Helicobacter pylori modifikácie lipopolysacharid, výraz Lewis antigén, a žalúdočné kolonizácie sú závislé na cholesterol

Helicobacter pylori
lipopolysacharid modifikácie, výrazom Lewis antigén, a žalúdočné kolonizácie sú cholesterol závislé
abstraktné
pozadia
Helicobacter pylori
konkrétne zaberá cholesterol a začleňuje ju do bakteriálnej membrány, ale málo je v súčasnej dobe známe o fyziologických úlohách cholesterol je. Porovnávali sme fenotypmi a in vivo
schopnosť kolonizácie H. pylori
pestované v definovanom rastové médium bez séra, F12 s 1 mg /ml albumínu, obsahujúci 0 až 50 ug /ml cholesterolu. Výsledky

Kým zdvojnásobí časy boli do značnej miery ovplyvnené cholesterolu, boli pozorované iné zrejmé fenotypické zmeny. H. pylori
kmeň SS1 pestované v definovanom médiu s cholesterolom úspešne kolonizoval žalúdok pieskomilov, zatiaľ čo SS1 pestované bez cholesterolu nepodarilo kolonizovať. H. pylori
lipopolysacharid často zobrazuje Lewis X a /alebo Y antigény. Expresie týchto antigénov meraných celobunkovej ELISA bola výrazne zvýšená v reakcii na rast kmeňa SS1, 26695, alebo G27 v cholesterolu. Okrem toho, elektroforetické analýza lipopolysacharid v divokého typu G27 a v mutantov chýba O-reťaze odhalila štrukturálne zmeny v rámci skupín oligosacharid jadro /lipid A. Tieto reakcie v úrovni Lewis antigénu a lipopolysacharid profily na dostupnosti cholesterolu boli veľmi špecifické, pretože k žiadnym zmenám došlo, keď bola hladina cholesterolu nahradený beta-sitosterolu alebo žlčových solí. Narušenie génov kódujúcich cholesterolu a-glukosyltransferasa alebo lipidu A fosfoethanolamin transferázu nemal žiadny vplyv na expresiu Lewis, ani na lipopolysacharid profilov, ani na reakcie cholesterolu z týchto vlastností. Narušenie lipidu A génu 1-fosfatáza eliminuje vplyv cholesterolu na lipopolysacharid profilov, ale jeho účinok na expresiu Lewis.
Závery
Dokopy tieto výsledky naznačujú, že vyčerpanie cholesterol vedie k aberantne formy LPS, ktoré sú závislé na defosforylácii z lipidu A v 1-polohe. Predbežná model pre pozorované účinky cholesterolu je popísaná v ktorom postupné kroky lipopolysacharid biogeneze a, nezávisle na sebe, prezentácie antigénu Lewis na povrchu bunky, závisí od zloženia membrány. Tieto nové poznatky ukazujú, že dostupnosť cholesterol umožňuje H. pylori
zmeniť svoj bunkovú obálku spôsoby, ktoré môžu mať vplyv kolonizáciu hostiteľskej tkaniva in vivo
.
Pozadie
Helicobacter pylori
je veľmi výklenok -adapted patogén, ktorý obýva ľudský žalúdok, je prenášaný predovšetkým v rodinách, a má žiadna známa nádrž na životné prostredie. Chronickej infekcie môže byť bez príznakov alebo môžu spôsobiť zápal žalúdka, vred, alebo karcinómu žalúdka. Ak chcete vytvoriť infekcia, baktérie musia prežiť tranzit cez kyslé žalúdočné priestore [1]. Preniká a zavádza pobytu v ochrannej vrstvy hlienu, je lipidy a cholesterol-bohaté prostredie [2, 3]. V rámci tohto výklenku baktérie zamestnáva celý rad mechanizmov, ktoré obchádzajú imunitnú odpoveď hostiteľa.
Lipopolysacharid (LPS) na povrchu H. pylori
sú upravené tak, aby vykazovať určité antigénov ľudských krvných skupín, a to predovšetkým Lewis antigény X a Y [ ,,,0],4-7], a menej často H typ 1, i-antigén, krvná skupina a, alebo Lewisovej antigény a alebo B [8-10]. Tieto povrchové antigény LPS sú nevyhnutné pre stanovenie infekcie, pretože mutantný kmene defektných pre syntézu LPS O-antigénu, alebo k expresii Lewis X /Y zlyhanie kolonizovať myšou [11-13]. Je dokázané, že Lewis antigény exprimované na povrchu baktérií prispieva k adherenciu H. pylori
žalúdočné epiteliálne bunky [10, 14], a hrajú úlohu v tkanivovom tropizme [15-17]. Žalúdočné epiteliálne bunky tiež exprimujú Lewisovej antigény [18, 19], čo naznačuje, že zobrazenie Lewis antigénov na bakteriálnym povrchu, môže slúžiť ako stratégia mimikry. Štúdia klinických izolátov [18, 20] a experimentálnych infekcií u zvierat [21] podporujú túto úlohu pre bakteriálne Lewis antigény imunitného únikov. V ľudskej infekcie H. pylori sa
Lewisovej antigény boli spojené s závažnosti peptického vredu a duodenitída [16, 22]. Ďalším dôležitým rysom H. pylori
LPS je jeho modifikovaná lipid A štruktúra, so zníženou Acylácia a menej nabitými skupinami ako je typické pre enterobaktérie [23]. Tieto modifikácie lipid A minimalizovať endotoxínový a protizápalové vlastnosti H. pylori
LPS (prehľad v [24]).
Cholesterol je neesenciálna živiny pre H. pylori
, aj keď to podporuje rast v médiu bez séra [ ,,,0],25, 26]. H. pylori
konkrétne začleniť cholesterolu do bakteriálnej membrány [27], rovnako ako obmedzený počet patogénnych alebo symbiotických baktérií, vrátane Proteus mirabilis, Lactobacillus acidophilus
, Borrelia sp.
A Mycoplasma
[ ,,,0],28-30]. Cholesterol môže posilniť membrány v týchto organizmov [30-32]. H. pylori
tiež jednoznačne tvorí cholesterolu a-glykozid [33, 34], a tento metabolit môže byť ďalej modifikovaný Acylácia alebo phosphatidylation [34]. Alfa-cholesterol glucosylated subverts hostiteľa imunitnú odpoveď na baktérie v myšiam modeli, a to prostredníctvom potlačenie fagocytózy a aktivácia T-buniek [35]. Ostatné úlohy pre cholesterolu a jeho metabolitov v bakteriálnej membráne musí byť ešte preskúmané. V tejto správe ukazujú, že biosyntéza lipopolysacharid, vrátane antigénu Lewis expresie a LPS jadro /lipidovej modifikácie A, sú zmenené dostupnosťou cholesterolu v rastovom médiu. Uvádzame údaje naznačujú, že tieto zmeny v obálke buniek môže významne ovplyvniť patogén /hostiteľskej interakcie na zvieracom modeli infekcie.
Metódy
bakteriálnych kmeňov a rastové podmienky
kmeňov H pylori
zahŕňali laboratórne kmeň ATCC43504 (pôvod: Austrália), 26695 (UK), klinický izolát G27 (Taliansko [36], za predpokladu, N. Salama), a myší kmeň upravený SS1 (Austrália, za predpokladu, Adrian Lee [37]). Baktérie boli udržiavané pri teplote 37 ° C v mikroaerobní atmosfére 5% O 2/10% CO 2 na agare Campylobacter krvi (CBA). Baktérie boli pasážovania každé 2 až 3 dni a najdlhšie 25 dní, aby sa minimalizovalo genetický drift. Pre rast v chemicky definovanom médiu, [26], baktérie sa naočkujú z CBA vo fľašiach pre tkanivové kultúry obsahujúcim HAM F12 (Gibco) s 1 mg /ml hovädzieho sérového albumínu (bez mastných kyselín, Sigma A7906), uvedených v priebehu, ako je definovaný médiá. Tekuté kultúry boli pasážovania denne zriedením do čerstvého média v počiatočnej hustote 1-2 x 10 6 /ml, a použité v pasáži 3 až 5. bunkovej kultúre stupeň cholesterolu (viac ako 99%, Sigma) bol pridaný k F12 ako stabilný 10 x emulzií obsahujúci 500 ug /ml cholesterolu dispergovaný v 10 mg /ml albumínu, ktorý bol pripravený v súlade s [38]. Tieto prídavky médiá boli vykonané rovnakým spôsobom: beta-sitosterol (syntetický, 95%), taurocholát sodný, glykocholát sodný, p-estradiol, progesterón (všetko od Sigma), dehydroepiandrosterón (Calbiochem), a p-coprostanol (Matreya) .
zdvojnásobenie doby boli stanovené počas rastu log fáze by kvantitatívnom životaschopné bunky pomocou Cell Titer Glo činidlo (Promega) za overené a opísané [39]. Meranie biomasy ako CFU, ako bunkového proteínu, alebo ako ATP boli všetky vyrobené konzistentné výsledky. Hodnota 1 attomol ATP na bunku [40] sa predpokladalo pre rutinné priechodu. Možné nepresnosti tejto hodnoty nie je zásadne ovplyvniť interpretáciu dát.
Izogenních prerušenie génu bola dosiahnutá vložením Campylobacter coli
rezistencie voči chloramfenikolu element (cat
) podľa postupu, ktorý opísal Chalker et al
[41]. Primery boli starostlivo navrhnuté tak, aby sa cieľové sekvenciu v otvorených čítacích rámcov, a sú uvedené v tabuľke 1. Fusion PCR reakciou s použitím PCR System (Extender 5PRIME) obsahovala 2,3 nM každú šablónu čistený na géle, 50 uM priméru, 1 x pufer tuning, 1,25 mM ďalšie Mg ++, 0,2 mM každého dNTP, a 0,01 U /ul polymerázy. Podmienky fúzie cyklu boli nasledujúce: 94 ° C 2,5 min, 10 cyklov [94 ° C 15 sekúnd, 45 ° C 60 sekúnd, 68 ° C 60 s na kb], 25 cyklov [94 ° C 15 s, primer špecifický Tm 30 sec, 68 ° C 60 sekúnd za kB], záverečná extenzia 68 ° C 6-8 min. Fúzny produkty boli znovu amplifikovanej s Pfx50 (Invitrogen) pre zvýšenie množstva, potom sa čistí pomocou Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen). Kmene príjemcov pestuje jeden deň na CBA boli transformované s 500 ng výsledného amplikónu s použitím prírodných transformácie [42, 43] nasledované selekciou po dobu 7-10 dní na analýze nákladov a prínosov, ktoré obsahujú 15 ug /ml chloramfenikolu. Aby sa zabezpečilo, alelickou výmenu, výsledné kmene boli hodnotené pomocou PCR z genómovej DNA za použitia GoTaq (Promega) s primermi uvedenými v tabuľke 1. PCR stratégie a výsledky sú uvedené na obrázku 1 1.Table sekvencie primérov.
priméry pre narušenie alelické ABC Slovenského mačka FWD [41]
GATATAGATTGAAAAGTGGAT
F5B
CAT rev [41]
TTATCAGTGCGACAAACTGGG
cgtfwd
atggttattgttttagtcgtgga
cgtM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCatatggtggatatagcggtaatg
cgtM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAttaaaaacttgcaccctttatgt
cgtrev
ctctgatcgcttcttcataaact
pmifwd
atgaaaattaaaaatatcttactgagtggg
pmiM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCatctaaaccattagggctttcaatatac
pmiM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAActttagtgaacgaggtagaaacaaac
pmirev
ttttgtctgttaaaatcatcatcaat
lpxE FWD
atgaaaaaattcttatttaaacaaaaattttgtgaaagc
lpxEM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCcccaaacgctgatcgttgat
lpxEM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAcgagcgcccttatggag
lpxErev
ttaaggctttttggggcttgtaaa
eptAfwd
ttggcatcattattccatctgaggt
eptAM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCgcaacaccccaaaaacaacgata
eptAM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAagcctgattaacgcctatgaca
eptArev
ttactcttttttgtgtttaagcagatctaaagaa
ďalšie priméry na potvrdenie prerušenia génu
G27_951fwd
agtgattcaagatggcgtgaaaa
F1
G27_953rev
ccaagctcaatcatttctttgtcttt
R1
G27_37fwd
cggcatggggatcaatcaag
F2
G27_39rev
ctcccgtcttgcccggtaac
R2
G2719fwd
gggcgataaaatcgtgtttca
F3
G2721rev
tcccctttatcgtttatgctaatga
R3
G2720fwd
cccaaactgagcgctaaca
F4
G2722rev
aagaaatttcaaggtataatagtttccaag
R4
aRespective čísla génové vo verejných databázach 26695 a G27 sú nasledovné: [CGT: hp0421, G27_952
], [PMI
(rfbM
): hp0043, G27_38
], [lpxE: hp0021, G27_20
], [EPTA :. hp0022, G27_21
]
bRighthand stĺpci sú uvedené krátke primeru označení používaných na obrázku 1. Obrázok 1
PCR overenie alelických narušenie H. pylori kmeňa G27. Genómovej DNA bola pripravená z génovo narušená G27 kmeňov týchto troch pasáží pod selekčným chloramfenikolu, potom amplifikovaná PCR, ako je uvedené v každom schéme. Primery sekvencie sú uvedené v tabuľke 1. A. narušenie CGT. Päť príklady sú uvedené z siedmich jednotlivých klonov, z ktorých každý dal zhodné výsledky na obrazovke. B. Narušenie PMI (rfbM). Celá chloramfenikol rezistentné populácie bol pasážovaný v každom kole výberu, bez toho aby klonálnej selekcie. C. Narušenie lpxE a EPTA. Celá chloramfenikol rezistentné populácia bola pasážovania v každom kole výberu, bez klonálnej selekcie.
Žalúdočné kolonizáciu
Pokusy na zvieratách boli schválené starostlivosť o zvieratá a ich používaní výboru LSUHSCS Institutional. Dámske mongolskej pískomily boli udržiavané na bežnú diétu ad libitum
. Pre zachovanie motility, H. pylori kmeňa
SS1 bol kultivovaný cez noc za podmienok v mikroaerobní T75 bankách obsahujúcich 40 mililitrům médiu F12 s 0,4 mg /ml albumínu a 0 alebo 50 ug /ml cholesterolu. Tieto pohyblivé planktónu baktérie boli zozbierané centrifugáciou a resuspendované v izotonickom roztoku chloridu sodného. jednotiek tvoriacich kolónie (CFU) boli merané v týchto inokula zo sériového riedenia a pokovovanie na CBA, a tieto merania potvrdila rovné dávku živých baktérií medzi dvoma rastových podmienok. Približne 10 8 CFU na 30 ul boli podávané orálne zvieratám (n = 6-9 na skupinu). Zvieratá boli zabité 11 dní neskôr, a žalúdky boli odstránené a členitý. H. pylori
prítomná v žalúdočnej dutine Homogenát boli kvantifikované pomocou sériového riedenia a nanesenie na CBA, ktorý obsahuje 5-fluorcytosin (5 ug /ml), vankomycínom (10 ug /ml), amfotericín B (5 ug /ml), bacitracín ( 30 ug /ml), polymyxín B (10 U /ml) a trimetoprim (10 ug /ml) [44]. Duplicitné CFU rozhodnutia bola vykonaná pre viac riedenie každej vzorky tkaniva.
Celobunková ELISA
štandardnými postupmi [6, 7, 45], boli upravené pre použitie s peroxidázou konjugované sekundárnej protilátky. Všetky protilátky boli získané od firmy Calbiochem. Cez noc kultivované kultúry baktérií boli odobraté centrifugáciou pri 3500 x g
10-15 minút, premyté v Dulbeccova fosfátom pufrovanom soľnom roztoku, a repelleted pri 10000 x g počas 2 minút
, potom resuspendované v 15% glycerolu /0,9% NaCl. Bunkové suspenzie boli testované na obsah proteínu a uloží sa pri teplote -20 ° C. Vzorky buniek, ktoré obsahujú známe množstvo bielkovín sa rýchlo zriedi 50 mM hydrogenuhličitanu sodného /uhličitanu pH 9,55 a okamžite sa rozdelí do jamiek ELISA doštičky (Costar΅7). Doštičky boli uzavreté a v chladničke cez noc a potom blokované po dobu 90 minút v 3% bovinného sérového albumínu rozpusteného vo premývacím pufrom, ktorý sa skladal z 0,1 M fosforečnanu sodného s pH 7,4 /0,1 M NaCl /0,1% m /v Tween-20. Primárne protilátka, monoklonálna anti-Lewis X (Signet klon P12), alebo anti-Lewis Y (Signet klon F3), zriedený 1: 500 v premývacom pufri /1% BSA, pridá sa počas 2 hodín, nasledované štyrmi zmenami premývacím pufrom. Sekundárne protilátka, 1: 2500 zriedenie chrenovou peroxidázou konjugovaná kozia anti-myší IgM v premývacom pufri /1% BSA, pridané po dobu 90 minút, nasledovaný štyrmi zmenami premývacím pufrom. Chromogénneho substrátu bola 0,42 mM tetrametylbenzidín a 0,02% H 2O 2 v 50 mM acetátu /citrát pH 5,5 [46]. Po 15 minútach pri teplote miestnosti, reakcia bola zastavená pomocou 1 /5. objemových 2,5 N H 2SO 4, a zmena farby bola meraná na čítačke doštičiek pri 450 nm. V negatívnej kontroly ignoruje duplikující buď primárny alebo sekundárny protilátkou, alebo s E. coli kmeňa HB101
nahradí H. pylori
, zmena farby bola zanedbateľná (A < 0,05). Hladiny Lewis Y boli zanedbateľné (A < 0,1) v kmeni 26695 alebo 43504, rovnako ako hladina Lewis X v SS1
Elektroforetická analýza lipopolysacharid
H. pylori
kultúry boli odobraté, ako je popísané vyššie, a premyje sa. bunkové pelety boli skladované pri -70 ° C. Bunky boli lyžovanie v 60 mM Tris HCl o pH 6,8 s obsahom 2% SDS pri 95-98 ° C počas 10 minút. Obsah proteínu sa meria pomocou testu bicinchoninic kyseliny (Pierce). Vzorky bunkového lyzátu boli upravené na rovnaký obsah proteínu (1 mg /ml), potom sa proteolyzed v reakciách obsahujúcich (finálna) 60 mM Tris HCI pH 6,8, 0,67% SDS a 0,67 mg /ml proteinázy K pri 60 ° C počas 2 hodín, [47]. Eliminovať elektroforetické artefaktov v dôsledku prítomnosti lipid /detergentných komplexov, proteolyzed vzorky extrahuje horúcim fenolom [48]. Kontrolné pokusy overené, že všetky LPS pásy boli získané pomocou nasledujúceho postupu ťažby kvalitatívne a bez zaujatosti. Proteolyzed vzorky boli zmiešané s 1 objemom 90% vodného roztoku fenolu a inkubuje sa pri teplote 70 ° C počas 20 minút. Po ochladení na 10 ° C po dobu 1 minúty, boli vzorky odstredené pri 12000 x g
20 min pri 10 ° C, a vodná fáza sa oddelí. Fenolové fáza sa znova extrahuje 1 objemom H 2O pri teplote 70 ° C počas 10 minút a centrifugácia opakuje. Spojené vodné extrakty sa upravia na 0,5 M NaCl a vyzráža sa s 10 objemovými etanolom v chladničke cez noc, potom sa centrifúguje pri 20,000 x g po
dobu 20 minút pri 10 ° C a suší sa na vzduchu. Vyčistené LPS vzorky sa znovu rozpustí v Laemmliho vzorkovej pufri [49] pri 95 ° C po dobu 5 min. Vzorky boli nanesené na 15% polyakrylamidovom /0,9% bis minigels obsahujúci 3,2 M močoviny s prerušovaným Laemmli pufor [49], a 5% stohovaním gélu. Po elektroforéze pri 150 V po dobu 75 minút, gély buď pevné cez noc za farbenie striebrom [50], alebo prevedené na membránu s použitím transferových polyvinylidenedifluoride Tris /glycín pufer [51]. Bloty boli blokované cez noc v 3% bovinný sérový albumín a 0,03% NaN 3 v premývacom pufri popísaným vyššie pre ELISA. Primárne protilátkou (anti-Lewis X alebo anti-Lewis Y, 1: 200) a sekundárnou protilátkou (s peroxidáze konjugovaná kozia anti-myší IgM, 1: 1000) sa zriedi v premývacom pufri s obsahom 0,5% BSA. Kolorimetrická detekcia používa 3,3'-Diaminobenzidine so zlepšovaním kobaltu [52]. Denzitometria bola vykonaná s public domain obrázok aplikácie J, k dispozícii na adrese http: .... //RSB info NIH gov /jk
Výsledky
Málo je známe o fyziologických rolách cholesterolu v H . pylori
. Vyšetrovať odozvy H. pylori
cholesterolu, sme prijali definovaný, bezsérové ​​kultivačné médium, F12 s 1 mg /ml albumínu, v ktorom táto baktéria môže byť stabilne pasážovania [26]. Tento skromný koncentrácia albumínu zvyšuje rast [25, 26] a zmierňuje tesné priľnutie ku kultúre plochy, ktoré sa vyskytuje v proteínových bez média [53]. V tomto definovanom médiu, pridanie 50 ug /ml cholesterolu nijako významne meniť rýchlosť rastu (viď obrázok 2). Absencia účinkov rastových za zvolených podmienok kultivácie bolo výhodné pre skúmanie fyziologický význam cholesterolu v H. pylori
. Preto sme boli schopní porovnať žalúdočné kolonizáciu pieskomilov kmeňom SS1, ktoré boli kultivované v definovanom médiu, ktoré obsahuje rôzne množstvo cholesterolu (Obrázok 3). Jedenásť dní po orálnom očkovaní, H. pylori
v žalúdočnej dutine boli selektívne umiestnené a kvantifikované. Pozoruhodné je, pieskomily boli kolonizované iba kultúr pestovaných v médiu obsahujúcich cholesterol, ale nie H. pylori
pestované v médiu bez cholesterolu (V každom experimente, P < 0,0001 pre porovnanie log (CFU /g) medzi skupinami s použitím Student dvojstranný t-test). Preto, cholesterol bol podstatným prvkom rastového média, aby sa vytvoril H. pylori infekcie
v tomto zvieracom modeli. Obrázok 2 Prídavok cholesterolu v definovanom médiu, nemá vplyv na rýchlosť rastu H. pylori. Paralelné kultúry každého kmeňa boli pestované cez noc v F12 /albumín (1 mg /ml) v neprítomnosti (otvorené bary) alebo prítomnosti (tieňované stĺpce) 50 ug /ml cholesterolu. Počiatočná Hustota obyvateľstva bola 2 x 106 /ml. Zdvojnásobenie doby boli vypočítané z nameranej zvýšenie biomasy. Hodnoty zobrazené predstavujú priemer ± SD piatich alebo viacerých nezávislých meraní. n
. s
. Študentský dvojchvostý t-test pre párové údaje neukázali žiadny štatisticky významný.
Obrázok 3 H. pylori sa pestujú bez cholesterolu nepodarí kolonizovať pieskomilov. H. pylori
kmeň SS1 bol pestovaný cez noc v definovanom médiu obsahujúcom 0, alebo 50 ug /ml cholesterolu. Pieskomily sa orálne naočkujú 3,5 x 108 CFU (experiment A) alebo 1 x 108 CFU (pokus B). H. pylori
v žalúdočnej dutine boli kvantifikované na 11 dní. Každý vertikálny stĺpec predstavuje priemer dvoch stanovení pre jedno zviera, a vodorovné čiary dať mediánu pre každú liečenú skupinu. Tam, kde boli získané žiadne kolónie, hodnoty boli zaznamenané ako 5 × 102 CFU /g tkaniva, odhadované medzí detekcie.
Niektoré kmene H. pylori
vykazovali značné rozdiely v dodržiavaní kultivačných nádob nasledujúce pasáži cholesterolu, čo naznačuje, zmeny v ich bunkových povrchových vlastností (Hildebrandt & McGee, nepublikované pozorovanie). Z tohto dôvodu sme sa rozhodli skúmať lipopolysacharidu, ktoré tvoria hlavnú zložku bunkového obalu, a slúži na prezentáciu biologicky dôležitých Lewisovej antigény. činné sme dobre zavedené celobunkovej postup ELISA pre kvantifikáciu prevládajúce Lewisovej antigény, Lewis X a Y (obrázok 4). V súlade s literatúrou [54, 55], a to predovšetkým Lewis X bola detekovaná v kmeni 26695, iba Lewis Y bola zistená v SS1, a boli zistené významné úrovne a to ako v G27. V každom prípade, absorbancia boli nelineárne vzhľadom na odber vzorky zaťaženia, čo je udalosť, ktorá nie je nezvyčajné v testoch ELISA [56], a ktoré bolo uvedené inými výskumníkmi za použitia tých istých monoklonálne protilátky [7]. Tak, aby bolo možné porovnať antigén hladiny vo vzorkách H. pylori
kultivované v neprítomnosti alebo v prítomnosti cholesterolu, sme vykonali paralelný titrácie v rozmedzí vzoriek zaťaženia v rozmedzí od 20 do 500 ng bunkového proteínu na jamku. Tieto titrácie reprodukovateľne vykazovali výrazný nárast množstva Lewis X a /alebo antigén Lewis Y zistené na povrchu buniek, keď H. pylori kmeňov
26695, SS1 alebo G27 boli kultivované v prítomnosti cholesterolu (Obrázok 4). V opakovaných nezávislých pokusov, priemerné zvýšenie cholesterolu v závislosti na boli štatisticky významné (tabuľka 2). Porovnateľné výsledky boli tiež získané pre Lewis X v kmeň 43504 (dáta nie sú uvedené). Stúpli vzorky s cholesterolu na konci obdobia rastu nemení množstvo Lewis antigénu detegované pomocou ELISA (obrázok 5A). V ďalšom kontrolnom experimente overiť pre všetky štyri z týchto kmeňov, že množstvo bunkového proteínu viaže na jamiek bol ovplyvnený rastom cholesterolu (Obrázok 5B). ELISA výsledky tak zistené, že zväčšená povrchová expresia antigénov Lewis bol legitímne biologické reakcie na cholesterol, ku ktorému došlo vo všetkých testovaných kmeňov. Táto odpoveď je špecifická pre cholesterol, pretože substitúcia cholesterolu v rastovom médiu so štrukturálnymi analógmi beta-sitosterolu alebo sodný taurocholátu nemal žiadny účinok na Lewis X alebo Y expresie pomocou G27 (obrázok 4, pravom paneli, a tabuľka 3). Odozva Lewis antigén cholesterolu ešte zostal po prerušení génu pre cholesterol a-glukosyltransferasa (CGT) v
kmeňa G27 (tabuľka 2, a pozri nižšie) a 26695 (dáta nie sú uvedené), vylučuje účasť alfa -glycoside metabolity cholesterol.Table 2 Posilnenie bunkovom povrchu antigény Lewis rastom kultúr v prítomnosti cholesterol.a

-násobne zvýšenie v porovnaní s paralelným bez cholesterolu kultúry

Lewis X
Lewis Y

priemer ± SEM (n)
hodnota P
priemer ± SEM (n)
hodnota P
26695
4,32 ± 0,36 (6)
0,0002
neurobil
SS1
neurobil
1,88 ± 0,08 (5)
0,0004
G27 divokého typu
2.85 ± 0,42 (8)
0,0033
2,22 ± 0,24 (8)
0,0016
G27 CGT :: cat
3,69 ± 0,34 (5)
0,0013
2,88 ± 0,30 (5)
0,0034
G27 lpxE :: cat
2,59 ± 0,50 (6)
0,025

2,47 ± 0,43 (7)
0,014 stroje a Lewisovej antigény boli kvantifikované v opakovaných celobunkovej ELISA analýzy párových vzoriek pestovaných v prítomnosti alebo neprítomnosti 50 ug /ml cholesterolu. Záťaž antigén 300 ng bunkový proteín na jamku. Pomery navyše: mínus cholesterolu boli vypočítané z duplicitných čistých absorbancií v každom teste a pomery stanovené v piatich až ôsmich nezávislých behov ELISA potom boli spriemerované. Hodnoty P boli vypočítané na bilaterálny Student t-testy pre nulovú hypotézu, že pomer sa rovná 1.
Tabuľka 3 Zvýšená na bunkovom povrchu antigény Lewis je cholesterol špecifické

násobné zvýšenie v porovnaní s paralelným bez cholesterolu kultúry

Lewis X
Lewis Y


priemer ± SEM (n)
P hodnotu
priemer ± SEM (n)
hodnota P

cholesterol
2,96 ± 0,22 (5)
.0008
2,48 ± 0,10 (4)
.0007
β- sitosterol
1,80 ± 0,47 (4)
0,19
1,19 ± 0,13 (3)
0,28
taurocholát
0,64 ± 0,16 (4)
0,12
0,84 ± 0,20 (3)
0,52
Lewisovej antigény boli kvantifikované v replikou celobunkovej ELISA analýzy párových kultúr baktérie H. pylori
G27 pestovaných v prítomnosti alebo neprítomnosti 130 uM cholesterolu, alebo či nie je rovné koncentrácie beta-sitosterolu alebo taurocholátu sodného. Záťaž antigén 300 ng bunkový proteín na jamku. Pomery navyše: mínus cholesterolu boli vypočítané z duplicitných čistých absorbancií v každom teste a pomery stanovené v troch až piatich nezávislých behov ELISA potom boli spriemerované. Hodnoty P boli vypočítané na bilaterálny Student t-testy pre nulovú hypotézu, že pomer rovná 1.
Obrázok 4 Rast cholesterolu špecificky posilňuje bunkovú povrchovú zobrazenie Lewis antigénov. Celé bunkové testy ELISA boli vykonávané na vzorkách H. pylori
kmeň 26695 (vľavo hore), SS1 (vľavo dole), alebo G27 (horná a vpravo dole). Paralelné kultúry boli pestované cez noc v definovanom médiu obsahujúcom 130 um týmito doplnkami: kruhy, žiadny prídavok; štvorce, cholesterol; trojuholníky, β-sitosterol; X, taurocholát. Rôzne množstvá bunkovej suspenzie, ktoré zodpovedajú známym množstvom bunkového proteínu boli aplikované do dvoch jamiek doštičky ELISA a immunoassayed za prítomnosti Lewis X alebo antigén Lewis Y, ako je popísané v metódach
. Negatívne kontrolné vzorky E. coli HB101
, alebo vyrovnávacia pamäť len na polotovarov, spadol na bodkovaný čiaru. Absorbancia na jednotlivých jamiek sú vynesené. Opakované pokusy s tromi alebo viacerými nezávisle pestované kultúry priniesli v zásade zhodné výsledky.
Obrázok 5 kontrolných experimentoch ELISA. A. Prídavok s cholesterolom na konci obdobia rastu nemení expresie antigénu Lewis. Kultúry baktérií H. pylori
boli pestované cez noc v definovanom médiu bez (kontrola) alebo s 50 ug /ml cholesterolu (cholesterol pestované). Tretia nádoba (cholesterol špicatý) sa nechá rásť v neprítomnosti cholesterolu, chladené na ľade a pridá sa ekvivalentné množstvo cholesterolu, než boli bunky zozbierané. Lewisovej antigény boli kvantifikované v duplikátu od celých buniek ELISA, načítanie 300 ng proteínu bunkového na jamku. Pomery navyše: mínus cholesterolu boli vypočítané z priemerných čistých absorbancií v každom teste, a zápletka displeja znamenajú pomery ± SEM pre tri až päť nezávislý ELISA beží. Hodnoty P boli vypočítané na bilaterálny Student t-testy pre nulovú hypotézu, že pomer rovný 1. Pri porovnávaní značené ns, P > 0,05. B. Ekvivalentné väzba buniek, ktoré sa doštičky ELISA. Vzorky H. pylori
, ktoré boli pestované v paralelných kultúrach v neprítomnosti (biele stĺpce) alebo v prítomnosti 50 ug /ml cholesterolu (šedé stĺpce) boli aplikované na multijamkové doštičke rovnakým spôsobom, ako pri Lewis antigén ELISA, pridanie 500 ng bunkového proteínu na jamku. Nasledujúce cez noc upevnenie, jamky boli premyté dvakrát Dulbeccovým fyziologickým roztokom pufrovaným fosforečnanom, potom proteín v adherentních buniek bola kvantifikovaná za použitia BCA činidla. sú uvedené priemerné hodnoty ± SD zo štyroch jamiek.
detekcie Lewis X a Y imunoblotováním s rovnakými monoklonálnych protilátok produkovaných iný výsledok (obrázok 6). V niekoľkých pokusoch za použitia tejto techniky, sme nezistili žiadne rozdiely cholesterolu závislé na hladiny Lewis X alebo Y, na rozdiel od malé zvýšenie Lewis X v 43504, ktorá bola len o málo významné. Postup blotting použité LPS vzoriek získaných z bunkových lyzátov, a v zásade by mal detekovať celý bunkový antigén Lewis bazén, zatiaľ čo metóda celých buniek ELISA je určený pre detekciu iba to, že uvedené na extracelulárnom povrchu. Zaujímavé Rozdiel vo výsledkoch medzi naším ELISA analýzy a imunoblotu naznačuje zmenu bunkovej úseky na Lewis antigénu v závislosti od dostupnosti cholesterolu v rastovom médiu. Obrázok 6 Lewis X a Y antigén profilovanie imuno-blottingom. Vzorky LPS izolované z paralelných kultúr pestovaných v neprítomnosti (-) alebo prítomnosti (+) 50 ug /ml cholesterolu boli rozdelené na 15% močoviny gély. Množstvo naložené na dráhu, ako ug lyzátu pôvodného proteínu, sú uvedené v hornej časti každej dráhy. Po prevode, antigény boli immunodetected s monoklonálnymi protilátkami špecifickými pre Lewis X (horný panel), alebo Lewis Y (dolný panel). je zobrazený Reprezentatívny príklad každého z nich. Bočné pásy obsahujú prestained proteínové markery (M) alebo 400 ng E. coli
O111: B4 LPS. objavil antigénne signál iba v regiónoch O-reťazca kmeňov týchto H. pylori
; prázdne priestory boli odstrihnutý spôsobom. Tieto imunoblotu boli nezávisle replikované s niekoľkými súborov vzoriek a denzitometria bola použitá pre kvantifikáciu antigén signálu v každej dráhe. Pomery pre párové Plus: vzoriek mínus cholesterolu boli vypočítané, a priemerné pomery ± SEM (n) škvrny sú uvedené v modrej farbe. Nulová hypotéza, že pomer rovný 1 bola hodnotená v dvojstranného Student t-test.
Okrem merania Lewis antigén, sme priamo porovnávať lipopolysacharid profilov medzi paralelných kultúrach pestovaných v prítomnosti alebo v neprítomnosti cholesterolu, za použitia gélu elektroforéza a farbenie striebrom. Vo všetkých kmeňov H. pylori,
sme skúmali, LPS pásové profily sú identické medzi kultúrami pestovaných v definovanom médiu s cholesterolom, ktorý bol získaný v médiu obsahujúcom sérum alebo na krvnom agare (dáta nie sú uvedené), a ako sa očakávalo [5 , 24, 55, 57] tieto profily boli vysoko kmeň-špecifické. Na týchto gélov, cholesterol-responzívne LPS pásy boli najjasnejšie vyriešený pre kmeň G27, klinický izolát (Obrázky 7, 8).

• Užitočnosť cytokeratinům 7 a 20 (CK7 /20) imunohistochémia v rozdiele krátkodobých segmente Barrettova pažeráka od žalúdka, črevné metaplázia: Je to spoľahlivý?
• Prídavok gélu citlivého na pH zlepšuje mikroemulzné stabilitu pre cielené odstránenie hrubého ammonia