Helicobacter pylori lipopolysaccharide modificatie, Lewis-antigeen expressie, en de maag kolonisatie zijn cholesterol-afhankelijke

Helicobacter pylori
lipopolysaccharide modificatie, Lewis-antigeen expressie, en de maag kolonisatie zijn cholesterol-afhankelijke
Abstracte achtergrond
Helicobacter pylori
specifiek neemt cholesterol en neemt het in de bacteriële membraan, maar weinig is momenteel bekend is over fysiologische rollen cholesterol's. We vergeleken fenotypes Resultaten in vivo
kolonisatievermogen van H. pylori
gegroeid in een gedefinieerd serumvrij groeimedium, F12 met 1 mg /ml albumine die 0 tot 50 ug /ml cholesterol.

Terwijl een verdubbeling keer door cholesterol waren grotendeels onaangetast, andere openlijke fenotypische veranderingen waargenomen. H. pylori
stam SS1 gegroeid in gedefinieerd medium met cholesterol met succes gekoloniseerd de maag van gerbils, terwijl SS1 geteeld zonder cholesterol niet te koloniseren. H. pylori
lipopolysaccharide geeft vaak Lewis X en /of Y-antigenen. Expressie van deze antigenen gemeten met hele-cel-ELISA werd aanzienlijk versterkt in reactie op de groei van stam SS1, 26.695 of G27 cholesterol. Bovendien gelelectroforese van lipopolysaccharide in wildtype G27 en mutanten zonder de O-keten toonde structurele veranderingen in de kern oligosaccharide /lipide A resten. Deze reacties in Lewis antigen niveaus en in lipopolysaccharide profielen om cholesterol beschikbaarheid waren zeer specifiek, omdat er geen wijzigingen plaats toen cholesterol werd vervangen door β-sitosterol of galzouten. Verstoring van de genen die coderen cholesterol α-glucosyltransferase of lipide A fosfoethanolamine transferase had geen effect op Lewis expressie, noch op lipopolysaccharide profielen of over de cholesterol responsiviteit van deze eigenschappen. Verstoring van de lipide A-1 fosfatase gen elimineerde de invloed van cholesterol op lipopolysaccharide profielen maar zijn effect op expressie Lewis.
Conclusies
Tezamen suggereren deze resultaten dat cholesterol uitputting leidt tot afwijkende vormen van LPS die afhankelijk zijn defosforylering lipide A bij de 1-positie. Een voorlopige model voor de waargenomen effecten van cholesterol besproken waarin opeenvolgende stappen van lipopolysaccharide biogenese en onafhankelijk voorstelling van Lewis-antigeen op het celoppervlak, afhankelijk membraansamenstelling. Deze nieuwe bevindingen tonen aan dat cholesterol beschikbaarheid toelaat H. pylori
haar cel envelop op een manier die van invloed kunnen zijn kolonisatie van gastheer weefsel in vivo
wijzigen. Achtergrond
Helicobacter pylori
is een zeer niche -adapted ziekteverwekker die de menselijke maag bewoont, wordt overgebracht in de eerste plaats binnen gezinnen en heeft geen bekende milieu reservoir. Chronische infecties kunnen asymptomatisch zijn of gastritis, maagzweer of maagkanker veroorzaken. Om infectie vast te stellen, moet de bacterie doorvoer overleven door de zure maag compartiment [1]. Het dringt en vestigt verblijf in de beschermende slijmlaag, een lipide en cholesterol-rijke omgeving [2, 3]. Binnen deze niche de bacterie omvat verscheidene mechanismen om de immuunrespons van de gastheer te ontwijken.
Lipopolysacchariden (LPS) op het oppervlak van H. pylori Wat zijn gemodificeerd om bepaalde menselijke bloedgroep antigenen in, vooral Lewis antigenen X en Y [ ,,,0],4-7], en minder vaak H type 1, i-antigeen, bloedgroep A of Lewis antigenen A of B [8-10]. Deze oppervlakte LPS antigenen nodig zijn voor de oprichting van een infectie, omdat gemuteerde stammen gebrekkig LPS O-antigeen synthese of voor Lewis X /Y-expressie niet aan muizen [11-13] koloniseren. Er zijn aanwijzingen dat Lewis antigenen tot expressie gebracht op het bacteriële oppervlak bij aan hechting van H. pylori aan
maagepitheelcellen [10, 14], en spelen een rol bij weefseltropisme [15-17]. Maagepitheelcellen ook tot expressie Lewis antigenen [18, 19], wat suggereert dat de weergave van Lewis antigenen op het bacteriële oppervlak kan als mimicry strategie dienen. Studies van klinische isolaten [18, 20] en experimentele infecties bij dieren [21] ondersteunen deze rol voor bacteriële antigenen Lewis bij immuun-ontwijking. In menselijke infecties hebben H. pylori
Lewis antigenen verbonden met de ernst van maagzweren en duodenitis [16, 22]. Een ander belangrijk kenmerk van H. pylori
LPS zijn gemodificeerd lipide A structuur met beperkte acylering en minder geladen groepen dan typisch enterobacteriën [23]. Deze lipide A modificaties minimaliseren endotoxische en ontstekingseigenschappen van H. pylori
LPS (beschreven door [24]).
Cholesterol niet essentieel voedingsmiddel voor H pylori
, al is de groei in serumvrij medium [bevordert ,,,0],25, 26]. H. pylori
specifiek op te nemen cholesterol in het bacteriële membraan [27], evenals een beperkt aantal pathogene en commensale bacteriën met inbegrip van Proteus mirabilis, Lactobacillus acidophilus
, Borrelia sp
. En Mycoplasma
[ ,,,0],28-30]. Cholesterol het membraan in deze organismen [30-32] versterken. H. pylori
ook unieke invulling cholesterol α-glycoside [33, 34], en deze metaboliet kan verder worden gemodificeerd door acylering of fosfatidylering [34]. Alfa-glucosylated cholesterol ontwricht gastheer immuunreactie op de bacterie in een muismodel door onderdrukking van fagocytose en T-celactivering [35]. Andere rollen voor cholesterol en cholesterol metabolieten in het bacteriële membraan nog worden onderzocht. In dit rapport demonstreren we dat de biosynthese van lipopolysaccharide, waaronder Lewis antigeenexpressie en LPS kern /lipide A modificatie, worden veranderd door de beschikbaarheid van cholesterol in het groeimedium. We presenteren gegevens die erop wijzen dat deze veranderingen in de celenvelop aanzienlijk kunnen beïnvloeden pathogeen /gastheer interactie in een diermodel van infectie.

Werkwijzen Bacteriële stammen en groeiomstandigheden
Stammen van H pylori
inbegrepen de laboratorium stam ATCC43504 (oorsprong: Australië), 26.695 (UK), klinisch isolaat G27 (Italië [36], die door N. Salama), en de muis aangepaste stam SS1 (Australië; geleverd door Adrian Lee [37]). De bacteriën werden bij 37 ° C in een microaerobic atmosfeer van 5% O 2/10% CO 2 op Campylobacter bloed agar (CBA) gehandhaafd. Bacteriën werden elke 2 tot 3 dagen gepasseerd, en niet langer dan 25 dagen, genetische drift te minimaliseren. Groei in chemisch gedefinieerd medium [26], werden bacteriën geënt vanuit CBA in weefselkweek kolven met Ham's F12 (Gibco) bij 1 mg /ml runderserumalbumine (vetzuur-vrij, Sigma A7906), hierna te als gedefinieerd medium. Vloeibare kweken werden dagelijks gepasseerd door verdunning in vers medium bij de initiële dichtheid van 1-2 x 10 6 /ml, en gebruikt bij passage 3 tot 5. celkweekniveau cholesterol (> 99%, Sigma) werd toegevoegd aan F12 een stabiele emulsie die 10 × 500 ug /ml cholesterol gedispergeerd in 10 mg /ml albumine, dat was bereid volgens [38]. De volgende media toevoegingen werden op dezelfde wijze uitgevoerd: P-sitosterol (synthetische, 95%), natriumtaurocholaat, natriumglycocholaat, β-oestradiol, progesteron (alle van Sigma), dehydroepiandrosteron (Calbiochem) en β-coprostanol (Matreya) .
Verdubbeling keer werden tijdens log-fase groei bepaald door het kwantificeren van levensvatbare cellen met behulp van de Cell Titer Glo reagens (Promega), zoals gevalideerd en beschreven [39]. Meting van biomassa als CFU, cellulaire eiwit of ATP alle consistente resultaten. Een waarde van 1 attomol ATP per cel [40] werd aangenomen voor routinematige passage. Mogelijke onjuistheid van deze waarde niet wezenlijk beïnvloeden interpretatie van de gegevens.
Isogene gen storingen werden bereikt door het inbrengen van een Campylobacter coli
chlooramfenicol weerstand element (cat
) volgens de beschreven door Chalker et al
[41]. Primers werden zorgvuldig ontworpen om doelsequentie binnen open reading frames, en zijn opgesomd in Tabel 1. Fusion PCR-reacties met behulp van de PCR Extender System (5Prime) bevatte 2,3 nM elke gel gezuiverd template, 50 pM primer, 1 x tuning buffer, 1,25 mM extra Mg ++, 0,2 mM van elke dNTP en 0,01 U /pl polymerase. Fusiecyclus waren als volgt: 94 ° C 2,5 min, 10 cycli [94 ° C 15 sec, 45 ° C 60 sec, 68 ° C 60 seconden per kb], 25 cycli [94 ° C 15 sec, primer-specifieke Tm 30 sec, 68 ° C 60 seconden per kb], laatste verlenging 68 ° C 6-8 min. Fusieproducten werden opnieuw geamplificeerd met Pfx50 (Invitrogen) om de hoeveelheid te verhogen, vervolgens gezuiverd met het Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen). Ontvangende stammen gekweekt 1 dag CBA werden met 500 ng van het uiteindelijke amplicon middels natuurlijke transformatie [42, 43], gevolgd door selectie op 7-10 dagen CBA bevattende 15 ug /ml chlooramfenicol. Om allelische vervanging gelden, werden de resulterende stammen geëvalueerd door PCR van genomisch DNA onder gebruikmaking GoTaq (Promega) met primers aangegeven in tabel 1. PCR-strategie en de resultaten worden getoond in figuur 1 1.Table Primersequenties.
primers voor allel verstoring

CAT FWD [41]
GATATAGATTGAAAAGTGGAT
F5b
CAT rev [41]
TTATCAGTGCGACAAACTGGG
cgtfwd
atggttattgttttagtcgtgga
cgtM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCatatggtggatatagcggtaatg
cgtM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAttaaaaacttgcaccctttatgt
cgtrev
ctctgatcgcttcttcataaact
pmifwd
atgaaaattaaaaatatcttactgagtggg
pmiM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCatctaaaccattagggctttcaatatac
pmiM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAActttagtgaacgaggtagaaacaaac
pmirev
ttttgtctgttaaaatcatcatcaat
lpxE fwd
atgaaaaaattcttatttaaacaaaaattttgtgaaagc
lpxEM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCcccaaacgctgatcgttgat
lpxEM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAcgagcgcccttatggag
lpxErev
ttaaggctttttggggcttgtaaa
eptAfwd
ttggcatcattattccatctgaggt
eptAM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCgcaacaccccaaaaacaacgata
eptAM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAagcctgattaacgcctatgaca
eptArev
ttactcttttttgtgtttaagcagatctaaagaa
extra primers voor de bevestiging van genverstoring
G27_951fwd
agtgattcaagatggcgtgaaaa
F1
G27_953rev
ccaagctcaatcatttctttgtcttt
R1
G27_37fwd
cggcatggggatcaatcaag
F2
G27_39rev
ctcccgtcttgcccggtaac
R2
G2719fwd
gggcgataaaatcgtgtttca
F3
G2721rev
tcccctttatcgtttatgctaatga
R3
G2720fwd
cccaaactgagcgctaaca
F4
G2722rev
aagaaatttcaaggtataatagtttccaag
R4
aRespective gen nummers in openbare databanken voor 26.695 en G27 zijn als volgt: [CGT: hp0421, G27_952
], [pmi
(rfbM
): hp0043, G27_38
], [lpxE: hp0021, G27_20
], [EPTA:. hp0022, G27_21
]
Brighthand kolom geeft de korte primer benaming in Figuur 1.
Figuur 1 PCR-verificatie van allelische verstoringen in H. pylori-stam G27. Genoom DNA werd bereid uit-gen verstoord G27 stammen volgende drie passages onder chlooramfenicol selectie, vervolgens PCR versterkt, zoals in elke regeling. Primers sequenties zijn gegeven in tabel 1. A. Verstoring van CGT. Vijf voorbeelden getoond op zeven afzonderlijke klonen, die gaven identieke resultaten op het scherm. B. Verstoring van pmi (rfbM). De gehele chloramfenicol-resistente populatie werd gepasseerd in elke selectieronde, zonder klonale selectie. C. Verstoring van lpxE en EVA. De hele chlooramfenicol-resistente bevolking werd gepasseerd in elke ronde van selectie, zonder klonale selectie.
Gastric kolonisatie
Dierproeven door de LSUHSCS Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd. Vrouwelijke Mongoolse gerbils werden gehandhaafd op gewone voeding ad libitum
. Motiliteit te behouden, werd H. pylori stam SS1
overnacht gekweekt onder omstandigheden microaerobic in T75 kolven die 40 ml F12-medium met 0,4 mg /ml albumine en 0 of 50 ug /ml cholesterol. De beweeglijke planktonische bacteriën werden geoogst door centrifugeren en geresuspendeerd in isotone zoutoplossing. Kolonievormende eenheden (CFU) werden gemeten in deze inocula door seriële verdunning en uitplaten op CBA en deze metingen bevestigden gelijke dosering levende bacteriën tussen de groeiomstandigheden. Ongeveer 10 8 CFU per 30 ul werden oraal toegediend aan dieren (n = 6-9 per groep). De dieren werden 11 dagen later gedood en magen werden verwijderd en ontleed. H. pylori
aanwezig in de maag antrum homogenaten werden gekwantificeerd door seriële verdunning en uitplaten op CBA met 5-fluorcytosine (5 ug /ml), vancomycine (10 ug /ml), amfotericine B (5 ug /ml), bacitracine ( 30 ug /ml), polymyxine B (10 U /ml) en trimethoprim (10 ug /ml) [44]. Dupliceren CFU bepalingen werden gemaakt voor meerdere verdunningen van elk weefselmonster.
Whole-ELISA
standaardprocedures [6, 7, 45], werden aangepast voor gebruik van peroxidase geconjugeerd secundair antilichaam. Alle antilichamen werden verkregen van Calbiochem. Overnacht kweken van bacteriën werden verzameld door centrifugeren bij 3500 xg
10-15 min, in Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing gewassen en gepelleteerd bij 10.000 xg
gedurende 2 min, vervolgens geresuspendeerd in 15% glycerol /0,9% NaCl. De celsuspensies werden geanalyseerd op eiwitgehalte en opgeslagen bij -20 ° C. Cell monsters die bekende hoeveelheden eiwit werden snel verdund in 50 mM natriumbicarbonaat /carbonaat pH 9,55 en onmiddellijk verdeeld in putjes van een ELISA-plaat (Costar΅7). Platen werden afgesloten en overnacht gekoeld, daarna geblokkeerd gedurende 90 minuten in 3% runderserumalbumine opgelost in de wasbuffer die bestond uit 0,1 M natriumfosfaat pH 7,4 /0,1 M NaCl /0,1% w /v Tween-20. Primair antilichaam, monoklonaal anti-Lewis X (Signet kloon P12) of anti-Lewis Y (Signet kloon F3), verdund 1: 500 in wasbuffer /1% BSA, werd toegevoegd gedurende 2 uur, gevolgd door vier veranderingen wasbuffer. Het secundaire antilichaam, een 1: 2500 verdunning van mierikswortelperoxidase-geconjugeerd geit anti-muis IgM in wasbuffer /1% BSA, toegevoegd gedurende 90 min, gevolgd door vier veranderingen wasbuffer. Het chromogeen substraat was 0,42 mM tetramethylbenzidine en 0,02% H 2O 2 in 50 mM acetaat /citraat pH 5,5 [46]. Na 15 minuten bij kamertemperatuur werd reactie gestopt met 1 /5de volume 2,5 N H 2SO 4, en kleurverandering werd gemeten in een plaatlezer bij 450 nm. In negatieve controles weglaten van primaire of secundaire antilichaam, of met E. coli
stam HB101 vervangen door H. pylori
, kleurverandering was verwaarloosbaar (A < 0,05). Niveaus van Lewis Y verwaarloosbaar (A < 0,1) in stam 26.695 en 43.504, evenals Lewis X niveaus in SS1
Elektroforetische analyse van lipopolysacchariden
H. pylori
kweken werden verzameld zoals hierboven beschreven, en gewassen. celpellets werden bewaard bij -70 ° C. Cellen werden gelyseerd in 60 mM Tris HCl pH 6,8 met 2% SDS bij 95-98 ° C gedurende 10 minuten. Eiwit werd gemeten met behulp van de bicinchoninezuur assay (Pierce). Monsters van cellysaten werden op gelijke eiwitgehalte (1 mg /ml), vervolgens geproteolyseerd in reacties bevattende (eind) 60 mM Tris HCl pH 6,8, 0,67% SDS, en 0,67 mg /ml proteinase K bij 60 ° C gedurende 2 uur [47]. Elektroforetische artefacten als gevolg van de aanwezigheid van lipide /detergens-complexen elimineren, werden geproteolyseerd monsters geëxtraheerd met hete fenol [48]. Controle-experimenten nagegaan of alle LPS bands kwalitatief en zonder vooringenomenheid via de volgende extractie procedure werden gewonnen. Geproteolyseerd monsters werden gemengd met 1 volume van 90% waterige fenol en geïncubeerd bij 70 ° C gedurende 20 min. Na afkoelen tot 10 ° C gedurende 1 min, werden de monsters gecentrifugeerd bij 12.000 xg
gedurende 20 minuten bij 10 ° C en de waterige fase verzameld. De fenolische fasen werden opnieuw geëxtraheerd met 1 volume van H 2O bij 70 ° C gedurende 10 min, en het centrifugeren herhaald. De gecombineerde waterige extracten werden ingesteld op 0,5 M NaCl en geprecipiteerd met 10 vol ethanol in de koelkast gedurende de nacht, vervolgens gecentrifugeerd bij 20.000 xg
gedurende 20 minuten bij 10 ° C en aan de lucht gedroogd. Gezuiverde LPS monsters werden opnieuw opgelost in Laemmli-monsterbuffer [49] bij 95 ° C gedurende 5 minuten. De monsters werden op 15% polyacrylamide /0,9% bis minigels bevattende 3,2 M ureum met Laemmli buffer discontinue formule [49] en een 5% stapelgel. Na elektroforese bij 150 V gedurende 75 minuten werden gelen ofwel overnacht gefixeerd voor zilverkleuring [50] of overgedragen aan het membraan via polyvinylideendifluoride Tris /glycine-overdrachtsbuffer [51]. Blots werden 's nachts geblokkeerd in 3% runderserumalbumine en 0,03% NaN 3 in de wasbuffer boven beschreven voor ELISA. Primair antilichaam (anti-Lewis X en anti-Lewis Y, 1: 200) en secundair antilichaam (peroxidase-geconjugeerd geit anti-muis IgM, 1: 1000) werden verdund in wasbuffer die 0,5% BSA. Colorimetrische detectie gebruikte 3,3'-diaminobenzidine met kobalt verbeteren [52]. Densitometrie werd uitgevoerd met het publieke domein applicatie Afbeelding J, beschikbaar op http:.... //RSB info nih gov /ij
Resultaten
is weinig bekend over de fysiologische rol van cholesterol in H . pylori
. Om reacties van H. pylori
cholesterol onderzoeken kozen wij een gedefinieerd serumvrij kweekmedium, F12 met 1 mg /ml albumine, waarbij deze bacterie stabiel kan worden gepasseerd [26]. Deze bescheiden concentratie van albumine stimuleert de groei [25, 26] en verlicht de strak vasthouden aan de cultuur oppervlakken die optreedt in eiwitvrije media [53]. In deze gedefinieerd medium heeft de toevoeging van 50 ug /ml cholesterol niet fundamenteel aan de groei (figuur 2). De afwezigheid van groei-effecten onder de gekozen kweekomstandigheden was voordelig voor onderzoek naar de fysiologische belang van cholesterol in H. pylori
. Zo konden we gastrische kolonisatie van woestijnratten door stam SS1 die gekweekt werden in het bepaalde medium dat verschillende hoeveelheden cholesterol (figuur 3) te vergelijken. Elf dagen na orale inoculatie werden H. pylori
in de maag antrum selectief verguld en gekwantificeerd. Opvallend werden gekoloniseerd gerbils alleen de kweken gekweekt in cholesterol-bevattend medium, maar niet door H. pylori
gekweekt in cholesterol-vrij medium (In elk experiment P < 0,0001 ter vergelijking log (CFU /g) tussen groepen met behulp van Student tweezijdige t-test). Daarom cholesterol is een essentieel onderdeel van het groeimedium om H. pylori infectie
vestigen in dit diermodel. Figuur 2 Toevoeging van cholesterol in het beschreven medium geen invloed H. pylori groeisnelheid. Parallelle culturen van elke stam werden gedurende de nacht gekweekt in F12 /albumine (1 mg /ml) in afwezigheid (open staven) of aanwezigheid (gearceerde staven) van 50 ug /ml cholesterol. De initiële bevolkingsdichtheid was 2 x 106 /ml. Verdubbelingstijden werden berekend uit de gemeten toename van de biomassa. Getoonde waarden vertegenwoordigen het gemiddelde ± sd van vijf of meer onafhankelijke metingen. n
. s
. Student's tweezijdige t-test voor paarsgewijze gegevens toonden geen statistische significantie.
Figuur 3 H. pylori gekweekt zonder cholesterol nalaten gerbils koloniseren. H. pylori stam SS1
werd overnacht gekweekt in gedefinieerd medium dat 0 of 50 ug /ml cholesterol. Woestijnratten werden oraal geïnoculeerd met 3,5 x 108 CFU (experiment A) of 1 x 108 CFU (experiment B). H. pylori
in de maag antrum werden gekwantificeerd op 11 dagen. Elke verticale staaf vertegenwoordigt het gemiddelde van twee bepalingen voor één dier, en horizontale lijnen geven de mediaan voor elke behandeling groep. Wanneer er geen kolonies werden teruggevonden, werden waarden worden genoteerd als 5 × 102 CFU /g weefsel, de geschatte detectielimiet.
Bepaalde stammen van H. pylori
tentoongesteld significante verschillen in naleving van kweekvaten volgende passage in cholesterol, wat suggereert veranderingen in hun mobiele oppervlakte-eigenschappen (Hildebrandt & McGee, ongepubliceerde waarnemingen). Om deze reden hebben we besloten om lipopolysacchariden, die de voornaamste component van de cel envelop vormen onderzoeken, en dienen om de biologisch belangrijke Lewis antigenen te presenteren. We gebruikten een gevestigde whole-cell ELISA procedure om de overheersende Lewis antigenen, Lewis X en Y (figuur 4) te kwantificeren. Volgens de literatuur [54, 55], vooral Lewis X werd gedetecteerd in stam 26.695, alleen Lewis Y gedetecteerd in SS1 en significante niveaus van beide werden gedetecteerd in G27. Telkens absorptiemetingen waren lineair met betrekking tot belasting monster, een voorval dat is niet ongebruikelijk in ELISA-bepalingen [56] en dat is opgemerkt door andere onderzoekers gebruiken dezelfde monoklonalen [7]. Aldus teneinde antigeenspiegels vergelijken monsters van H. pylori gekweekt in de afwezigheid of aanwezigheid van cholesterol
, voerden we parallelle titratie over een bereik van monster ladingen variërend 20-500 ng celeiwit per putje. Deze titraties reproduceerbaar vertoonden een duidelijke toename van de hoeveelheid Lewis X en /of Lewis Y-antigeen gedetecteerd op het celoppervlak bij H. pylori stammen 26695
, SS1 of G27 werden gekweekt bij aanwezigheid van cholesterol (Figuur 4). In repliceren onafhankelijke experimenten was de gemiddelde cholesterol-afhankelijke stijgingen waren statistisch significant (Tabel 2). Vergelijkbare resultaten zijn ook verkregen Lewis X in stam 43504 (gegevens niet getoond). Spiking monsters met cholesterol aan het einde van de groeiperiode heeft de hoeveelheid Lewis-antigeen gedetecteerd door ELISA (figuur 5A) niet veranderen. In een ander controle-experiment geverifieerd wij voor deze vier stammen die de hoeveelheid celeiwit gebonden aan de putjes werd niet beïnvloed door de groei in cholesterol (Figuur 5B). De ELISA resultaten dergelijke gevallen zijn verhoogde oppervlakte-expressie van antigenen Lewis was een legitieme biologische reactie op cholesterol die zich in alle geteste stammen. Deze reactie was specifiek voor cholesterol, want vervanging van cholesterol in het groeimedium met analogon P-sitosterol of natriumtaurocholaat geen effect op Lewis X of Y expressie gehad door G27 (Figuur 4, rechter panelen en Tabel 3). De Lewis-antigeen reactie op cholesterol bleef na disruptie van het gen voor cholesterol α-glucosyltransferase (CGT
) in stam G27 (Tabel 2, en zie hierna) en 26.695 (gegevens niet getoond), met uitsluiting van de deelname van α -glycoside metabolieten van cholesterol.Table 2 Verbetering celoppervlak Lewis-antigeen expressie door de groei van kweken in de aanwezigheid van cholesterol.a

voudige toename in vergelijking met parallel cholesterol-vrije cultuur

Lewis X
Lewis Y

gemiddelde ± SEM (n)
P waarde
gemiddelde ± SEM (n)
P waarde
26.695
4,32 ± 0,36 (6)
0,0002
niet gedaan
SS1
niet gedaan
1,88 ± 0,08 (5)
0,0004
G27 wild type
2.85 ± 0,42 (8)
0,0033
2,22 ± 0,24 (8)
0,0016
G27 CGT :: cat
3,69 ± 0,34 (5)
0,0013
2,88 ± 0,30 (5)
0,0034
G27 lpxE :: cat
2,59 ± 0,50 (6)
0.025

2,47 ± 0,43 (7)
0,014
een Lewis- antigenen werden gekwantificeerd in duplo whole-cell ELISA analyses van gepaarde gekweekt in aanwezigheid of afwezigheid van 50 ug /ml cholesterol. Het antigeen belasting is 300 ng cellulair eiwit per putje. Ratio's voor plus: minus cholesterol werden berekend uit duplo netto absorptie lezingen in elke test, en verhoudingen bepaald 5-8 onafhankelijke ELISA runs waren dan gemiddeld. P-waarden werden berekend in tweezijdige Student t-tests voor de nulhypothese dat de verhouding gelijk aan 1.
Tabel 3 Enhanced celoppervlak Lewis antigen expressie cholesterol-specifieke

voudige toename in vergelijking met parallel cholesterol-vrije cultuur

Lewis X
Lewis Y


gemiddelde ± SEM (n)
P waarde
gemiddelde ± SEM (n)
P-waarde

cholesterol
2,96 ± 0,22 (5)
0,0008
2,48 ± 0,10 (4)
0,0007
β- sitosterol
1,80 ± 0,47 (4)
0,19
1,19 ± 0,13 (3)
0,28
taurocholaat
0,64 ± 0,16 (4)
0.12
0,84 ± 0,20 (3)
0,52
Lewis antigenen werden gekwantificeerd in duplo whole-cell ELISA analyses van paarsgewijze kweken van H. pylori
G27 gekweekt in aanwezigheid of afwezigheid van 130 pM cholesterol, of een gelijke concentratie van β-sitosterol of natrium taurocholaat. Het antigeen belasting is 300 ng cellulair eiwit per putje. Ratio's voor plus: minus cholesterol werden berekend uit duplo netto absorptie lezingen in elke test, en verhoudingen bepaald 3-5 onafhankelijke ELISA runs waren dan gemiddeld. P-waarden werden berekend in tweezijdige Student t-tests voor de nulhypothese dat de verhouding gelijk is aan 1.
figuur 4 Groei in cholesterol specifiek verbetert celoppervlak weergave van Lewis antigenen. Hele cel ELISA-testen werden uitgevoerd op stalen van H. pylori
stam 26695 (linksboven), SS1 (linksonder) of G27 (boven en onder rechts). Parallelle kweken werden gedurende de nacht gekweekt in gedefinieerd medium dat 130 uM van de volgende toevoegingen: cirkels, geen toevoeging; pleinen, cholesterol; driehoeken, β-sitosterol; X, taurocholaat. Variërende hoeveelheden celsuspensie overeenkomt met bekende hoeveelheden cellulair eiwit werden aangebracht op putjes van ELISA platen dupliceren en immunoassayed de aanwezigheid van Lewis X en Lewis Y-antigeen zoals is beschreven in Methods
. Negatieve controlemonsters van E. coli
HB101, of slechts-buffer blanks, viel op de stippellijn. Absorptieaflezingen voor afzonderlijke putjes uitgezet. Herhaalde bepalingen met drie of meer onafhankelijke culturen gekweekt in wezen identieke resultaten opgeleverd.
Figuur 5 ELISA controle-experimenten. A. Spiking met cholesterol aan het einde van de groeiperiode verandert niets Lewis antigeenexpressie. Kweken van H. pylori
werden overnacht in gedefinieerd medium gekweekt zonder (controle) of met 50 ug /ml cholesterol (cholesterol gekweekt). Een derde vat (cholesterol verrijkte) werd gekweekt in afwezigheid van cholesterol, gekoeld op ijs, en een equivalente hoeveelheid cholesterol werd toegevoegd voordat de cellen werden geoogst. Lewis antigenen werden gekwantificeerd in tweevoud door whole-cell ELISA, het laden van 300 ng cellulair eiwit per putje. Verhoudingen voor plus: min cholesterol werden berekend uit de gemiddelde netto absorptiemetingen elke bepaling en de plot toont gemiddelde verhoudingen ± sem voor 3-5 onafhankelijke ELISA uitgevoerd. P-waarden werden berekend in tweezijdige Student t-tests voor de nulhypothese dat de verhouding gelijk is aan 1. Voor vergelijkingen gelabeld ns, P > 0,05. B. Equivalent binding van cellen aan ELISA-platen. Monsters van H. pylori
die parallel kweken werden gekweekt in afwezigheid (witte staven) of aanwezigheid van 50 ug /ml cholesterol (grijze balken) werden op multiwell platen op dezelfde wijze als Lewis antigen ELISA assays toevoegen 500 ng van cellulair eiwit per putje. Na overnacht attachment, werden putjes tweemaal met Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing, daarna eiwit in hechtende cellen werd gekwantificeerd met de BCA reagens gewassen. Gemiddelde waarden ± SD van viervoudige putjes worden getoond.
Detectie van Lewis X en Y door immunoblotting met dezelfde monoklonale antilichamen een ander resultaat (figuur 6). In verschillende pogingen met deze techniek, hebben we geen cholesterol-afhankelijke verschillen in Lewis X of Y niveaus te detecteren, afgezien van een kleine stijging van Lewis X 43.504 die slechts marginaal significant. De blotting procedure toegepast LPS monsters geëxtraheerd uit cellysaten, en in principe moet detecteren het gehele cellulaire Lewis antigen zwembad, terwijl de whole-cell ELISA-methode is ontwikkeld om alleen die gepresenteerd op het extracellulaire oppervlak te detecteren. Het interessante verschil in resultaten tussen onze ELISA analyses en immunoblots suggereert een verandering in cellulaire compartimentering van de Lewis-antigeen, afhankelijk van de beschikbaarheid van cholesterol in het groeimedium. Figuur 6 Lewis X en Y-antigeen profilering door immunoblotting. Monsters van LPS geïsoleerd uit parallelle culturen gekweekt in afwezigheid (-) of aanwezigheid (+) van 50 ug /ml cholesterol werden ontbonden op 15% ureum gels. Hoeveelheden geladen per baan, als ug initiële lysaat eiwit, worden gegeven aan de bovenkant van elke baan. Na de overdracht, werden antigenen immunologisch met monoklonale antilichamen specifiek voor Lewis X (bovenste paneel) of Lewis Y (onderste paneel). Een representatief voorbeeld van elk getoond. Side lanen bevatten vooraf gekleurde eiwit markers (M) of 400 ng E. coli O111
: B4 LPS. Antigene signaal verscheen alleen in de O-keten regio's van deze H. pylori
stammen; lege gebieden zijn dienovereenkomstig uitgesneden. De immunoblots werden onafhankelijk herhaald met een aantal sample sets, en densitometrie werd gebruikt om antigeen signaal te kwantificeren in elke baan. Ratio's voor paarsgewijze plus: cholesterol minus monsters werden berekend en de gemiddelde verhoudingen ± sem voor (n) blots worden in blauw. De nulhypothese dat de verhouding gelijk is aan 1 werd geëvalueerd in een tweezijdige Student t-test.
Naast Lewis antigen meten we direct vergeleken de lipopolysaccharide profielen tussen parallelle culturen gekweekt in de aanwezigheid of afwezigheid van cholesterol, middels gel elektroforese en kleuren met zilver. In de H. pylori stammen
we hebben onderzocht, LPS band profielen identiek tussen culturen gekweekt in gedefinieerd medium met cholesterol met die verkregen in serum bevattend medium of agar (gegevens niet getoond), en zoals verwacht [5 , 24, 55, 57] deze profielen waren zeer stam-specifiek. Op deze gelen werden cholesterol LPS reagerende banden duidelijkst opgelost van de stam G27, een klinisch isolaat (figuren 7, 8).

• Het nut van cytokeratines 7 en 20 (CK7 /20) immunohistochemie in het onderscheid van het korte segment Barrett slokdarm van de maag-darm metaplasie: Is het betrouwbaar
• De toevoeging van een pH-gevoelige gel verbetert de stabiliteit van de microemulsie van de beoogde verwijdering van ammoniak colon