microRNA-146a inhiberar G-proteinkopplad receptor-medierad aktivering av NF-kB genom att rikta CARD10 och COPS8 i gastrisk cancer

microRNA-146a inhiberar G-proteinkopplad receptor-medierad aktivering av NF-kB genom att rikta CARD10 och COPS8 i magcancer
Sammanfattning
bakgrund
Gastric cancer är den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död i världen. Inflammatoriska signaler som härrör från gastric cancerceller är viktiga för att rekrytera inflammatoriska celler och reglering av metastasering av magcancer. Flera mikroRNA (miRNA) har visat sig vara involverade i utvecklingen och utvecklingen av magcancer. miRNA-146a (MIR-146a) är en modulator av inflammatoriska signaler, men lite är känt om dess betydelse i magcancer. Vi ville därför att identifiera mål för MIR-146a i magcancer och undersöka dess biologiska roller.
Resultat
Uttrycket av MIR-146a utvärderades genom kvantitativ PCR (qPCR) och fann uppreglerade i gastrin knockoutmöss en musmodell för magcancer, och i 73% av de undersökta humana gastriska adenokarcinom. Expression av MIR-146a genom gastric cancerceller bekräftades genom in situ
hybridisering. Global analys av förändringar i mRNA-nivåer efter MIR-146a transfektion identifierat två transkript, kaspas rekrytering domäninnehållande protein 10 (CARD10) och COP9 signalosome komplexa subenhet 8 (COPS8), som nya MIR-146a mål. qPCR bekräftade Western blotting och luciferasanalyser dessa transkript som direkta MIR-146a mål. CARD10 och COPS8 visade sig vara en del av G-proteinkopplade receptorer (GPCR) vägen för nukleär faktor-kappaB (NF-kappaB) aktivering. Lysofosfatidinsyra (LPA) inducerar NF-kappaB aktivering via
denna väg och överuttryck av MIR-146a hämmade LPA-framkallad NF-kappaB aktivering minskade LPA-inducerad expression av tumörbefrämjande cytokiner och tillväxtfaktorer och hämmade monocyt attraktion .
slutsatser
miR-146a uttryck är uppreglerat i en majoritet av gastriska cancerformer där det riktar CARD10 och COPS8, inhibera GPCR-förmedlad aktivering av NF-kappaB, vilket minskar uttrycket av NF-kappaB-reglerade tumor- främja cytokiner och tillväxtfaktorer. Genom att rikta komponenter från flera NF-kappaB-aktiverande vägar, är MIR-146a en nyckelkomponent i regleringen av NF-kappaB aktivitet.
Nyckelord
Magcancer icke-kodande RNA Cytokiner Bakgrund
Globalt magcancer är den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död [1]. Utveckling av magsäckscancer påverkas av samspelet mellan värd, miljö- och bakteriella faktorer. Exempel på synergistiska riskfaktorer för magsäckscancer är polymorfismer i gener som är inblandade i värdens inflammatoriska svar [2], Helicobacter pylori
(H. pylori
) virulensfaktorer [3] och kost rik på salt och nitrat [4] . Trots den senaste tidens framsteg i upptäckt och behandling av magcancer tidig, är den långsiktiga överlevnaden för avancerad magsäckscancer låg [5]. De främsta utmaningarna i behandling av avancerad magsäckscancer är lymfatiska, peritonealdialys eller fjärrmetastaser organ som samtidigt förutsäger dåligt utfall för dessa patienter [6].
Även om många onkogener och tumörsuppressorer har rapporterats vara inblandad i utvecklingen av gastriska karcinom , de molekylära mekanismerna bakom metastasering av avancerad magsäckscancer är fortfarande dåligt kända [7]. En av de viktigaste händelserna i gastric cancer är inflammation. Inflammation leder till aktivering av transkriptionsfaktorn nukleär faktor-kappaB (NF-kB), som är associerad med gastric carcinogenes [8, 9].
MikroRNA (miRNA) är involverade i utvecklingen och utvecklingen av magcancer [10- 13]. miRNA är en klass av endogena, icke-kodande, enkelsträngade RNA-molekyler av app. 22 nukleotider som medierar posttranskriptionell reglering av genexpression genom basparning med den 3'-otranslaterade regionen (UTR) av mål-budbärar-RNA (mRNA) [14]. miRNA är inblandade i regleringen av de flesta cellulära processer, inklusive celltillväxt, migration, differentiering och apoptos [10, 14, 15]. miRNA är abnormt uttryckta i de flesta humana cancrar och som proteinkodande gener kan miRNA fungera som antingen tumörsuppressorer eller onkogener, vilket reglerar cancer [10, 12]. miRNA-146a (MIR-146a) regleras genom NF-kB och inhiberar interleukin-1-receptor (IL-1R) och Toll-like receptors (TLR) - inducerad aktivering av NF-kB genom att rikta interleukin-1-receptor-associerat kinas 1 (IRAK1) och TNF-receptor associerad faktor sex (TRAF6) [16-18]. MIR-146a har rapporterats avvikande uttryck i flera inflammatoriska sjukdomar och cancer, men rollen av MIR-146a i magcancer är fortfarande kontroversiell, som uttryck av MIR-146a har funnit både upp- och nedregleras här [19-24 ]. Därför undersökte vi uttrycket av MIR-146a i magcancer och kännetecknas sina mål och molekylära funktioner för att klargöra motstridiga resultat.
Vi fann att MIR-146a är uppreglerat i en musmodell av magcancer liksom i mänskliga gastric adenokarcinom och identifierade CARD10 och COPS8 som nya direkta mål för mIR-146a. Båda är en del av G-proteinkopplade receptorer (GPCR) -medierad signaltransduktion som förmedlar aktivering av NF-kB. Detta tyder på att miR-146a verkar tumörundertryckande genom att hämma GPCR-förmedlad aktivering av NF-kB och den resulterande uttrycket av tumörgynnande cytokiner och tillväxtfaktorer.
Resultat
miR-146a expression är uppreglerad i en mus modell av magcancer och i mänskliga gastric adenokarcinom
Gastrin knockout (KO) möss är aklorhydri och utveckla intestinal metaplasi och gastric adenom över tiden [25]. Använda kvantitativ PCR (qPCR) fann vi ett uttryck för MIR-146a app. 2-faldigt uppreglerat i gamla gastrin KO möss med antingen fundic intestinal metaplasi eller antral adenom jämfört med uttrycket i vildtypen (WT) möss (P < 0,05) (Figur 1A). Med användning av in situ
hybridisering miR-146a detekterades i metaplastiskt gastrisk vävnad från gastrin KO-möss, men inte i normal gastrisk vävnad från WT möss (Figur 2AB) (Ytterligare file1: Figur S1). Efter att ha konstaterat att MIR-146a ökar i vår musmodell av magcancer undersökte vi uttrycket av MIR-146a i parade humana gastriska adenokarcinom och angränsande kontroll biopsier och fann att det var upp-reglerade i 27 av 37 fall (73%) ( figur 1B). In situ
hybridisering visade att MIR-146a uttrycktes av de mänskliga magsäcksceller, medan MIR-146a-positiva celler inte detekteras i normal magslemhinna (Figur 2CD) (Ytterligare file1: Figur S1). Figur 1 ökat uttryck av MIR-146a i gastrin KO musen magcancer modell och mänsklig magcancer. (A) Den relativa uttrycket av MIR-146a i metaplastiskt fundic vävnad (n = 8) och hyperplastisk antral mucosa (n = 4) /antral adenom (n = 4) från gastrin knockout (KO) möss jämfört med den genomsnittliga uttryck i matchande vildtyp (WT) musvävnad. * = P < 0,05. (B) Water plot av uttrycket av MIR-146a i 37 humana gastriska adenokarcinom i förhållande till expression i intilliggande normal vävnad. MIR-146a var uppreglerade i 27 av 37 tumörer (73%). Uttrycksnivåer MIR-146a bestämdes genom qPCR och normaliseras till dem av den endogena kontrollen RNU44.
Figur 2 In situ hybridisering detektion av MIR-146a uttryck i gastrin KO musen magcancer modell och mänsklig magcancer. (A) Expression av MIR-146a detekterades inte i WT fundic mus vävnad, (B) medan MIR-146a-positiva celler (blå kärnor) upptäcktes i metaplastisk fundic vävnad från gastrin KO möss. (C) Ingen signal detekterades med den kodade LNA sond. (D) miR-146a expression var frånvarande i normal gastrisk vävnad human, (E) men närvarande i humana gastriska adenokarcinomceller (blå kärnor). (F) Negativ kontroll med hjälp av en kodad LNA sond. Representativa MIR-146a-positiva celler indikeras med pilar. Ursprunglig förstoring x20, Skalstreck = 100 nm.
Det fanns ingen korrelation mellan MIR-146a uttryck i gastric adenokarcinom och patienters ålder, kön och lokalisering eller klassificering av tumörer (data visas ej). Även patienter med höga MIR-146a uttryck tycktes ha en bättre total överlevnad var inte signifikant. (Ytterligare file1: Figur S2) Review MIR-146a mål medlemmar av GPCR-medierad NF-KB-aktivering vägen Äter visade ökat uttryck av mIR-146a i de flesta gastric cancer, ville vi fastställa de biologiska verkningarna av mIR-146a genom att karaktärisera sina direkta molekylära mål i human magcancer. Vi ville göra detta genom att överuttrycker MIR-146a i gastric cancerceller och sedan identifiera mRNA med reducerad uttryck [26]. Därför undersökte vi MIR-146a uttryck i en panel av cellinjer och fann varierat, men överraskande lågt uttryck av MIR-146a i de tillgängliga mag cellinjer (Ytterligare file1: Figur S3), med tanke på den detekterade över uttryck i tumörer <. br> Den humana magcancer cellinje SNU638, som har försumbara nivåer av endogen mIR-146a befanns lämpade för mIR-146a överuttryck studier. Eftersom MIR-146a uttryck var mycket låg i de testade gastric cellinjerna MIR-146a inhibitionsstudier har inte utförts.
Vi testade först om överuttryck av MIR-146a påverkat tillväxten av SNU638 celler och funnit celltillväxt opåverkad ( ytterligare file1: Figur S4). Därefter var globala förändringar i genuttryck i SNU638 celler efter överuttryck av MIR-146a undersöktes. Efter MIR-146a transfektion mRNA med förutsagda 3'UTR MIR-146a målställen var betydligt nedregleras jämfört med mRNA utan förväntade mål platser (P < 4.6e-11, tvåsidiga Wilcoxon rangsummetest) (Figur 3A) . Vi analyserade alla ord av längd 5-7 för överrepresentation i nedregleras mRNA efter MIR-146a transfektion och fann ordet starkast korrelerad med nedreglering var fröet platsen komplement till mogna MIR-146a baser 2-7 /8 ( Figur 3B). Transkript med förväntade 3'UTR målplatser MIR-146a som var betydligt nedregleras på MIR-146a transfektion betraktades som potentiella direkta MIR-146a mål. 847 matchade dessa kriterier (Ytterligare fil1: Tabell S5). De 10 mest nedregleras potentiella MIR-146a mål visas i figur 3C. Som en negativ valideringskontroll vi upprepade proceduren behandla SNU638 celler med en MIR-146a LNA hämmare. Det fanns ingen signifikant uppreglering av gener med fröet platsen komplement till mogna MIR-146a baser (data visas ej). Figur 3 Identifiering av MIR-146a mål. (A) förväntad MIR-146a mål transkript är betydligt nedregleras efter MIR-146a transfektion jämfört med uttryckta gener som inte förutspås mål för MIR-146a (P < 4.6e-11, tvåsidiga Wilcoxon rangsummetest) . (B) Topp 10 ord mest korrelerade med nedreglering (korrelations Z-poäng anges till vänster om varje ord, alla 10 ord har en beräknad FDR < 1e-6). Versaler markera miRNA såddregionen, Watson-Crick baspar (blå), felpassningar (röd). Ordet starkast korrelerad med nedreglering var fröet platsen komplement till mogna miRNA baser 2-7 /8. (C) Avskrifter, har 6mer eller 7mer MIR-146a utsäde platser i 3'UTR, som är mest nedregleras på MIR-146a transfektion visas. Dessa är potentiella direkta MIR-146a mål. Expression ges i log 2-faldig förändring. 3'UTR 6 m /7 m kolumner anger antalet 6- eller 7mer MIR-146a utsäde platser i 3'UTR.
De tre mest nedregleras gener vid MIR-146a överuttryck, IRAK1, kaspas rekrytering domän-innehållande protein 10 (CARD10) och COP9 konstitutiv photomorphogenic homolog subenhet 8 (COPS8) (Figur 3C) alla tillhör signalvägar som leder till NF-kB-aktivering [27-29]. IRAK1 är en känd miR-146a mål involverat i TLR- och IL-1R-medierad aktivering av NF-kB [16-18]. CARD10 är involverad i GPCR-förmedlad aktivering av NF-kB [27], medan COPS8 tros vara inblandade i denna väg baserat på dess inblandning i T-cellreceptor (TCR) -medierad NF-KB-aktivering [28]. Överraskande, men liknar resultaten av Boldin et al.
[30], uttryck av TRAF6, som tidigare har beskrivits som en MIR-146a mål [16, 18, 31], inte reducerades på transkriptionsnivå efter mIR-146a över uttryck i vårt modellsystem.
i magcancer, NF-kB modulerar cellöverlevnad, immunitet och inflammation, och NF-kB-aktivering är associerad med dålig prognos i magcancer [32, 33]. Vi fokuserade därför på att karakterisera CARD10 och COPS8 som direkt MIR-146a mål och deras roller i NF-KB-aktivering i magcancer. Vi bekräftade miR-146a-medierad nedreglering av CARD10, COPS8 och IRAK1 på transkriptnivå (Figur 4A) och också funnit att miR-146a minskade nivåer av CARD10, COPS8 och IRAK1 proteinet (figur 4B). Slutligen direkt inriktning på MIR-146a till 3'UTRs av målgener demonstreras med användning av luciferas analyser (Figur 4C). Sammanfattningsvis bekräftade vi tidigare observationer som visar att MIR-146a riktar direkt IRAK1 och vi dessutom identifierat två nya mål, CARD10 och COPS8, som kodar för proteiner som föreslås vara inblandade i NF-KB-aktivering. COPS8 är en komponent i den COP9 signalosome som består av åtta subenheter (GPS1 och COPS2-8) [34]. COPS8 är den enda subenheten riktade direkt av MIR-146, men eftersom förändring i mängden av de enskilda subenheter har visats påverka mängden av andra subenheter [35, 36], undersökte vi hur transfektion med MIR-146a påverkas uttrycket av alla COP9 signalosome komponenter. I ostimulerade celler uttrycket av COPS2 reducerades (20%) (Ytterligare file1: Figur S5). Vi antar därför att effekterna av MIR-146a på COP9 komplext resultat främst från en minskning av COPS8 uttryck, även indirekt destabilisering av komplexet inte kan uteslutas. Figur 4 CARD10 och COPS8 direkta MIR-146a mål. (A) mRNA-uttryck av de två nya MIR-146a mål, CARD10 och COPS8 och IRAK1, en känd miR_146a mål, bestämdes genom qPCR i styr- och MIR-146a-transfekterade SNU638 celler. Expression av varje transkript visas i förhållande till uttrycket i kontroll-transfekterade celler. CARD10, COPS8 och IRAK1 uttryck nedregleras efter MIR-146a överuttryck. Data visas som medelvärde ± S.D. av fyra biologiska replikat. * = P < 0,05, ** = P < 0,01, *** = P < 0,001. (B) MIR-146a transfektion minskade också proteinnivåer CARD10, COPS8 och IRAK1 i MIR-146a-transfekterade SNU638 celler. Expressionen av varje protein visas i förhållande till uttrycket i kontroll-transfekterade celler. Band kvantifierades i förhållande till p-aktin. Data visas som medelvärde ± S.D. av fyra biologiska replikat. * = P < 0,05, ** = P < 0,01, *** = P < 0,001. (C) Kontroll av direkt och funktionell mål bindning med användning av luciferas konstruktioner håller WT 3'UTRs och muterade (Mut) 3'UTRs (den centrala fyra nukleotid ersattes i MIR-146a bindningsställe) för CARD10, COPS8 och IRAK1. Konstruktioner innehållande antingen WT eller muterade (Mut) 3'UTRs nedströms till eldflugeluciferasgenen samtransfekterades in i HEK293-celler tillsammans med Renilla-luciferas-kontroll-plasmiden och antingen miR-146a eller kontroll (SIGLO). Vänster, luciferasaktivitet ges i förhållande till aktiviteten hos kontroll-transfekterade celler. MIR-146a reducerade luciferasaktiviteten av konstruktioner med WT CARD10, COPS8 och IRAK1 3'UTRs. Höger, är sekvensuppställningar av MIR-146a och potentiella WT och Mut 3'UTR målställen visas muterade baserna visas i rött. Data visas som medelvärde ± S.D. ofta biologiska replikat. *** = P < 0,001. Sekvensuppställningar är anpassade från DIANALab (2009).
MiR-146a inhiberar GPCR-förmedlad NF-KB-aktivitet genom att rikta CARD10 och COPS8
CARD10 och COPS8 är involverade i GPCR-förmedlad aktivering av NF-kB [28, 29 ]. Vi ville därför fastställa sina roller i signaltransduktion i magcancer och därefter undersöka betydelsen av MIR-146a för att hämma denna signalering. För detta ändamål använde vi lysophosphatiditc syra (LPA), som är en känd aktivator av GPCR-förmedlad NF-KB-aktiveringsvägen [29], och främjar magsäckscancer cell migration och invasion [37]. LPA-stiumlation ökat markant NF-kB aktivitet på luciferas reportersystem (Figur 5). siRNA knockdown av CARD10 och COPS8 uttryck inhiberade signifikant LPA-stimulerad GPCR-medierad aktivering av NF-kB i SNU638 celler (Figur 5). Denna hämning var jämförbar med MIR-146a-inducerad inhibering. Däremot hämma endogen MIR-146a var utan effekt på NF-KB-aktivering. Som förutspått, siRNA-medierad repression av IRAK1 uttryck påverkade inte LPA-stimulerade aktiveringen av NF-kB (Figur 5) som IRAK1 inte är inblandad GPCR-medierad väg. Som TRAF6 är en MIR-146a mål med en roll i NF-KB-aktivering, undersöktes effekten av siRNA-medierad repression av TRAF6 uttryck på LPA-stimulerad NF-kB-aktivitet undersöktes. Men knockdown av TRAF6 inte hämma LPA-stimulerad NF-kB-aktivitet (Figur 5). Dessa resultat tyder på att de två nyligen identifierade MIR-146a mål, CARD10 och COPS8, är involverade i GPCR-medierad aktivering av NF-kB. Därför undersöktes effekten av MIR-146a överuttryck på LPA-stimulerad NF-kB aktivitet studeras. MIR-146a inhiberade signifikant LPA-stimulerade NF-kB-aktivitet i SNU638 celler (Figur 5). En blandning av siRNA mot CARD10, COPS8, IRAK1 och TRAF6 härmade Mir-146a-medierad hämning av NF-kB-aktivitet (Figur 5). Knockdown av två andra COP9 komponenter (COPS2 och COPS5) inhiberade även LPA-stimulerade NF-KB-aktivitet, vilket visar vikten av närvaron av alla COP9 signalosome subenheter för LPA-stimulerad aktivering av NF-kB. qPCR av uttrycket av de olika komponenterna undersökta bekräftade knockdown (Figur 5). Figur 5 MIR-146a mål COPS8 och CARD10 GPCR-förmedlad NF-KB-aktivering. SNU638-celler sam-transfekterades med NF-KB-reporterplasmid och Renilla-luciferas-kontroll-plasmid tillsammans med kontrollen (SIGLO), siRNA eller miR-146a. Celler stimulerades med 25 | iM LPA och luciferasaktiviteten mättes. Luciferasaktivitet ges i förhållande till aktivitet kontroll transfekterade LPA-stimulerade celler. siRNA mot CARD10 och COPS8, MIR-146a, MIR-146a-hämmare och en siRNA mix minskad luciferasaktivitet. siRNA mot IRAK1 och TRAF6 inte minska luciferasaktivitet. LPA-stimulerade NF-KB-aktivering hämmades också av siRNA mot COPS2 och COPS5, vilket visar att andra störning av COP9 signalosome komplexa minskar GPCR-förmedlad NF-KB-aktivering. siMix, blandning av siRNA mot CARD10, COPS8, IRAK1 och TRAF6. Data visas som medelvärdet ± S.D. sju biologiska replikat * = P <. 0,05. Den relativa uttrycket av TRAF6, COPS8, IRAK1, CARD10, COPS2 och COPS5 mättes med hjälp av qPCR. Grå skuggning tyder på en betydande förändring i uttryck, p < 0,05, n = 4.
uttrycket av MIR-146a är delvis kontrolleras av NF-kB. Vi har därför också testat hur uttrycket av MIR-146a påverkades av LPA och IL-1β stimulering. Vi fann att LPA behandling fördubblats uttrycket av MIR-146a och IL-1β stimulering gav en 4-faldig ökning av MIR-146a uttryck, vilket är jämförbart med tidigare observationer [16, 38] (Ytterligare file1: Figur S6). Även MIR-146a LNA ökade uttrycket av tre av Mir-146a mål (TRAF6, IRAK1 och CARD10) (Figur 5) den totala aktiveringen av NF-kB förändrades inte i LPA-stimulerade MIR-146a LNA behandlade SNU638 celler.
mIR-146a minskar LPA-inducerad expression av cytokiner och tillväxtfaktorer
i de flesta karcinom microenvironmental faktorer snarare än genetiska förändringar är troligen ansvarig för aktivering av NF-kB signalering som reglerar flera processer, inklusive utsöndring av tillväxtfaktorer och cytokiner [39, 40]. Därför undersökte vi hur miR-146a modulerar expression av utvalda NF-KB-reglerade tillväxtfaktorer och cytokiner som induceras av extracellulära signaler såsom LPA. LPA-stimulering avsevärt ökat uttryck av interleukin-6, -8, 23A (IL-6, IL-8, IL-23A) och kemokin (CC-motivet) ligand 5 (CCL5), kolonistimulerande faktor 1 (makrofag) (CSF- 1) och blodplättshärledd tillväxtfaktor beta-polypeptid (PDGFB) i SNU638-celler (Figur 6). Detta bekräftade att uttryck av dessa gener regleras av LPA-inducerad NF-KB-aktivitet. Överuttryck av MIR-146a minskade signifikant uttryck av IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 och PDGFB i SNU638 celler (Figur 6). Även om IL-6 är en målgen av NF-kB, och även uppregleras av LPA miR-146a överuttryck reducerade inte IL-6 expression under våra betingelser (Figur 6). Dock är LPA induktion av IL-6 uttryck inte bara förmedlas av NF-kB, men även via andra vägar (MAPK /ERK, PI3K /Akt, och p38) [41], vilket kan bidra till skillnaderna. I SNU638-celler den basala nivån av IL-6 är högre än IL-8, vilket kan påverka mRNA-omsättningen. Detta kan vara en del av anledningen till att MIR-146a har mindre effekt på LPA-stimulerad IL-6 uttryck än på IL-8 uttryck, som också har setts i andra cellulära system [42]. Figur 6 MIR-146a inhiberar LPA-inducerad cytokin uttryck. 25 iM LPA användes för att inducera cytokin uttryck från humana gastric carcinoma SNU638 celler. LPA avsevärt förbättrad expression av IL-6, IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 och PDGFB, som mättes med användning av qPCR och visat i förhållande till expressionsnivån i obehandlade kontrollceller. Detta minskar i MIR-146a-transfekterade celler. Data visas som medelvärde ± S.D., n = 4, * = P < 0,05, ns = icke signifikant.
MIR-146a överuttryck i SNU638 celler minskar rekrytering av monocyter
I karcinom monocyter kan rekryteras av t.ex. CCL5 och CSF-1 som uttrycks av tumörceller och denna tumör infiltration av monocyter bidrar till tumören befrämjande inflammatoriska svaret i cancer [39, 40]. Efter att ha visat att MIR-146a reducerade LPA-inducerad expression av cytokiner, vi undersökte hur MIR-146a överuttryck påverkat rekryteringen av monocyter. Vi fann att LPA-behandling av SNU638 celler ökade monocyt migration mot konditionerat medium från SNU638 celler (Figur 7 och övriga fil1: Figur S7), medan transfektion med MIR-146a delvis upphävde detta svar (figur 7), återigen visar att miR -146a hämmar de biologiska svaren av GPCR-förmedlad aktivering av NF-kB, såsom rekrytering av monocyter. Figur 7 MIR-146a minskar monocyt migration. Monocyt migration mot konditionerat medium från bestämmande eller MIR-146a-transfekterade SNU638 celler som lämnades obehandlade eller stimulerades med 25 | iM LPA följdes under 8 timmar. Migration av celler visas i förhållande till migration av obehandlade kontrollceller. Monocyt migration mot medium från LPA-stimulerade SNU638 celler ökat jämfört med migration mot medium från obehandlade celler, medan monocyt migration mot medium från MIR-146a-transfekterade var LPA-stimulerade celler minskat jämfört med medium från kontroll-transfekterade, LPA-stimulerade celler. Data visas som medelvärde ± S.D. av fyra biologiska replikat. ** = P < 0,01, ns = icke signifikant Diskussion
Microenvironmental faktorer.
Är viktiga för NF-KB-aktivering i inflammations drivna cancrar, såsom magcancer och detta NF-KB-aktivering kan tillhandahålla cancerceller med fördelar, som bidrar till det tumorgenic processer [32, 43]. Modulering av NF-KB-aktiverande signalering är därför viktigt för att styra inflammation medierad tumörutveckling. Här visar vi att miR-146a är en central negativ regulator av NF-KB-aktivering eftersom det hämmar flera NF-KB-aktiverande vägar.
MiR-146a expression befanns uppreglerad i app. 2/3 av de humana gastriska adenokarcinom samt i gastrin KO musmodell av magcancer. På liknande sätt har uttryck av MIR-146a visat ökat i hals-, bröst, bukspottkörtel och sköldkörtelcancer [11, 44-46]. Tidigare har uttrycket av MIR-146a funnit både upp- och ned-regleras i magcancer [21-24]. Dessa motstridiga resultat kan återspegla skillnader i tumörer och deras mikromiljö som resulterar i olika grader av NF-kB aktiviteter, som styr MIR-146a uttryck [16]. Överraskande, fann vi låga nivåer av MIR-146a i humana magcancer-cellinjer. Detta kan tyda på att de ökade MIR-146a nivåerna i tumörer coursed av microenvironmental faktorer t.ex. celler som omger tumörcellerna.
att undersöka effekterna av ökade MIR-146a nivåer i magcancer vi identifierat två nya MIR-146a mål, CARD10 och COPS8, och undersökte roller dessa mål. Vi fann att MIR-146a hämmade GPCR-förmedlad NF-KB-aktivering genom direkt inriktning och nedreglera uttryck av CARD10 och COPS8. CARD10 är känd för att krävas för GPCR-inducerad aktivering av NF-kB [27, 29], medan COPS8 är en subenhet av COP9 signalosome som kontrollerar NF-KB-aktivering [28, 47]. Vi visade att CARD10 är involverad i GPCR-förmedlad aktivering av NF-kB, och förutsatt nya bevis för att COPS8 är involverat i denna väg samt. MIR-146a överuttryck ledde också till minskat uttryck av COPS2, en annan subenhet av COP9 signalosome. Vi antar att detta är en indirekt effekt, eftersom det inte finns någon MIR-146a bindningsställe i COPS2 3'UTR och förändringar i uttrycket av en subenhet har visat sig påverka den andra [35, 36]. Det är därför möjligt att MIR-146a i viss mån kan verka genom att inte bara rikta COPS8 men destabilisera COP9 signalosome.
Aberrant signalering genom GPCR har kopplats till tumörcellernas tillväxt och överlevnad, och NF-kB-aktiverande GPCR har varit visat sig bidra till ett brett spektrum av cancerformer (översikt av Dorsam & Gutkind [48]). GPCR kan aktivera NF-kB via
den CARD10 /BCL10 /MALT1 komplexet efter bindning ligander såsom LPA, enothelin-1, angiotensin II (Ang II) och kemokin (CXC-motivet) ligand 12 (CXCL12) (figur 8) [ ,,,0],29, 49]. I vår studie använde vi LPA för att modellera GPCR-förmedlad aktivering av NF-kB. LPA-framkallad GPCR-signalering leder till tumörprogression [49]. Således kunde miR-146a-medierad hämning av GPCR-signalering har tumörundertrycka effekter. Figur 8 MIR-146a mål flera NF-KB-aktivering vägar. Schematisk illustration av NF-KB-aktiverande vägar. MIR-146a har tidigare visats att rikta IRAK1 och TRAF6 och i denna studie visar vi att miR-146a är inriktad CARD10 och COPS8. MIR-146a mål är markerade med röda cirklar.
Förutom GPCR-förmedlad NF-KB-aktivering, kan NF-kB aktiveras via
tumör-nekros-faktor-receptor (TNFR), IL-1 R, TLR, TCR och B-cell receptor (BCR) [50] (figur 8). Tidigare har miR-146a visats inhibera NF-KB-aktivering via
dessa receptorer genom nedreglering expressionen av TRAF6 och IRAK1 [16, 18, 30, 31]. MIR-146a riktar IRAK1 i gastric cancerceller, men inte TRAF6. Även om, visar vi här att miR-146a är inriktad GPCR-förmedlad aktivering av NF-kB, utöver aktiveringen via
TNFR, IL-1R, TLR, TCR och BCR, genom att rikta CARD10 och COPS8 (Figur 8). Således riktar MIR-146a flera komponenter i NF-kB-aktivering vägar i gastric cancerceller. Detta har inte visats för NF-kB-vägen tidigare, men har tidigare setts i den transformerande tillväxtfaktor-β (TGF-β) -vägen, där både MIR-21 och miR-17-92 klustermålgrupp flera mRNA som kodar för proteiner i TGF-β-vägen [51, 52]. Genom att rikta flera komponenter av olika NF-kB-aktiveringsvägar MIR-146a förmedlar en robust och komplex kontroll av NF-kB-aktivitet. Flera andra miRNA kan också reglera NF-KB-signaleringen, men bara miR-146a mål flera gener i olika NF-KB-aktiverande vägar, vilket tyder miR-146a som en viktig modulator av NF-KB-aktivering.
NF-kB reglerar uttryck av cytokiner och tillväxtfaktorer som är involverade i flera aspekter av tumörprogression [43]. Med tanke på att miR-146a minskar NF-KB-aktivitet, är det möjligt att miR-146a verkar tumörundertryckande genom att minska uttrycket av sådana cytokiner och tillväxtfaktorer. I själva verket fann vi att MIR-146a överuttryck minskat uttryck av flera cytokiner och tillväxtfaktorer med känd roll i utvecklingen av cancer; IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 och PDGFB. Dessa gener kan öka celltillväxt, celladhesion och angiogenes [53-55], bidrar till tumör lymfangiogenes [56], aktivera fibroblaster [57], rekrytera monocyter till tumörer [39, 40] och inducerar tumörassocierade makrofager (TAMs) till utsöndrar tumörbefrämjande medlare [58] (Figur 9). Figur 9 biologiska processer i gastric cancerceller hämmas av MIR-146a. Vänstra panelen riktar MIR-146a direkt IRAK1, CARD10 och COPS8 i SNU638 celler. Detta leder till hämning av NF-KB-aktivering och följaktligen att undertryckt uttryckning av NF-kB-reglerade cytokiner och tillväxtfaktorer. Expression av MIR-146a är också regleras av NF-kB [16]. Högra panelen minskar miR-146a uttryck av CCL5, CSF-1, IL-8, PDGF och IL-23A, vilka är involverade i monocyt migration och differentiering, proliferation, angiogenes, lymfangiogenes och fibroblast och makrofag tillväxtfaktor release. Således kan MIR-146a fungera som en tumörsuppressor genom att minska cancerfrämjande effekter av NF-kB aktivitet.
Kemotaktiska cytokiner som frisätts av tumörceller kan rekrytera monocyter till tumörställen [39, 59]. Dessa monocyter kan främja tumörprogression [60]. CCL5 och CSF-1 är exempel på monocyt-rekrytering cytokiner som frisätts av tumörceller [39, 40]. Som väntat, monocyter migrerade mindre mot konditionerat medium från LPA-stimulerade SNU638 celler som överuttrycker MIR-146a jämfört med LPA-stimulerade kontrollceller. Figur S2. Figur S3. Figur S4. Figur S5. Figur S6. Alla författare läst och godkänt den slutliga manuskriptet.

• Samtidig överuttryck av serum p53-mutation relaterade till Helicobacter pylori-infektion
• Intraneural metastas av magcancer leder till ischiasnerven pares