Helicobacter pylori Lipopolysaccharide Modifikation, Lewis-Antigen-Expression, und Magen-Kolonisation sind Cholesterin-abhängige

Helicobacter pylori
Lipopolysaccharide Modifikation, Lewis-Antigen-Expression, und Magen-Kolonisation sind Cholesterin-abhängige
Zusammenfassung
Hintergrund Helicobacter pylori
nimmt speziell auf Cholesterin und enthält in die Bakterienmembran, noch wenig über Cholesterin die physiologischen Rollen derzeit nicht bekannt. Wir verglichen Phänotypen und in vivo
Besiedlungsfähigkeit von H. pylori
gezüchtet in einem definierten, serumfreien Wachstumsmedium, F12 mit 1 mg /ml Albumin 0 bis 50 &mgr; g /ml Cholesterin enthält.
Ergebnisse
Während Verdopplungszeiten von Cholesterin, andere offensichtliche phänotypische Veränderungen weitgehend unberührt waren, wurden beobachtet. H. pylori
Stamm SS1 in definiertem Medium gezüchtet mit Cholesterin kolonisiert erfolgreich in den Magen von gerbils, während SS1 gewachsen, ohne Cholesterin zu kolonisieren gescheitert. H. pylori
Lipopolysaccharid zeigt oft Lewis X und /oder Y-Antigene. Expression dieser durch whole-cell ELISA gemessen Antigene wurde als Reaktion auf das Wachstum von Stamm SS1, 26695 oder G27 in Cholesterin deutlich verbessert. Darüber hinaus elektrophoretische Analyse von Lipopolysaccharid in Wildtyp G27 und Mutanten der O-Kette fehlt ergab strukturelle Veränderungen innerhalb der Oligosaccharid-Kern /Lipid A-Einheiten. Diese Antworten in Lewis Antigen Ebenen und in Lipopolysaccharide Profile Cholesterin Verfügbarkeit waren sehr spezifisch, da keine Änderungen stattfand, als Cholesterin durch β-Sitosterol oder Gallensalze ersetzt wurde. Störung der Gene eine phosphoethanolamin Transferase α-Glucosyltransferase codiert, oder Lipid Cholesterol hatte keine Wirkung auf Lewis-Expression, noch auf Lipopolysaccharid Profile noch auf den Cholesterin Ansprechempfindlichkeit dieser Eigenschaften. Die Unterbrechung der Lipid-A-1-Phosphatase-Gen, das die Wirkung von Cholesterin auf Lipopolysaccharide Profile beseitigt, aber nicht seine Wirkung auf Lewis Ausdruck.
Schlussfolgerungen
Zusammen stellen diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Cholesterin Erschöpfung zu abweichenden Formen der LPS führt, die auf die Dephosphorylierung abhängig sind von Lipid A an der 1-Position. Eine vorläufige Modell für die beobachteten Effekte von Cholesterin ist, in dem aufeinanderfolgende Schritte von Lipopolysaccharid Biogenese und unabhängig diskutiert, Präsentation der Lewis-Antigen an der Zelloberfläche, hängt von Membranzusammensetzung. Diese neuen Ergebnisse zeigen, dass Cholesterin Verfügbarkeit ermöglicht H. pylori
auf seine Zellhülle in einer Weise ändern, die Kolonisierung des Wirtsgewebe in vivo
auswirken kann.
Hintergrund Helicobacter pylori
ist eine sehr Nische dafür angepasste Erreger der menschlichen Magen lebt, ist in erster Linie innerhalb der Familie übertragen und hat keine Umwelt Reservoir bekannt. Chronische Infektionen können asymptomatisch oder verursachen Gastritis, Geschwüre oder Magenkrebs. Um festzustellen, Infektion, muss das Bakterium Transit durch das saure Magenraum überleben [1]. Es dringt und stellt Wohnsitz in der Schutzschleimschicht, eine Lipid- und cholesterinreichen Umgebung [2, 3]. Innerhalb dieser Nische beschäftigt das Bakterium eine Vielzahl von Mechanismen Immunantwort des Wirts zu entgehen.
Lipopolysaccharide (LPS) auf der Oberfläche von H. pylori
modifiziert sind bestimmte menschliche Blutgruppenantigene anzuzeigen, in erster Linie Antigene Lewis X und Y [ ,,,0],4-7], seltener H-Typ 1, i-Antigen, Blutgruppe A, oder Lewis-Antigene A oder B [8-10]. Diese Oberflächen LPS-Antigene sind für die Etablierung der Infektion, weil Mutantenstämme defekt für LPS O-Antigen-Synthese oder für Lewis-X /Y Ausdruck versagen Mäuse zu kolonisieren [11-13]. Es gibt Hinweise darauf, dass Lewis auf der Bakterienoberfläche exprimierten Antigene tragen zur Anhaftung von H. pylori
zu Magenepithelzellen [10, 14], und eine Rolle in der Gewebstropismus spielen [15-17]. Magenepithelzellen exprimieren auch Lewis-Antigene [18, 19], was darauf hindeutet, dass die Anzeige von Lewis auf der bakteriellen Oberflächenantigene als Mimikry-Strategie dienen. Studien der klinischen Isolate [18, 20] und experimentellen Infektionen bei Tieren [21] unterstützen diese Rolle für bakterielle Lewis in Immunevasion Antigene. In menschlichen Infektion haben H. pylori
Lewis-Antigene auf die Schwere der Magengeschwüren und Zwölffingerdarmentzündung in Verbindung gebracht worden [16, 22]. Ein weiteres wichtiges Merkmal von H. pylori
LPS seine modifizierte Lipid A-Struktur, mit reduzierter Acylierung und weniger als geladene Gruppen von Enterobakterien typisch ist [23]. Diese Lipid A Modifikationen endotoxischen und Entzündungseigenschaften von H. pylori
LPS (Übersicht in [24]) zu minimieren.
Cholesterol ist ein nicht-essentieller Nährstoff für H pylori
, obwohl es das Wachstum in serumfreien Medien fördert [ ,,,0],25, 26]. H. pylori spezifisch
Cholesterol in die Bakterienmembran einzubauen [27], wie auch eine begrenzte Anzahl von pathogenen und kommensalen Bakterien einschließlich Proteus mirabilis, Lactobacillus acidophilus
, Borrelia sp.
Und Mycoplasma
[ ,,,0],28-30]. Cholesterin kann die Membran in diesen Organismen stärken [30-32]. H. pylori
auch Cholesterin α-Glycosid eindeutig bilden [33, 34], und das Stoffwechselprodukt kann weiter durch Acylierung oder Phosphatidylierungsverfahren modifiziert werden [34]. Alpha-glucosylierte Cholesterin gräbt auf das Bakterium in einem Mausmodell Immunantwort hosten, durch Unterdrückung der Phagozytose und der T-Zell-Aktivierung [35]. Andere Rollen für Cholesterin und Cholesterinstoffwechselprodukte in der Bakterienmembran haben noch erforscht werden. In diesem Bericht zeigen wir, dass die Biosynthese von Lipopolysaccharid, einschließlich Lewis-Antigen-Expression und LPS-Kern /Lipid-A-Modifikation, durch die Verfügbarkeit von Cholesterin in dem Wachstumsmedium verändert werden. Wir präsentieren Daten, die angeben, dass diese Veränderungen in der Zellhülle signifikant pathogen /host-Wechselwirkung in einem Tiermodell der Infektion beeinflussen kann.
Methoden Bakterienstämme und Wachstumsbedingungen
Stämme von H pylori
enthaltene Laborstamm ATCC43504 (Herkunft: Australien), 26695 (UK), klinisches Isolat G27 (Italien [36], zur Verfügung gestellt von N. Salama) und der Maus angepasst Stamm SS1 (Australien; zur Verfügung gestellt von Adrian Lee [37]). Bakterien wurden bei 37 ° C in einer mikroaeroben Atmosphäre von 5% O 2/10% CO 2 auf Campylobacter Blutagar (CBA) gehalten. Die Bakterien wurden alle 2 bis 3 Tagen agierten, und nicht länger als 25 Tage, genetische Drift zu minimieren. Für das Wachstum in chemisch definiertem Medium [26], wurden Bakterien aus CBA in Gewebekulturkolben geimpft, das Hams F12 (Gibco) mit 1 mg /ml Rinderserumalbumin (fettsäurefrei, Sigma A7906), bezeichnet im gesamten definierten Medium. Flüssige Kulturen wurden täglich durch Verdünnung in frischem Medium bei Anfangsdichten von 1-2 x 10 agierten 6 /ml und bei Passage 3 bis 5. Zellkultur Cholesterin verwendet (> 99%, Sigma) wurde hinzugefügt F12 als stabile Emulsion 10 × 500 &mgr; g /ml Cholesterin in 10 mg /ml Albumin enthält, dispergiert, die nach [38] hergestellt. &bgr; -Sitosterol (synthetisch, 95%), Natriumtaurocholat, Natriumglykocholat, β-Estradiol, Progesteron (alle von Sigma), Dehydroepiandrosteron (Calbiochem) und β-Coprostanol (Matreya): Die folgenden Medien Zusätze wurden in gleicher Weise durchgeführt, .
Verdopplungszeiten wurden von lebenden Zellen unter Verwendung des Zelltiters Glo Reagens (Promega) als validiert und beschrieben [39] Quantifizieren während der logarithmischen Wachstumsphase bestimmt. Die Messung von Biomasse als CFU, wie zelluläre Protein oder als ATP haben alle konsistenten Ergebnisse. Ein Wert von 1 Attomol ATP pro Zelle [40] wurde für die Routinedurchgang übernommen. Mögliche Ungenauigkeit dieser Wert nicht grundlegend Interpretation der Daten zu beeinflussen.
Isogene Gendisruptionen durch Insertion eines Campylobacter coli
Widerstand Chloramphenicol erreicht wurden Element (cat
) gemäß der Strategie beschrieben von Chalker et al
[41]. Primer wurden sorgfältig entworfen, um Sequenz innerhalb offenen Leserahmen zu zielen, und sind in Tabelle 1 Fusions-PCR-Reaktionen unter Verwendung des PCR-Extender-System (5Prime) enthielt 2,3 nM jedes gelgereinigt schablonen 50 uM Primer, 1 × Puffer tuning aufgeführt, 1,25 mM zusätzliche Mg ++, jeweils 0,2 mM dNTP und 0,01 U /ul-Polymerase. Fusionszyklusbedingungen waren wie folgt: 94ºC 2,5 min, 10 Zyklen [94 ° C 15 sec, 45 ° C 60 sec, 68 ° C 60 sec pro kb], 25 Zyklen [94 ° C 15 sec, primerspezifische Tm 30 Sekunden, 68 ° C 60 sec pro kb] letzte Verlängerung 68 ° C 6-8 min. Fusionsprodukte wurden mit Pfx50 (Invitrogen) reamplifiziert Menge zu erhöhen, dann unter Verwendung des QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). Empfänger-Stämme wurden für 15 &mgr; g /ml mit 500 ng des endgültigen Amplikon mit natürlichen Transformation [42, 43], gefolgt von Auswahl 1 transformiert Tag auf CBA gewachsen Chloramphenicol 7-10 Tage auf CBA. Zu allelischen Austausch zu gewährleisten, wurden die resultierenden Stämme durch PCR der genomischen DNA unter Verwendung GoTaq (Promega) mit Primern, die in Tabelle 1. PCR-Strategie ausgewertet und die Ergebnisse sind in Abbildung 1 1.Table Primer-Sequenzen gezeigt.
Primer für allelische Störung TÜV
CAT FWD [41]
GATATAGATTGAAAAGTGGAT
F5b
CAT rev [41]
TTATCAGTGCGACAAACTGGG
cgtfwd
atggttattgttttagtcgtgga
cgtM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCatatggtggatatagcggtaatg
cgtM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAttaaaaacttgcaccctttatgt
cgtrev
ctctgatcgcttcttcataaact
pmifwd
atgaaaattaaaaatatcttactgagtggg
pmiM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCatctaaaccattagggctttcaatatac
pmiM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAActttagtgaacgaggtagaaacaaac
pmirev
ttttgtctgttaaaatcatcatcaat
lpxE fwd
atgaaaaaattcttatttaaacaaaaattttgtgaaagc
lpxEM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCcccaaacgctgatcgttgat
lpxEM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAcgagcgcccttatggag
lpxErev
ttaaggctttttggggcttgtaaa
eptAfwd
ttggcatcattattccatctgaggt
eptAM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCgcaacaccccaaaaacaacgata
eptAM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAagcctgattaacgcctatgaca
eptArev
ttactcttttttgtgtttaagcagatctaaagaa
zusätzliche Primer zur Bestätigung der Gen-Unterbrechung
G27_951fwd
agtgattcaagatggcgtgaaaa
F1
G27_953rev
ccaagctcaatcatttctttgtcttt
R1
G27_37fwd
cggcatggggatcaatcaag
F2
G27_39rev
ctcccgtcttgcccggtaac
R2
G2719fwd
gggcgataaaatcgtgtttca
F3
G2721rev
tcccctttatcgtttatgctaatga
R3
G2720fwd
cccaaactgagcgctaaca
F4
G2722rev
aagaaatttcaaggtataatagtttccaag
R4
eine jeweilige Gen Zahlen in öffentlichen Datenbanken für 26695 und G27 sind wie folgt: [cgt: hp0421, G27_952
], [pmi
(rfbM
): hp0043, G27_38
], [lpxE: hp0021, G27_20
], [EPTA:. hp0022, G27_21
]
Bright Spalte die kurze Primer Bezeichnungen in Abbildung verwendet Listen 1.
Abbildung 1 PCR-Überprüfung von Allel-Störungen in H. Stamm G27 pylori. Genomische DNA von Gen-gestört G27 Stämmen hergestellt wurde nach drei Passagen unter Chloramphenicol Auswahl, dann verstärkt PCR wie in jedem Schema gezeigt. Primer-Sequenzen sind in Tabelle 1 A. Disruption von cgt gegeben. Fünf Beispiele werden aus sieben einzelnen Klonen gezeigt, welche alle identische Ergebnisse in dem Bildschirm gegeben. B. Unterbrechung der pmi (rfbM). Die gesamte Chloramphenicol-resistenten Population wurde in jeder Runde der Selektion, ohne klonalen agiert. C. Störung der lpxE und EPTA. Die gesamte Chloramphenicol-resistenten Population wurde in jeder Runde der Selektion, ohne klonalen agierten.
Gastric Kolonisation
Tierversuche durch die LSUHSCS Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt. Weibliche Mongolische Rennmäuse wurden auf gewöhnliche Diät gehalten ad libitum
. Zu erhalten Motilität, H. pylori-Stamm SS1
wurde über Nacht unter mikroaeroben Bedingungen in T75-Kolben kultiviert, die 40 ml F12-Medium mit 0,4 mg /ml Albumin und 0 oder 50 ug /ml Cholesterin. Die motile Planktonbakterien wurden durch Zentrifugation pelletiert und in isotonischer Kochsalzlösung geerntet. Koloniebildenden Einheiten (CFU) wurden in dieser Inokula durch Reihenverdünnung und Ausplattieren auf CBA gemessen und diese Messungen bestätigt gleiche Dosierung von lebensfähigen Bakterien zwischen den beiden Wachstumsbedingungen. Etwa 10 8 KBE pro 30 ul wurden oral an Tiere gegeben (n = 6 bis 9 pro Gruppe). Die Tiere wurden 11 Tage später eingeschläfert, und Mägen wurden entfernt und seziert. H. pylori
in Magenantrum Homogenate wurden durch Reihenverdünnung und Ausplattieren auf CBA quantitativ das 5-Fluorcytosin (5 ug /ml), Vancomycin (10 ug /ml), Amphotericin B (5 &mgr; g /ml), Bacitracin ( 30 &mgr; g /ml), Polymyxin B (10 U /ml) und Trimethoprim (10 ug /ml) [44]. Duplizieren wurden für mehrere Verdünnungen jeder Gewebeprobe CFU Feststellungen.
Whole-cell ELISA
Standardverfahren [6, 7, 45], wurden für die Verwendung von Peroxidase-konjugierten sekundären Antikörpers geeignet. Alle Antikörper wurden von Calbiochem erhalten. Übernachtkulturen von Bakterien wurden für 10-15 min durch Zentrifugation bei 3500 × g
gesammelt, in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen und pelle bei 10.000 × g für 2 min
, dann in 15% Glycerin resuspendiert /0,9% NaCl. Die Zellsuspensionen wurden auf ihren Proteingehalt untersucht und bei -20 ° C gelagert. Zellproben bekannte Mengen an Protein enthielten, wurden in 50 mM Natriumbicarbonat /Carbonat pH rasch verdünnt 9.55 und sofort in die Vertiefungen einer ELISA-Platte (Costar΅7) verzichtet. Die Platten wurden versiegelt und über Nacht gekühlt, blockiert dann 90 min in 3% Rinderserumalbumin in Waschpuffer gelöst, das 7,4 /0,1 M NaCl /0,1% w /v Tween-20 von 0,1 M Natriumphosphat pH bestand. Primäre Antikörper, monoklonale Anti-Lewis X (Signet Klon P12) oder anti-Lewis Y (Signet clone F3), verdünnt 1: 500 in Waschpuffer /1% BSA, wurde 2 Stunden zugegeben, gefolgt von vier Änderungen Waschpuffer. Der sekundäre Antikörper wurde eine 1: 2500-Verdünnung von Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Ziege-anti-Maus-IgM in Waschpuffer /1% BSA wurde durch vier Änderungen Waschpuffer für 90 min, zugegeben. Das chromogene Substrat war 0,42 mM Tetramethylbenzidin und 0,02% H 2 O 2 in 50 mM Acetat /Citrat pH 5,5 [46]. Nach 15 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Reaktion mit 1/5 vol 2,5 N H 2 SO 4 und Farbwechsel wurde in einem Plattenlesegerät bei 450 nm gemessen gestoppt. Bei negativen Kontrollen entweder primären oder sekundären Antikörper oder mit E. coli-Stamm HB101
ersetzt für H. pylori
Weglassen, Farbwechsel war vernachlässigbar (A < 0,05). Niveaus von Lewis Y waren vernachlässigbar (A < 0,1) in Stamm 26695 oder 43504, wie Lewis X waren Ebenen in SS1
Elektrophoretische Analyse von Lipopolysacchariden
H. pylori
Kulturen gesammelt wurden, wie oben beschrieben, und gewaschen. Zellpellets wurden bei -70 ° C gelagert. Die Zellen wurden für 10 min in 60 mM Tris HCl pH 6,8, enthaltend 2% SDS bei 95-98 ° C lysiert. Der Proteingehalt wurde mit der Bicinchoninsäure (Pierce) gemessen. Proben von Zelllysaten auf gleichen Proteingehalt eingestellt wurden (1 mg /ml), dann in Reaktionen, enthaltend (endgültige) 60 mM Tris HCl pH 6,8, 0,67% SDS und 0,67 mg /ml Proteinase K bei 60 ° C für 2 Stunden proteolysiert [47]. Zur elektrophoretischen Artefakte beseitigen aufgrund der Gegenwart von Lipid /Detergens-Komplexen, proteolysiert Proben wurden mit heißem Phenol extrahiert [48]. Kontrollexperimente bestätigten, dass alle LPS-Bands durch die folgende Extraktionsverfahren gewonnen wurden qualitativ und ohne Vorurteile. Proteolysiert Proben wurden mit 1 Volumen 90% igen wässrigen Phenol gemischt und für 20 min bei 70 ° C inkubiert. Nach dem Abkühlen auf 10 ° C für 1 min wurden die Proben für 20 min bei 10 ° C, und die wässrige Phase gesammelt bei 12.000 × g zentrifugiert
. Die phenolischen Phasen wurden mit 1 Volumen H 2 O bei 70 ° C reextrahiert für 10 min, und die Zentrifugation wiederholt. Die vereinigten wäßrigen Extrakte wurden auf 0,5 M NaCl eingestellt und mit 10 Vol Ethanol im Kühlschrank über Nacht ausgefällt, dann bei 20.000 × g zentrifugiert
für 20 min bei 10 ° C und luftgetrocknet. Gereinigtes LPS-Proben wurden in Laemmli-Probenpuffer [49] bei 95 ° C für 5 Minuten gelöst. Die Proben wurden auf 15% Polyacrylamid /0,9% Bis Minigelen Harnstoffs mit dem Laemmli diskontinuierlichen Pufferformulierung [49] und einer 5% igen Sammelgel, die 3,2 M aufgetragen. Nach der Elektrophorese bei 150 V für 75 min wurden die Gele entweder über Nacht fixiert für die Silberfärbung [50] oder Membran Tris /Glycin Transferpuffer mit auf Polyvinylidendifluorid übertragen [51]. Blots wurden über Nacht in 3% Rinderserumalbumin und 0,03% NaN 3 in dem Waschpuffer oben für ELISA blockiert. Primären Antikörper (anti-Lewis X oder anti-Lewis Y, 1: 200) und sekundärer Antikörper (Peroxidase-konjugiertes Ziege-anti-Maus IgM, 1: 1000) wurden in Waschpuffer, enthaltend 0,5% BSA verdünnt. Kolorimetrischen Nachweis verwendet 3,3'-Diaminobenzidin mit Kobaltverstärkung [52]. Densitometrie wurde mit dem öffentlichen Bereich Anwendung Bild J ausgeführt, verfügbar unter http:.... //RSB info nih gov /ij
Ergebnisse
ist nur wenig bekannt über die physiologischen Rollen von Cholesterin in H
. pylori. Auf Antworten von H. pylori
auf Cholesterin zu untersuchen, nahmen wir einen definierten, serumfreien Kulturmedium, F12 mit 1 mg /ml Albumin, bei dem dieses Bakterium kann stabil passagiert werden [26]. Diese bescheidene Konzentration von Albumin steigert Wachstum [25, 26] und lindert die enge Einhaltung der Kulturflächen, die in proteinfreien Medien auftritt [53]. In diesem definiertem Medium, die Zugabe von 50 ug /ml Cholesterin verändern sich nicht signifikant die Wachstumsrate (Abbildung 2). Das Fehlen von Wachstumseffekte unter den gewählten Kulturbedingungen war vorteilhaft für die Untersuchung der physiologischen Bedeutung von Cholesterin in H. pylori
. So konnten wir Magen Kolonisierung gerbils durch den Stamm SS1 zu vergleichen, die in dem definierten Medium, das verschiedenen Mengen an Cholesterin (Figur 3) kultiviert worden waren. Elf Tage nach der oralen Impfung, H. pylori
in Magenantrum wurden selektiv plattiert und quantitativ bestimmt. Bemerkenswerterweise wurden gerbils kolonisiert nur von den Kulturen in cholesterinhaltigen Medium gezüchtet, aber nicht von H. pylori
cholesterinfreien Medium gezüchtet (In jedem Versuch P < 0,0001 für den Vergleich der log (CFU /g) zwischen den Gruppen unter Verwendung des Student t-Test)-two tailed. Daher war Cholesterin ein wesentlicher Bestandteil des Wachstumsmediums, um H. pylori Infektion
in diesem Tiermodell zu etablieren. Figur 2 Die Zugabe von Cholesterin zu dem definierten Medium beeinflusst nicht H. pylori Wachstumsrate. Parallelkulturen von jedem Stamm wurden über Nacht in F12 /Albumin (1 mg /ml) in Abwesenheit (offene Balken) oder Gegenwart (schraffierte Balken) von 50 ug /ml Cholesterin gewachsen. Die anfängliche Bevölkerungsdichte betrug 2 × 106 /ml. Verdopplungszeiten wurden aus der gemessenen Zunahme der Biomasse berechnet. Die angegebenen Werte stellen den Mittelwert ± SD von fünf oder mehr unabhängige Messungen. n
. s
. Student-two-tailed t-Test für paarweise Daten zeigten keine statistische Signifikanz.
3 H. ohne Cholesterin gewachsen Abbildung pylori nicht gerbils zu kolonisieren. H. pylori-Stamm SS1
wurde über Nacht in definiertem Medium gezüchtet, die 0 oder 50 ug /ml Cholesterin. Gerbils wurden oral mit 3,5 × 108 KBE (Versuch A) oder 1 × 108 KBE (Versuch B) beimpft. H. pylori
in Magenantrum wurden 11 Tage quantitativ bestimmt. Jeder vertikale Balken stellt den Mittelwert aus Doppelbestimmungen für ein Tier und horizontalen Linien geben den Median für jede Behandlungsgruppe. Wo wurden keine Kolonien gewonnen wurden Werte als 5 × 102 KBE /g Gewebe aufgenommen, die geschätzte Nachweisgrenze.
Bestimmte Stämme von H. pylori
zeigten signifikante Unterschiede in der Einhaltung der Kulturgefäße folgende Passage in Cholesterin, was darauf hindeutet, Veränderungen in ihrer Zelloberflächeneigenschaften (Hildebrandt & McGee, nicht veröffentlichte Beobachtungen). Aus diesem Grund haben wir beschlossen, Lipopolysaccharide, die bilden den Hauptbestandteil der Zellhülle zu untersuchen und dazu dienen, die biologisch wichtige Lewis-Antigene zu präsentieren. Wir verwendeten eine gut etablierte whole-cell ELISA-Verfahren die vorherrschenden Lewis-Antigene, Lewis X und Y (Figur 4) zu quantifizieren. In Übereinstimmung mit der Literatur [54, 55], in erster Linie wurde in Stamm 26695, detektiert Lewis X nur wurde Lewis Y in SS1 erfasst wird, und signifikante Mengen an beide wurden in G27 detektiert. In jedem Fall waren nichtlineare Absorptionswerte in Bezug Last abzutasten, ein Ereignis, das nicht ungewöhnlich, in ELISA-Assays [56] ist, und das von anderen Forschern unter Verwendung dieser gleichen Monoklonalen [7] festgestellt wurde. Somit wird, um Antigenspiegel in Proben von H. pylori zu vergleichen
kultiviert in Gegenwart oder Abwesenheit von Cholesterin, führten wir parallel Titrationen über einen Bereich von Probenbeladungen von 20 bis 500 ng Zellprotein pro Vertiefung variiert. Diese Titrationen reproduzierbar eine deutliche Zunahme der Menge an Lewis-X und /oder Lewis-Y-Antigen auf der Zelloberfläche nachgewiesen zeigte bei H. pylori
Stämme 26695, SS1 oder G27 wurden kultiviert in Gegenwart von Cholesterin (Abbildung 4). In replicate unabhängigen Experimenten waren die mittleren Cholesterinabhängige Erhöhungen statistisch signifikant (Tabelle 2). Vergleichbare Ergebnisse wurden auch für Lewis X in Stamm 43504 erhalten wurde (Daten nicht gezeigt). Spiking Proben mit Cholesterin am Ende der Wachstumsperiode war die Menge an Lewis-Antigen nicht verändern durch ELISA (5A) erfasst wird. In einem anderen Kontrollexperiment verifiziert wir für alle vier dieser Stämme, die die Menge der Zellproteins an die Vertiefungen gebunden durch Wachstum in Cholesterin (5B) nicht beeinflusst wurde. Die ELISA-Ergebnisse ist somit festgelegt, dass eine erhöhte Oberflächenexpression von Lewis-Antigene war eine legitime biologische Reaktion auf Cholesterin, die getestet in alle Stämme aufgetreten sind. Diese Antwort war spezifisch für Cholesterin, da die Substitution von Cholesterin in dem Wachstumsmedium mit den Strukturanaloga &bgr; -Sitosterol oder Natriumtaurocholat keine Wirkung auf Lewis X oder Y-Expression durch G27 hatte (4, rechte Tafeln, und Tabelle 3). Die Lewis-Antigen Reaktion auf Cholesterin blieb noch nach Unterbrechung des Gens für Cholesterin α-Glucosyltransferase (cgt
) in Stamm G27 (Tabelle 2, und siehe unten) und in 26.695 (Daten nicht gezeigt), Ausschluss der Beteiligung von α -glycoside Metaboliten von cholesterol.Table 2 Verbesserung der Zelloberfläche Lewis-Antigen-Expression durch das Wachstum der Kulturen in Gegenwart von cholesterol.a

fache Steigerung im Vergleich zu parallelen cholesterinfreie Kultur

Lewis X
Lewis Y

Mittelwert ± SEM (n)
P-Wert
Mittelwert ± SEM (n)
P-Wert
26695
4,32 ± 0,36 (6)
0,0002 Bei
nicht getan
SS1
nicht getan
1,88 ± 0,08 (5)
0,0004
G27 Wildtyp
2.85 ± 0,42 (8)
0,0033
2,22 ± 0,24 (8)
0,0016
G27 cgt :: cat
3,69 ± 0,34 (5)
0,0013
2,88 ± 0,30 (5)
0,0034
G27 lpxE :: cat
2,59 ± 0,50 (6)
0,025

2,47 ± 0,43 (7)
0,014
wurden in replicate whole-cell eine Lewis-Antigene ug ELISA quantifiziert gezüchtet /ml Cholesterin in Gegenwart oder Abwesenheit von 50 gepaarter Proben analysiert. Die Antigenlast betrug 300 ng zelluläre Protein pro Vertiefung. Kennzahlen für Plus: minus Cholesterin wurden von doppelten Nettoabsorptionswerte in jedem Test berechnet, und in fünf bis acht unabhängigen ELISA Läufe bestimmt Verhältnisse wurden dann gemittelt. P-Werte wurden in zweiseitigen Student t-Tests für die Nullhypothese berechnet, dass das Verhältnis gleich 1
Tabelle 3 Verbesserte Zelloberflächenexpression Lewis Antigen ist cholesterinspezifisch

• Die Nützlichkeit von Zytokeratine 7 und 20 (CK7 /20) Immunhistochemie in der Unterscheidung von kurz-Segment Barrett-Ösophagus von Magen-Darm-Metaplasie: Ist es zuverlässig
• Die Zugabe eines pH-sensitiven Gels verbessert die Stabilität Mikroemulsion für die gezielte Entfernung von Kolon ammonia