi per eludere la risposta immunitaria dell'ospite.
Lipopolisaccaridi (LPS) sulla superficie di H. pylori
vengono modificati per visualizzare determinati antigeni dei gruppi sanguigni umani, soprattutto Lewis antigeni X e Y [ ,,,0],4-7], e meno frequentemente H di tipo 1, i-antigene, gruppo sanguigno A, o Lewis antigeni A o B [8-10]. Questi antigeni di superficie LPS sono necessari per la creazione di infezione, perché ceppi mutanti difettosi per la sintesi LPS O-antigene o per l'espressione Lewis X /Y riescono a colonizzare topi [11-13]. Ci sono prove che Lewis antigeni espressi sulla superficie batterica contribuire alla adesione di H. pylori
alle cellule gastriche epiteliali [10, 14], e giocare un ruolo nel tropismo tissutale [15-17]. cellule epiteliali gastriche esprimono antigeni Lewis [18, 19], suggerendo che la visualizzazione di Lewis antigeni sulla superficie batterica può servire come strategia mimetismo. Studi di isolati clinici [18, 20] e infezioni sperimentali su animali [21] sostengono questo ruolo per batterica Lewis antigeni in evasione immune. In infezione umana, H. pylori
antigeni Lewis sono stati collegati alla gravità di ulcera peptica e duodenite [16, 22]. Un'altra caratteristica importante di H. pylori
LPS viene modificato sua lipide A struttura, con acilazione ridotto e meno gruppi carichi che è tipico di enterobatteri [23]. Queste modifiche lipide A minimizzare endotossici e infiammatorie proprietà di H. pylori
LPS (recensito in [24]).
Il colesterolo è una sostanza nutritiva non essenziale per H pylori
, anche se promuove la crescita nei mezzi privi di siero [ ,,,0],25, 26]. H. pylori
specificamente incorporare il colesterolo nella membrana batterica [27], così come un numero limitato di batteri patogeni e commensali, tra cui Proteus mirabilis, Lactobacillus acidophilus
, Borrelia sp
., E Mycoplasma
[ ,,,0],28-30]. Il colesterolo può rafforzare la membrana in questi organismi [30-32]. H. pylori
anche formare in modo univoco colesterolo α-glucoside [33, 34], e questo metabolita può essere ulteriormente modificato da acilazione o phosphatidylation [34]. colesterolo Alpha-Glucosilata sovverte ospitare risposta immunitaria al batterio in un modello murino, attraverso la soppressione di fagocitosi e di attivazione delle cellule T [35]. Altri ruoli per il colesterolo e colesterolo metaboliti della membrana batterica sono ancora da esplorare. In questo rapporto, dimostriamo che la biosintesi di lipopolisaccaride, compresa l'espressione dell'antigene Lewis e nucleo LPS /lipide modifica A, sono modificate di disponibilità di colesterolo nel mezzo di crescita. Vi presentiamo i dati indicano che questi cambiamenti nella busta cellulare può influenzare in modo significativo l'interazione patogeno /host in un modello animale di infezione.
Metodi
ceppi batterici e condizioni di crescita
ceppi di H. pylori
inclusi il laboratorio ceppo ATCC43504 (origine: Australia), 26695 (UK), clinica isolato G27 (Italia [36], fornito da N. Salama), e il mouse adattato ceppo SS1 (Australia, fornito da Adrian Lee [37]). I batteri sono stati mantenuti a 37 ° C in atmosfera microaerobica 5% O 2/10% CO 2 su agar sangue Campylobacter (CBA). I batteri sono stati diversi passaggi ogni 2 o 3 giorni, e per non più di 25 giorni, per ridurre al minimo la deriva genetica. Per la crescita nel medio chimica definita [26], i batteri sono stati inoculati dalla CBA in fiasche di coltura di tessuti contenenti F12 di Ham (Gibco) con 1 mg /ml di albumina sierica bovina (priva di acidi grassi, Sigma A7906), di cui tutto come mezzo di definito. colture liquide sono stati diversi passaggi giornalmente diluizione in terreno fresco a densità iniziale di 1-2 × 10 6 /ml, ed utilizzato a passaggio 3 a 5. cellulare cultura grade colesterolo (> 99%, Sigma) è stato aggiunto a F12 come stabile 10 × emulsione contenente 500 ug /ml di colesterolo dispersi in 10 mg /ml di albumina, che è stato preparato secondo [38]. Le seguenti aggiunte media sono stati effettuati in modo analogo: ß-sitosterolo (sintetico, 95%), taurocolato di sodio, glicocolato di sodio, β-estradiolo, progesterone (tutti da Sigma), deidroepiandrosterone (Calbiochem), e β-coprostanol (Matreya) .
volte Raddoppio sono stati determinati durante la crescita fase di registro quantificazione cellule vitali utilizzando il cellulare Titer Glo reagente (Promega) come convalidato e descritto [39]. Misurazione della biomassa come CFU, come proteina cellulare, o come ATP hanno tutti prodotto risultati coerenti. Un valore pari a 1 attomol ATP per cella [40] è stata assunta per il passaggio di routine. Possibili inesattezza di questo valore non fondamentalmente influenzare l'interpretazione dei dati.
Interruzioni gene isogenici sono stati ottenuti mediante l'inserimento di un coli Campylobacter
elemento resistenza al cloramfenicolo (cat
) secondo la strategia descritta da Chalker et al
[41]. I primer sono stati attentamente progettati in modo tale da indirizzare sequenza all'interno di cornici di lettura aperta, e sono elencati nella Tabella 1. Le reazioni di fusione PCR utilizzando l'estensione del sistema PCR (5Prime) conteneva 2,3 nM ogni modello di gel-purificati, 50 micron di primer, 1 × buffer di messa a punto, 1,25 mm ulteriore Mg ++, 0.2 mm ciascuno dNTP, e .01 U /ml polimerasi. condizioni del ciclo di fusione sono state le seguenti: 94 ° C 2,5 min, 10 cicli [94 ° C 15 sec, 45 ° C 60 sec, 68 ° C 60 sec per kb], 25 cicli [94 ° C 15 sec, specifici primer Tm 30 sec, 68 ° C 60 sec per kb], estensione finale a 68 ° C 6-8 min. prodotti di fusione sono stati riamplificati con Pfx50 (Invitrogen) per aumentare la quantità, poi purificato utilizzando il kit di purificazione QIAquick PCR (Qiagen). ceppi riceventi cresciuti 1 giorno in CBA sono stati trasformati con 500 ng dell'amplicone finale utilizzando trasformazione naturale [42, 43] seguito da selezione per 7-10 giorni in CBA contenenti 15 mg /ml cloramfenicolo. Per garantire la sostituzione allelica, i ceppi risultanti sono stati valutati mediante PCR del DNA genomico usando GoTaq (Promega) con primers specificati nella Tabella 1. strategia PCR e risultati sono mostrati in Figura 1.Table sequenze primer 1.
primer per allelica interruzione
un
CAT FWD [41]
GATATAGATTGAAAAGTGGAT
F5b
CAT rev [41]
TTATCAGTGCGACAAACTGGG
cgtfwd
atggttattgttttagtcgtgga
cgtM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCatatggtggatatagcggtaatg
cgtM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAttaaaaacttgcaccctttatgt
cgtrev
ctctgatcgcttcttcataaact
pmifwd
atgaaaattaaaaatatcttactgagtggg
pmiM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCatctaaaccattagggctttcaatatac
pmiM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAActttagtgaacgaggtagaaacaaac
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ttttgtctgttaaaatcatcatcaat
lpxE FWD
atgaaaaaattcttatttaaacaaaaattttgtgaaagc
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ATCCACTTTTCAATCTATATCcccaaacgctgatcgttgat
lpxEM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAcgagcgcccttatggag
lpxErev
ttaaggctttttggggcttgtaaa
eptAfwd
ttggcatcattattccatctgaggt
eptAM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCgcaacaccccaaaaacaacgata
eptAM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAagcctgattaacgcctatgaca
eptArev
ttactcttttttgtgtttaagcagatctaaagaa
primer aggiuntivi per la conferma del gene perturbazione
G27_951fwd
agtgattcaagatggcgtgaaaa
F1
G27_953rev
ccaagctcaatcatttctttgtcttt
R1
G27_37fwd
cggcatggggatcaatcaag
F2
G27_39rev
ctcccgtcttgcccggtaac
R2
G2719fwd
gggcgataaaatcgtgtttca
F3
G2721rev
tcccctttatcgtttatgctaatga
R3
G2720fwd
cccaaactgagcgctaaca
F4
G2722rev
aagaaatttcaaggtataatagtttccaag
R4
numeri gene aRespective in banche dati pubbliche per 26695 e G27 sono i seguenti: [CGT: hp0421, G27_952
], [
PMI (rfbM
): hp0043, G27_38
], [lpxE: hp0021, G27_20
], [Epta:. hp0022, G27_21
]
colonna brighthand elenca le denominazioni di primer brevi utilizzati in Figura 1. Figura 1
PCR verifica delle interruzioni alleliche di H. pylori ceppo G27. Il DNA genomico è stato preparato da ceppi G27 gene-perturbato seguenti tre passaggi sotto selezione cloramfenicolo, allora la PCR amplificato come mostrato in ogni schema. Primer sequenze sono riportati nella tabella 1. A. Interruzione del CGT. Cinque esempi sono mostrati su sette cloni individuali, i quali hanno dato risultati identici nella schermata. B. Interruzione del PMI (rfbM). L'intera popolazione cloramfenicolo resistenti è stato diversi passaggi in ogni turno di selezione, senza selezione clonale. C. Interruzione del lpxE e Epta. L'intera popolazione cloramfenicolo resistenti è stato diversi passaggi in ogni turno di selezione, senza selezione clonale.
Colonizzazione gastrica
Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato di cura degli animali e Usa LSUHSCS istituzionale. Female gerbilli mongoli sono stati mantenuti a dieta normale ad libitum
. Per preservare la motilità, H. pylori
ceppo SS1 è stato coltivato durante la notte in condizioni microaerofilia in fiasche T75 contenenti 40 ml di terreno F12 con 0,4 mg /ml di albumina e 0 o colesterolo 50 mg /ml. I batteri planctonici motile sono state raccolte per centrifugazione e risospese in soluzione salina isotonica. unità formanti colonie (CFU) sono stati misurati in questi inoculi mediante diluizione seriale e placcatura su CBA, e queste misurazioni hanno confermato uguale dosaggio di batteri vitali tra le due condizioni di crescita. Circa il 10 8 CFU per 30 ml sono stati dati per via orale per gli animali (n = 6-9 per gruppo). Gli animali sono stati sacrificati 11 giorni più tardi, e lo stomaco sono stati rimossi e sezionati. H. pylori
presente in omogenati gastrico sono stati quantificata mediante diluizione di serie e placcatura in CBA contenente 5-fluorocytosine (5 mg /ml), vancomicina (10 mg /ml), amfotericina B (5 mg /ml), bacitracina ( 30 ug /ml), polimixina B (10 U /ml), e trimetoprim (10 ug /ml) [44]. Determinazioni in doppio CFU sono state fatte per più diluizioni di ciascun campione di tessuto.
Cellula intera ELISA
procedure standard [6, 7, 45], sono stati adattati per l'uso di perossidasi coniugato anticorpo secondario. Tutti gli anticorpi sono stati ottenuti da Calbiochem. culture durante la notte di batteri sono stati raccolti per centrifugazione a 3500 × g Compra di 10-15 minuti, lavati in tampone fosfato di Dulbecco, e repelleted a 10.000 × g
per 2 minuti, poi risospese in 15% glicerolo /0,9% NaCl. Le sospensioni cellulari sono stati analizzati per il contenuto di proteine ​​e conservati a -20 ° C. campioni di cellule contenenti quantità note di proteine ​​sono stati rapidamente diluiti in 50 mM di bicarbonato di sodio /carbonato pH 9,55 e dispensati immediatamente in pozzetti di una piastra ELISA (Costar΅7). Le piastre sono state sigillate e frigorifero durante la notte, quindi bloccate per 90 min a 3% di albumina sierica bovina dissolto nel tampone di lavaggio che consisteva di pH fosfato di sodio 0,1 M 7.4 /0.1 M NaCl /0,1% w /v Tween-20. Anticorpo primario, monoclonale anti-Lewis X (Signet clone P12) o anti-Lewis Y (Signet clone F3), diluito 1: 500 in tampone di lavaggio /1% BSA, è stato aggiunto per 2 ore, seguita da quattro cambi di tampone di lavaggio. L'anticorpo secondario, una diluizione 1: 2500 di rafano perossidasi coniugato capra anti-topo IgM in tampone di lavaggio /1% BSA, è stato aggiunto per 90 min, seguito da quattro variazioni di tampone di lavaggio. Il substrato cromogenico era 0,42 mM tetrametilbenzidina e 0,02% H 2O 2 in 50 mM acetato /citrato pH 5.5 [46]. Dopo 15 minuti a temperatura ambiente, la reazione è stata fermata con 1 /5th vol 2,5 N H 2SO 4, e il cambiamento di colore è stata misurata in un lettore di piastre a 450 nm. Nel controlli negativi omettendo sia anticorpo primario o secondario, o con E. coli HB101
ceppo sostituito H. pylori
, cambio di colore era trascurabile (A < 0,05). I livelli di Lewis Y erano trascurabili (A < 0,1) in ceppo 26695 o 43504, così come i livelli di Lewis X in SS1
elettroforetico analisi di lipopolisaccaridi
H. pylori
culture sono stati raccolti come descritto sopra, e lavati. pellet cellulari sono stati conservati a -70 ° C. Le cellule sono state lisate in 60 mM Tris HCl pH 6,8 contenente 2% SDS a 95-98 ° C per 10 min. Il contenuto proteico è stata misurata usando il saggio di acido bicinconinico (Pierce). Campioni di lisati cellulari sono stati portati al contenuto proteico uguale (1 mg /ml), poi proteolyzed nelle reazioni contenenti (finale) 60 mM Tris HCl pH 6,8, 0,67% SDS, e 0,67 mg /ml proteinasi K a 60 ° C per 2 ore [47]. Per eliminare gli artefatti elettroforetici per la presenza di complessi lipide /detergente, campioni proteolyzed sono stati estratti con fenolo a caldo [48]. Esperimenti di controllo verificato che tutte le bande LPS sono stati recuperati attraverso la seguente procedura di estrazione qualitativamente e senza pregiudizi. campioni Proteolyzed sono stati miscelati con 1 volume di fenolo acquoso 90% e incubate a 70 ° C per 20 min. Dopo raffreddamento a 10 ° C per 1 min, i campioni sono stati centrifugati a 12.000 xg
per 20 minuti a 10 ° C, e la fase acquosa raccolti. Le fasi fenolici sono stati ri-estratti con 1 volume di H 2O a 70 ° C per 10 min, e la centrifugazione ripetute. Gli estratti acquosi combinati sono stati regolati a 0,5 M NaCl e precipitati con 10 vol di etanolo in frigorifero per una notte, poi centrifugati a 20.000 xg
per 20 minuti a 10 ° C ed aria secca. LPS purificati campioni sono stati ridisciolto in tampone Laemmli [49] a 95 ° C per 5 min. I campioni sono stati applicati al 15% poliacrilammide /0,9% bis minigels contenenti 3.2 M urea con il Laemmli formulazione tampone discontinuo [49], e un gel di impilamento 5%. Dopo l'elettroforesi a 150 V per 75 min, gel sono stati fissati sia durante la notte per la colorazione argento [50] o trasferiti ad polyvinylidenedifluoride membrana utilizzando buffer di trasferimento Tris /glicina [51]. Macchie sono stati bloccati durante la notte nel 3% di albumina sierica bovina e 0,03% NaN 3 nel tampone di lavaggio sopra descritto per ELISA. anticorpo primario (anti-Lewis X o anti-Lewis Y, 1: 200) e anticorpo secondario (coniugato con perossidasi di capra anti-topo IgM, 1: 1000) sono stati diluiti in tampone di lavaggio contenente 0,5% BSA. rilevamento colorimetrico utilizzato 3,3 'Diaminobenzidina con la valorizzazione di cobalto [52]. Densitometria è stata effettuata con il pubblico dominio applicazione Immagine J, disponibile all'indirizzo http:.... //RSB informazioni NIH gov /IJ
Risultati
Poco si sa circa i ruoli fisiologici di colesterolo nel H . pylori
. Per studiare le risposte di H. pylori
al colesterolo, abbiamo adottato un terreno di coltura privo di siero definito, F12 con 1 mg /ml di albumina, in cui questo batterio può essere stabilmente diversi passaggi [26]. Questa modesta concentrazione di albumina aumenta la crescita [25, 26] e allevia l'aderenza stretta di superfici di cultura che si verifica in media liberi di proteine ​​[53]. In questo mezzo definito, aggiunta di colesterolo 50 mg /ml non ha alterato significativamente il tasso di crescita (figura 2). L'assenza di effetti di crescita nelle condizioni di coltura scelti era vantaggioso per le indagini l'importanza fisiologica del colesterolo in H. pylori
. Così, siamo stati in grado di confrontare la colonizzazione gastrica di gerbilli per ceppo SS1 che erano state coltivate in un terreno specifico contenente varie quantità di colesterolo (Figura 3). Undici giorni dopo l'inoculazione orale, H. pylori
in gastrico sono stati selettivamente placcato e quantificato. Sorprendentemente, gerbilli furono colonizzate solo dalle culture cresciute in media del colesterolo-contenenti, ma non da H. pylori
cresciuto in mezzo privo di colesterolo (In ogni esperimento, P < .0001 per il confronto di log (CFU /g) tra i gruppi che utilizzano Student a due code t-test). Pertanto, colesterolo era un componente essenziale del mezzo di crescita per stabilire H. pylori
infezione in questo modello animale. Figura 2 Aggiunta di colesterolo per mezzo definito non influisce H. pylori tasso di crescita. culture parallele di ogni ceppo sono state coltivate durante la notte in F12 /albumina (1 mg /ml) in assenza (open bar) o presenza (ombreggiata bar) del colesterolo 50 mg /ml. La densità iniziale popolazione era di 2 × 106 /ml. cicli di raddoppio sono stati calcolati dalla crescita misurata in biomassa. I valori indicati rappresentano la media ± DS di cinque o più indipendenti misurazioni. n
. s
. due code t-test di Student per dati a coppie non ha mostrato significatività statistica.
Figura 3 H. pylori coltivato senza colesterolo non riuscire a colonizzare gerbilli. H. pylori
ceppo SS1 è stato coltivato durante la notte in un terreno specifico contenente colesterolo 0 o 50 mg /ml. Gerbilli sono stati via orale inoculati con 3,5 × 108 CFU (esperimento A) o 1 × 108 CFU (esperimento B). H. pylori
in gastrico sono stati quantificato in 11 giorni. Ogni barra verticale rappresenta la media delle determinazioni duplicate per un animale, e le linee orizzontali dare la mediana per ciascun gruppo di trattamento. In assenza di colonie sono stati recuperati, i valori sono stati registrati come 5 × 102 CFU /g di tessuto, il limite previsto di rilevazione.
Alcuni ceppi di H. pylori
esposto differenze significative in aderenza ai recipienti di coltura seguente passaggio contenuto di colesterolo, suggerendo alterazioni nelle loro proprietà di superficie cellulare (Hildebrandt & McGee, osservazioni non pubblicate). Per questo motivo, abbiamo deciso di indagare lipopolisaccaridi, che costituiscono la componente principale della busta delle cellule, e servono a presentare i biologicamente importanti antigeni Lewis. Abbiamo impiegato una procedura ELISA whole-cell ben consolidata per quantificare antigeni Lewis predominanti, Lewis X e Y (figura 4). In accordo con la letteratura [54, 55], soprattutto Lewis X è stato rilevato nel ceppo 26695, solo Lewis Y è stata rilevata nel SS1, e livelli significativi di entrambi sono stati rilevati in G27. In ogni caso, le letture di assorbanza erano non lineare rispetto al campione di carico, un evento che non è inusuale nei test ELISA [56], e che è stato notato da altri ricercatori che utilizzano questi stessi [7] monoclonali. Pertanto, al fine di confrontare i livelli di antigene nei campioni di H. pylori
coltivate in assenza o presenza di colesterolo, abbiamo eseguito titolazioni parallele su una gamma di carichi campione variano tra 20 e 500 ng di proteine ​​cellule per pozzetto. Queste titolazioni riproducibile mostrato un marcato aumento della quantità di Lewis X e /o Y Lewis antigeni rilevata sulla superficie cellulare quando H. pylori
ceppi 26695, SS1 o G27 sono state coltivate in presenza di colesterolo (Figura 4). Nel replicare esperimenti indipendenti, gli aumenti medi di colesterolo-dipendente sono risultate statisticamente significative (Tabella 2). Risultati simili sono stati ottenuti anche per Lewis X nel ceppo 43504 (dati non mostrati). Spiking campioni con colesterolo al termine del periodo di crescita non ha modificato la quantità di Lewis antigeni rilevato da ELISA (Figura 5A). In un altro esperimento di controllo abbiamo verificato per tutti e quattro di questi ceppi che la quantità di proteine ​​cellula legata ai pozzetti è stata influenzata dalla crescita dei livelli di colesterolo (Figura 5B). Il test ELISA risultati così stabilito che una maggiore espressione superficiale di Lewis antigeni è stata una risposta biologica legittimo colesterolo che si è verificato in tutti i ceppi testati. Questa risposta era specifico per il colesterolo, perché la sostituzione di colesterolo nel mezzo di crescita con gli analoghi strutturali beta-sitosterolo o sodio taurocolato avuto effetto sulla Lewis X o un'espressione Y da G27 (figura 4, pannelli destra e Tabella 3). La risposta Lewis antigene colesterolo rimaneva dopo interruzione del gene per il colesterolo α-glucosiltransferasi (
CGT) nel ceppo G27 (tabella 2, e vedi sotto) e 26695 (dati non riportati), escludendo la partecipazione di α metaboliti -glycoside di cholesterol.Table 2 Miglioramento della superficie cellulare Lewis espressione dell'antigene da parte della crescita di colture in presenza di cholesterol.a

incremento volte rispetto alla cultura senza colesterolo parallelo

Lewis X
Lewis Y

media ± SEM (n)
valore P
media ± SEM (n)
valore P
26695
4.32 ± 0.36 (6)
0,0002
non fatto
SS1 non
fatto
1.88 ± 0.08 (5)
0,0004
G27 wild type
2.85 ± 0,42 (8)
0,0033
2.22 ± 0.24 (8)
0,0016
G27 tlc :: gatto
3.69 ± 0.34 (5)
0.0013
2.88 ± 0.30 (5)
0,0034
G27 lpxE :: gatto
2,59 ± 0,50 (6)
0.025

2.47 ± 0.43 (7)
0,014 Sims antigeni Lewis sono state quantificate in replicato whole-cell ELISA analisi di campioni accoppiati cresciute in presenza o assenza di colesterolo 50 mg /ml. Il carico antigene era di 300 ng proteina cellulare per pozzetto. Rapporti di più: il colesterolo meno sono stati calcolati da duplicati valori di assorbanza netti in ogni test, ed i rapporti determinati in cinque a otto piste indipendenti ELISA sono stati poi mediati. valori di P sono stati calcolati in due code t-test Student per l'ipotesi nulla che il rapporto è uguale superficie cellulare 1.
Tabella 3 Maggiore Lewis espressione dell'antigene è

volte maggiore rispetto alla cultura senza colesterolo parallelo

Lewis X
Lewis Y


media ± SEM (n)
valore P
media ± SEM (n)
valore P
colesterolo
2.96 ± 0.22 (5)
0,0008
2.48 ± 0.10 (4)
0,0007
β- sitosterolo
1,80 ± 0,47 (4)
0,19
1.19 ± 0.13 (3)
0,28
taurocolato
0,64 ± 0,16 (4)
0.12
0.84 ± 0.20 (3)
0,52
Lewis antigeni sono stati quantificati in replica cellula intera ELISA analisi delle culture coppie di H. pylori
G27 coltivate in presenza o meno di 130 micron colesterolo, o un pari concentrazione di β-sitosterolo o taurocolato di sodio. Il carico antigene era di 300 ng proteina cellulare per pozzetto. Rapporti di più: il colesterolo meno sono stati calcolati da duplicati valori di assorbanza netti in ogni test, ed i rapporti determinati in tre a cinque piste indipendenti ELISA sono stati poi mediati. valori di P sono stati calcolati in due code t-test Student per l'ipotesi nulla che il rapporto è pari a 1.
Figura 4 Crescita di colesterolo migliora specificamente visualizzazione della superficie delle cellule degli antigeni Lewis. saggi ELISA cellule intere sono state eseguite su campioni di H. pylori
ceppo 26695 (in alto a sinistra), SS1 (in basso a sinistra), o G27 (in alto e in basso a destra). culture parallele sono state coltivate durante la notte in un terreno specifico contenente 130 mM delle seguenti aggiunte: cerchi, nessuna aggiunta; piazze, colesterolo; triangoli, β-sitosterolo; X, taurocolato. Quantità variabili di sospensione cellulare corrispondenti alle quantità note di proteina cellulare sono stati applicati ai pozzetti delle piastre ELISA e immunoassayed per la presenza di Lewis X o Y Lewis antigeni come descritto in Metodi
. campioni di controllo negativo di E. coli HB101
, o buffer solo spazi vuoti, è caduto sulla linea tratteggiata. letture di assorbanza per i singoli pozzi vengono tracciati. Ripetere esperimenti con tre o più indipendente cresciuto culture hanno dato risultati sostanzialmente identici.
Figura 5 esperimenti di controllo ELISA. A. Spiking con il colesterolo al termine del periodo di crescita non altera espressione dell'antigene Lewis. Le colture di H. pylori
sono state coltivate durante la notte in un terreno specifico, senza (controllo) o con 50 mg /ml di colesterolo (colesterolo cresciuto). Un terzo pallone (colesterolo spillo) è stata coltivata in assenza di colesterolo, raffreddata su ghiaccio, ed è stata aggiunta una quantità equivalente di colesterolo prima che le cellule sono state raccolte. antigeni Lewis sono stati quantificati in duplice copia da cellula intera ELISA, il caricamento di 300 ng proteina cellulare per pozzetto. Rapporti di più: il colesterolo meno sono stati calcolati dalle letture di assorbanza medi netti in ogni test, e viene creato il diagramma significano rapporti ± SEM per 3-5 indipendenti ELISA eseguito. valori di P sono stati calcolati in due code t-test Student per l'ipotesi nulla che il rapporto è pari a 1. Per i confronti etichettati ns, P > .05. B. Equivalente legame delle cellule a piastre ELISA. Campioni di H. pylori
che sono state coltivate in colture in parallelo in assenza (barre bianche) o la presenza di 50 ug /ml di colesterolo (barre grigie) sono stati applicati a piastre a pozzetti multipli nello stesso modo come per i saggi ELISA antigene Lewis, aggiungendo 500 ng di proteina cellulare per pozzetto. Dopo allegato overnight, pozzetti sono stati lavati due volte con soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco, poi proteine ​​in cellule aderenti è stata quantificata utilizzando il reagente BCA. sono riportati i valori medi ± DS di pozzi quadruplicate.
rilevazione di Lewis X e Y da immunoblotting con gli stessi anticorpi monoclonali prodotto un risultato diverso (Figura 6). In diversi tentativi con questa tecnica, che non ha rilevato differenze di colesterolo-dipendente dei livelli di Lewis X o Y, a parte un piccolo aumento di Lewis X 43504 che è stata solo marginalmente significativo. La procedura blotting impiegato campioni LPS estratti da lisati cellulari, e in linea di principio dovrebbe rilevare l'intero pool cellulari antigene Lewis, mentre il metodo ELISA whole-cell è progettato per rilevare soltanto che ha presentato sulla superficie extracellulare. La differenza interessante nei risultati tra la nostra analisi e immunoblot ELISA suggerisce un cambiamento di compartimentazione cellulare dell'antigene Lewis a seconda della disponibilità di colesterolo nel mezzo di crescita. Figura 6 Lewis X e Y antigene profilatura mediante immunoblotting. Campioni di LPS isolato da colture parallele cresciute in assenza (-) o presenza (+) del colesterolo 50 mg /ml sono stati risolti su 15% gel urea. Quantitativi caricati per corsia, come ug di proteine ​​lisato iniziale, sono date nella parte superiore di ogni corsia. Dopo il trasferimento, gli antigeni sono stati immunodetected con anticorpi monoclonali specifici per Lewis X (pannello superiore) o Lewis Y (pannello inferiore). Viene mostrato un esempio rappresentativo di ciascuna. corsie laterali contengono marcatori proteici Prestained (M) o 400 ng di E. coli O111
: B4 LPS. segnale antigenico è apparso solo nelle regioni O a catena di questi H. pylori
ceppi; aree vuote sono state tagliate fuori di conseguenza. Le immunoblot sono stati replicati in modo indipendente con diversi set di campioni, e densitometria è stato utilizzato per quantificare il segnale antigene in ogni corsia. Rapporti per coppie più: campioni di colesterolo meno sono stati calcolati, e il rapporto media ± SEM (n) le macchie sono riportati in blu. L'ipotesi nulla che il rapporto è pari a 1 è stata valutata in un test t di Student a due code.
Oltre alla misura antigene Lewis, abbiamo confrontato direttamente i profili lipopolisaccaride tra culture parallele cresciute in presenza o assenza di colesterolo, usando gel elettroforesi e colorazione argento. In tutti H. pylori
ceppi esaminati, profili banda LPS sono identici fra culture cresciute in terreno definito con il colesterolo a quella ottenuta in un mezzo di siero contenenti o su agar sangue (dati non mostrati), e come previsto [5 , 24, 55, 57] questi profili sono stati altamente specifico ceppo.

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