mikroRNA-146a hemmer G protein-koblet reseptor-mediert aktivering av NF-kB ved å målrette CARD10 og COPS8 i mage cancer

mikroRNA-146a hemmer G protein-koblet reseptor-mediert aktivering av NF-kB ved å målrette CARD10 og COPS8 i magekreft
Abstract
Bakgrunn
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den nest vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall i verden. Inflammatoriske signaler som kommer fra magekreftceller er viktig for å rekruttere betennelsesceller og regulering av metastasering av magekreft. Flere microRNAs (miRNA) har vist seg å være involvert i utvikling og progresjon av magekreft. miRNA-146a (MIR-146a) er en modulator av inflammatoriske signaler, men lite er kjent om dens betydning i magekreft. Vi ønsket derfor å identifisere mål av MIR-146a i magekreft og undersøke sine biologiske roller.
Resultater
uttrykk for MIR-146a ble evaluert av kvantitativ PCR (qPCR) og funnet oppregulert i gastrin knockout-mus en musemodell av magekreft, og i 73% av undersøkte humane gastriske adenokarsinomer. Uttrykk av MIR-146a av magekreftceller ble bekreftet ved in situ
hybridisering. Global analyse av endringer i mRNA nivåer etter MIR-146a transfeksjon identifisert to transkripsjoner, caspase rekruttering domene som inneholder protein 10 (CARD10) og COP9 signalosome kompleks subenheten 8 (COPS8), som nye MIR-146a mål. qPCR, Western blotting og luciferase analyser bekreftet disse transkripsjonene som direkte MIR-146a mål. CARD10 og COPS8 ble vist å være en del av G-protein-koblet reseptor (GPCR) sti av nukleær faktor-kappaB (NF-kappaB) aktivering. Lysofosfatidisk syre (LPA) induserer NF-kappaB aktivering via
denne veien og over-uttrykk for MIR-146a hemmet LPA-indusert NF-kappaB aktivering, redusert LPA-indusert ekspresjon av tumorfremmende cytokiner og vekstfaktorer og hemmet monocytt attraksjon .
Konklusjoner
MIR-146a uttrykk er oppregulert i et flertall av mage kreft hvor det er rettet mot CARD10 og COPS8, hemme GPCR-mediert aktivering av NF-kappaB, og dermed redusere uttrykk for NF-kappaB regulert tumor- fremme cytokiner og vekstfaktorer. Ved å målrette komponenter av flere NF-kappaB-aktive trasé, er MIR-146a en nøkkelkomponent i reguleringen av NF-kappaB aktivitet.
Nøkkelord
Magekreft Non-kodende RNA Cytokiner Bakgrunn
Globalt magekreft er den nest vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall [1]. Utvikling av magekreft er påvirket av samspillet mellom vert, miljø- og bakterielle faktorer. Eksempler på synergistiske risikofaktorer for magekreft er polymorfismer i gener som er involvert i den inflammatoriske respons verts [2], Helicobacter pylori
(H. pylori
) virulensfaktorer [3] og dietter rike på salt og nitrat [4] . Til tross for store fremskritt i vår oppdagelse og behandling av tidlig magekreft, er den langsiktige overlevelse for avansert magekreft lav [5]. Hovedutfordringene i behandling av avansert magekreft er lymfatisk, peritoneal eller fjerne organmetastaser, som samtidig spår dårlig resultat for disse pasientene [6].
Selv om mange onkogener og tumor dempere er rapportert å være involvert i utviklingen av mage karsinom , de molekylære mekanismene bak metastasering av avanserte mage karsinom er fortsatt dårlig forstått [7]. En av de viktigste hendelsene i magekreftutvikling er betennelse. Betennelse fører til aktivering av transkripsjonsfaktoren nukleær faktor-kappaB (NF-kB), som er forbundet med gastrisk karsinogenisitetsstudier [8, 9].
MicroRNAs (miRNA) er involvert i utvikling og progresjon av magekreft [10- 1. 3]. miRNA er en klasse av endogen, non-koding, single-RNA molekyler av app. 22 nukleotider som medierer post-transkripsjonell regulering av genekspresjon gjennom baseparring med det 3 'ikke-translatert region (UTR) av target-budbringer-RNA (mRNA) [14]. mirnas er involvert i reguleringen av de fleste cellulære prosesser, inkludert celleformering, migrering, differensiering og apoptose [10, 14, 15]. mirnas blir avvikende uttrykt i de fleste humane cancere og, i likhet med protein-kodende gener, kan mirnas fungere enten som tumor-suppressorer eller onkogener, for derved å regulere karsinogenese [10, 12]. miRNA-146a (MIR-146a) er regulert av NF-kB og hemmer interleukin-1-reseptor (IL-1R) og toll-like receptor (TLR) - indusert aktivering av NF-kB ved å målrette interleukin-1-reseptor-assosiert kinase 1 (IRAK1) og TNF reseptor assosiert faktor 6 (TRAF6) [16-18]. MIR-146a har blitt rapportert abnormt uttrykt i flere inflammatoriske sykdommer og kreft, men rollen som MIR-146a i magekreft er fortsatt kontroversielt, som uttrykk for MIR-146a har blitt funnet både opp- og ned-regulert her [19-24 ]. Derfor undersøkte vi uttrykket av MIR-146a i magekreft og preget sine mål og molekylære funksjoner for å avklare sprikende funn.
Vi fant at MIR-146a er oppregulert i en musemodell av magekreft, samt i menneskelige mage adenokarsinomer og identifisert CARD10 og COPS8 som nye direkte mål av MIR-146a. Begge er en del av den G-protein-koblet reseptor (GPCR) -mediert signaltransduksjon som formidler aktiveringen av NF-kB. Dette tyder på at Mir-146a fungerer svulst undertrykkende ved å hemme GPCR-mediert aktivering av NF-kB og den resulterende uttrykket av tumorfremmende cytokiner og vekstfaktorer.
Resultater
MIR-146a uttrykk er oppregulert i en mus modell av magekreft og i menneskelige mage adenokarsinomer
Gastrin knockout (KO) mus er achlorhydric og utvikle intestinal metaplasi og mage adenomer over tid [25]. Ved hjelp av kvantitativ PCR (qPCR) fant vi uttrykket av MIR-146a app. 2-ganger oppregulert i gamle gastrin KO mus med enten fundic intestinal metaplasi eller antrum adenom i forhold til uttrykk i villtype (WT) mus (P < 0,05) (figur 1A). Ved hjelp av in situ hybridisering
MIR-146a ble påvist i metaplastiske gastrisk vev fra gastrinreseptorene KO mus, men ikke i normal gastrisk vev fra WT mus (figur 2AB) (Tilleggs fil1: Fig S1). Etter å ha fastslått at Mir-146a er økt i vår mus modell av magekreft vi undersøkt uttrykk for MIR-146a i sammenkoblede menneskelige mage adenokarsinomer og tilstøtende kontroll biopsier og fant ut at det var oppregulert i 27 av 37 tilfeller (73%) ( Figur 1B). In situ
hybridisering viste at Mir-146a ble uttrykt av den menneskelige mage adenokarcinomceller, mens MIR-146a-positive celler ikke ble påvist i normal mageslimhinnen (figur 2CD) (Tilleggs fil1: Figur S1). Figur 1 Økt uttrykk av MIR-146a i gastrin KO mus magekreft modell og menneskelig magekreft. (A) Den relative ekspresjon av MIR-146a i metaplastiske fundus-vev (n = 8) og hyperplastisk antral mucosa (n = 4) /antrum adenomer (n = 4) fra gastrin knockout (KO) mus sammenlignet med gjennomsnittet ekspresjon i samsvar villtype (WT) mus vev. * = P < 0,05. (B) Waterfall plott av ekspresjonen av MIR-146a på 37 humane gastriske adenokarsinomer i forhold til ekspresjon i tilstøtende normalt vev. MIR-146a ble oppregulert i 27 av 37 svulster (73%). Uttrykket nivåer av MIR-146a ble bestemt ved qPCR og normalisert til de av den endogene kontroll RNU44.
Figur 2 In situ hybridisering påvisning av MIR-146a ekspresjon i gastrin KO mus magekreft modell og human magekreft. (A) Uttrykk for MIR-146a ble ikke påvist i WT fundic mus vev, (B) mens MIR-146a-positive celler (blå kjerner) ble påvist i metaplastiske fundic vev fra gastrin KO mus. (C) Ingen signal ble oppdaget med egge LNA sonde. (D) MIR-146a ekspresjon var fraværende i normalt humant gastrisk vev, (E), men er tilstede i humane mage-adenokarsinomceller (blå kjerner). (F) Negativ kontroll ved hjelp av en egge LNA sonde. Representative MIR-146a-positive celler er angitt med piler. Original forstørrelse x20, Scale bar = 100 mikrometer.
Det var ingen sammenheng mellom MIR-146a uttrykk i mage adenokarsinomer og pasienter 'alder, kjønn og lokalisering eller klassifisering av svulster (data ikke vist). Selv om pasienter med høyt MIR-146a uttrykk syntes å ha en bedre total overlevelse var ikke signifikant. (Tilleggs fil1: Figur S2)
MIR-146a er rettet mot medlemmer av GPCR-mediert NF-kB aktivering veien
Etter å ha demonstrert økt uttrykk av MIR-146a i de fleste av mage kreft, ønsket vi å etablere den biologiske effekten av MIR-146a ved å karakterisere sine direkte molekylære mål i human magekreft. Vi ønsket å gjøre dette ved å over-uttrykker Mir-146a i mage kreftceller og deretter identifisere mRNA med redusert uttrykk [26]. Derfor undersøkte vi MIR-146a uttrykk i et panel av cellelinjer og funnet varierte, men overraskende lav uttrykk for MIR-146a i de tilgjengelige mage cellelinjer (Tilleggs fil1: Figur S3), vurderer oppdaget over-uttrykk i svulster <. br> Den menneskelige magekreft cellelinje SNU638, som har neglisjerbar nivåer av endogen MIR-146a ble funnet egnet for MIR-146a over-uttrykk studier. Siden MIR-146a uttrykk var svært lav i de testede mage cellelinjer MIR-146a hemming studier er ikke utført.
Vi testet først hvis over-uttrykk for MIR-146a påvirket veksten av SNU638 celler og funnet cellevekst upåvirket ( Tilleggs fil1: Figur S4). Deretter ble globale endringer i genuttrykk i SNU638 celler etter over-uttrykk for MIR-146a undersøkt. Etter MIR-146a transfeksjon mRNA med spådd 3'UTR MIR-146a målse var signifikant nedregulert i forhold til mRNA uten spådd retter seg mot områder (P < 4.6e-11, to-tailed Wilcoxon rank sum test) (figur 3A) . Vi analyserte alle ordene i lengde 5-7 for overrepresentasjon i nedregulert mRNA etter MIR-146a transfeksjon og funnet ordet sterkest korrelert med nedregule var frøet nettstedet komplementær til modne MIR-146a baser 2-7 /8 ( Figur 3B). Transkripsjoner med spådd 3'UTR MIR-146a målse som var signifikant nedregulert på MIR-146a transfeksjon ble ansett som potensielle direkte MIR-146a mål. 847 matchet disse kriteriene (Tilleggs fil1: Tabell S5). De 10 mest nedregulert potensielle Mir-146a mål er vist i figur 3C. Som en negativ validering kontroll vi gjentok prosedyren behandling SNU638 celler med en MIR-146a LNA hemmer. Det var ingen signifikant oppregulering av gener med frøet området komplementær til modne MIR-146a baser (data ikke vist). Figur 3 Identifisering av MIR-146a mål. (A) Forut MIR-146a mål transkripsjoner er betydelig nedregulert etter MIR-146a transfeksjon forhold til uttrykte gener som ikke er spådd mål av MIR-146a (P < 4.6e-11, to-tailed Wilcoxon rank sum test) . (B) Topp 10 ord mest korrelert med nedregulering (korrelasjons Z-score er angitt til venstre for hvert ord, alle 10 ord har en estimert FDR < 1e-6). Store bokstaver markere miRNA frø regionen, Watson-Crick basepar (blå), mismatch (rød). Ordet sterkest korrelert med nedregule var frøet nettstedet komplementær til modne miRNA baser 2-7 /8. (C) transkripsjoner, har 6mer eller 7mer MIR-146a frø steder i 3'UTR, som er mest nedregulert på MIR-146a transfeksjon vises. Disse er potensielle direkte MIR-146a mål. Ekspresjon er gitt i log2 ganger endring. De 3'UTR 6 m /7 m Søylene viser antall 6- eller 7mer MIR-146a frø steder i 3'UTR.
De tre mest nedregulert gener ved MIR-146a over-uttrykk, IRAK1, caspase rekruttering domene som inneholder protein 10 (CARD10) og COP9 konstituerende photomorphogenic homolog subenheten 8 (COPS8) (figur 3C) tilhører alle signalveier som fører til NF-kB aktivering [27-29]. IRAK1 er en kjent MIR-146a mål involvert i TLR- og IL-1R-mediert aktivering av NF-kB [16-18]. CARD10 er involvert i GPCR-mediert aktivering av NF-kB [27], mens COPS8 er antatt å være involvert i denne veien basert på dets involvering i T-cellereseptoren (TCR) -mediert NF-kB-aktivering [28]. Overraskende, men i likhet med resultatene av Boldin et al.
[30], ekspresjon av TRAF6, som tidligere har blitt beskrevet som en MIR-146a target [16, 18, 31], ble ikke redusert på transkripsjonsnivået etter MIR-146a over-uttrykk i vårt modellsystem.
i magekreft, modulerer NF-kB celle overlevelse, immunitet og betennelse, og NF-kB aktivering er assosiert med dårlig utfall i magekreft [32, 33]. Vi fokuserte derfor på å karakterisere CARD10 og COPS8 som direkte MIR-146a mål og deres roller i NF-kB aktivering i magekreft. Vi har bekreftet MIR-146a-mediert nedregulering av CARD10, COPS8 og IRAK1 ved transkripsjon nivå (figur 4A), og også funnet at MIR-146a reduserte nivåer av CARD10, COPS8 og IRAK1 protein (figur 4B). Til slutt ble direkte målretting av MIR-146a til 3'UTRs av målgener demonstrert ved hjelp av luciferase analyser (Figur 4C). Oppsummert, vi bekreftet tidligere observasjoner som viser at Mir-146a rettet direkte IRAK1 og vi dessuten identifisert to nye mål, CARD10 og COPS8, som koder for proteiner foreslåtte å være involvert i NF-kB aktivering. COPS8 er en komponent av COP9 signalosome som består av åtte subenheter (GPS1 og COPS2-8) [34]. COPS8 er den eneste subenheten rettet direkte ved MIR-146, men ettersom forandring i mengden av de enkelte underenheter har vist seg å påvirke mengden av andre subenheter [35, 36], undersøkte vi hvordan transfeksjon med MIR-146a påvirkes ekspresjon av alle COP9 signalosome komponenter. I ikke-stimulerte celler ekspresjon av COPS2 ble redusert (20%) (Tilleggs fil1: Fig S5). Vi vil derfor anta at effekten av MIR-146a på COP9 komplekset hovedsakelig skyldes en reduksjon i COPS8 uttrykk, selv om indirekte destabilisering av komplekset ikke kan utelukkes. Figur 4 CARD10 og COPS8 er direkte MIR-146a mål. (A) mRNA uttrykk av de to nye MIR-146a mål, CARD10 og COPS8, og IRAK1, en kjent miR_146a målet, ble bestemt av qPCR i kontroll- og MIR-146a-transfektert SNU638 celler. Uttrykk for hver transkripsjon er vist i forhold til uttrykk i kontroll-transfekterte celler. CARD10, COPS8 og IRAK1 uttrykk ble nedregulert følgende MIR-146a over-uttrykk. Data er vist som gjennomsnitt ± S.D. av fire biologiske replikater. * = P < 0,05, ** = P < 0.01, *** = P < 0,001. (B) MIR-146a transfeksjon også redusert proteinnivå CARD10, COPS8 og IRAK1 i MIR-146a-transfekterte SNU638 celler. Ekspresjonen av hvert protein er vist i forhold til ekspresjon i kontroll-transfekterte celler. Bånd ble kvantifisert i forhold til p-aktin. Data er vist som gjennomsnitt ± S.D. av fire biologiske replikater. * = P < 0,05, ** = P < 0.01, *** = P < 0,001. (C) Verifikasjon av direkte og funksjonelle mål bindende bruker luciferasepreparater konstruksjoner som holder WT 3'UTRs og muterte (Mut) 3'UTRs (sentral 4 nucleotide ble erstattet i MIR-146a bindingssetet) for CARD10, COPS8 og IRAK1. Konstruksjoner som inneholder enten WT eller muterte (Mut) 3'UTRs nedstrøms til ildflue luciferase genet ble ko-transfektert inn HEK293 celler sammen med Renilla luciferase kontroll plasmid og enten MIR-146a eller kontroll (Siglo). Venstre, luciferase aktiviteten er gitt i forhold til aktiviteten i kontroll-transfekterte celler. MIR-146a redusert luciferase aktivitet av konstruksjoner med WT CARD10, COPS8 og IRAK1 3'UTRs. Høyre, er sekvenssammenstillinger av MIR-146a og potensial WT og Mut 3'UTR målse vist, muterte basene er vist i rødt. Data er vist som gjennomsnitt ± S.D. ofte biologiske replikat. *** = P < 0,001. Sekvenssammenstillinger er tilpasset fra DIANALab (2009).
MIR-146a hemmer GPCR-mediert NF-kB aktivitet ved å målrette CARD10 og COPS8
CARD10 og COPS8 er involvert i GPCR-mediert aktivering av NF-kB [28, 29 ]. Vi ønsket derfor å etablere sine roller i signaloverføring i magekreft og senere undersøke betydningen av MIR-146a for å hemme dette signalering. For dette formål brukte vi lysophosphatiditc syre (LPA), som er en kjent aktivator av GPCR-formidlede NF-kB-aktivering veien [29], og fremmer magekreft cellemigrering og invasjon [37]. LPA-stiumlation økte betydelig NF-kB aktivitet i luciferase-rapportørsystem (figur 5). siRNA knockdown av CARD10 og COPS8 uttrykk inhiberte signifikant LPA-stimulerte GPCR-mediert aktivering av NF-kB i SNU638 celler (Figur 5). Denne hemmingen var sammenlignbar med MIR-146a-indusert hemming. I kontrast, hemme endogen MIR-146a var uten effekt på NF-kB aktivering. Som forutsagt, siRNA-mediert represjon av IRAK1 uttrykk ikke påvirke LPA-stimulerte aktivering av NF-kB (figur 5) som IRAK1 ikke er involvert GPCR-mediert reaksjonsvei. Som TRAF6 er en MIR-146a target med en rolle i NF-kB-aktivering, ble effekten av siRNA-mediert represjon av TRAF6 uttrykk på LPA-stimulerte NF-kB aktivitet undersøkt. Imidlertid knockdown av TRAF6 hemmet ikke LPA-stimulert NF-kB aktivitet (figur 5). Disse resultatene indikerer at de to nylig identifiserte MIR-146a mål, CARD10 og COPS8, er involvert i GPCR-mediert aktivering av NF-kB. Derfor ble effekten av MIR-146a over-uttrykk på LPA-stimulert NF-kB aktivitet undersøkt. MIR-146a hemmet signifikant LPA-stimulert NF-kB aktivitet i SNU638 celler (figur 5). En blanding av siRNAs mot CARD10, COPS8, IRAK1 og TRAF6 etterlignet MIR-146a-mediert hemming av NF-kB aktivitet (figur 5). Knockdown av to andre COP9 komponenter (COPS2 og COPS5) inhiberte også den LPA-stimulerte NF-kB aktivitet, noe som viser viktigheten av tilstedeværelsen av alle COP9 signalosome subenheter for LPA-stimulerte aktivering av NF-kB. qPCR av ekspresjonen av de forskjellige komponentene som ble undersøkt bekreftet knockdown (figur 5). Figur 5 MIR-146a mål COPS8 og CARD10 GPCR-mediert NF-kB aktivering. SNU638 celler ble ko-transfektert med NF-kB reporter plasmid og Renilla luciferase kontroll plasmid sammen med kontroll (Siglo), siRNA eller MIR-146a. Celler ble stimulert med 25 pM LPA og luciferaseaktivitet ble målt. Luciferase-aktivitet er gitt i forhold til aktiviteten i kontroll transfektert LPA-stimulerte celler. siRNA mot CARD10 og COPS8, MIR-146a, MIR-146a hemmer og en siRNA blanding redusert luciferase aktivitet. siRNA mot IRAK1 og TRAF6 ikke redusere luciferase aktivitet. LPA-stimulerte NF-kB-aktivering ble også inhibert av siRNA mot COPS2 og COPS5, viser at annen forstyrrelse av COP9 signalosome komplekset reduserer GPCR-formidlede NF-kB-aktivering. siMix, blanding av siRNAs mot CARD10, COPS8, IRAK1 og TRAF6. Data er vist som gjennomsnitt ± S.D. av syv biologiske replikat * = P <.; 0,05. Den relative uttrykk for TRAF6, COPS8, IRAK1, CARD10, COPS2 og COPS5 ble målt ved hjelp av qPCR. Gray-skyggelegging indikerer en betydelig endring i uttrykket, p < 0,05, n = 4.
uttrykk for MIR-146a er delvis styrt av NF-kB. Vi har derfor også testet hvordan uttrykket av MIR-146a ble påvirket av LPA og IL-1β stimulering. Vi fant ut at LPA behandling doblet uttrykket av MIR-146a og IL-1β stimulering ga en 4 ganger økning i MIR-146a uttrykk, som kan sammenlignes med tidligere observasjoner [16, 38] (Tilleggs fil1: Figur S6). Selv MIR-146a LNA økt uttrykk av tre av de MIR-146a mål (TRAF6, IRAK1 og CARD10) (figur 5) den totale aktivering av NF-kB ble ikke endret på LPA-stimulerte MIR-146a LNA behandlet SNU638 celler.
MIR-146a reduserer LPA-indusert ekspresjon av cytokiner og vekstfaktorer
i de fleste karsinomer microenvironmental faktorer i stedet for genetiske endringer er sannsynligvis ansvarlig for aktivering av NF-kB-signalering som regulerer en rekke prosesser, inkludert sekresjon av vekstfaktorer og cytokiner [39, 40]. Derfor, undersøkte vi hvordan MIR-146a modulerer ekspresjon av utvalgte NF-kB-regulerte vekstfaktorer og cytokiner indusert av ekstracellulære signaler slik som LPA. LPA-stimulering signifikant økt ekspresjon av interleukin-6, -8, 23A (IL-6, IL-8, IL-23A) og kjemokin (CC motiv) ligand 5 (CCL5), kolonistimulerende faktor 1 (makrofag) (CSF- 1) og blodplateavledet vekstfaktor beta polypeptid (PDGFB) i SNU638-celler (figur 6). Dette bekreftet at ekspresjon av disse genene reguleres av LPA-indusert NF-kB aktivitet. Over-ekspresjon av MIR-146a reduserte signifikant ekspresjon av IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 og PDGFB i SNU638 celler (figur 6). Selv om IL-6 er et målgen av NF-kB, og også oppregulert ved LPA MIR-146a over-ekspresjon ikke redusere IL-6-ekspresjon i henhold til våre betingelser (figur 6). Imidlertid er LPA induksjon av IL-6-ekspresjon ikke bare mediert av NF-kB, men også via andre veier (MAPK /ERK, PI3K /Akt, og p38) [41], som kan bidra til forskjellene. I SNU638 celler basalnivået av IL-6 er høyere enn IL-8, noe som kan påvirke mRNA omsetning. Dette kan være en del av grunnen til at MIR-146a har mindre effekt på LPA-stimulerte IL-6 uttrykk enn på IL-8 uttrykk, som også har blitt sett i andre cellulære systemer [42]. Figur 6 MIR-146a hemmer LPA-indusert cytokin uttrykk. 25 uM LPA ble anvendt for å indusere cytokin ekspresjon fra humane gastriske karsinomer SNU638 celler. LPA betydelig forbedret ekspresjon av IL-6, IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 og PDGFB, som ble målt ved anvendelse av qPCR og vist i forhold til ekspresjonsnivået i ubehandlede kontrollceller. Dette svaret er redusert i MIR-146a-transfekterte celler. Data er vist som gjennomsnitt ± standardavvik, n = 4, * = P < 0.05, ns = ikke signifikant.
MIR-146a over-uttrykk i SNU638 cellene reduserer rekruttering av monocytter
I karsinomer monocytter kan rekrutteres ved f.eks CCL5 og CSF-1 uttrykkes av tumorceller, og denne svulsten infiltrasjon av monocytter bidrar til tumorfremmende inflammatorisk respons i kreft [39, 40]. Etter å ha vist at Mir-146a redusert LPA-indusert ekspresjon av cytokiner, undersøkte vi hvordan MIR-146a over-uttrykk påvirket rekruttering av monocytter. Vi fant at LPA-behandling av SNU638 celler øket monocytt vandring mot kondisjonert medium fra de SNU638 celler (Figur 7 og Tilleggs fil1: Fig S7), mens transfeksjon med MIR-146a delvis opphevet denne respons (fig 7), som igjen viser at mir -146a hemmer de biologiske reaksjoner fra GPCR-mediert aktivering av NF-kB eksempel, rekruttering av monocytter. Figur 7 MIR-146a reduserer monocytt migrasjon. Monocyte migrasjon mot kondisjonert medium fra kontroll- eller MIR-146a-transfektert SNU638 celler som ble etterlatt ubehandlet eller stimulert med 25 mikrometer LPA ble fulgt over 8 timer. Migrering av celler er vist i forhold til migrering av ubehandlede kontrollceller. Monocyte migrasjon mot mediet fra LPA-stimulerte SNU638 celler ble økt i forhold til migrasjon mot medium fra ubehandlede celler, mens monocytter migrasjon mot mediet fra MIR-146a-transfektert ble LPA-stimulerte celler ble redusert sammenlignet med medium fra kontroll-transfektert, LPA-stimulert celler. Data er vist som gjennomsnitt ± S.D. av fire biologiske replikater. ** = P < 0,01, ns = ikke signifikant.
Diskusjon
Microenvironmental faktorer er viktige for NF-kB-aktivering i inflammasjons drevne kreftformer som magekreft og dette NF-kB-aktivering kan gi kreftceller med fordeler, som bidrar til virusets tumorgene styrke fremgangsmåter [32, 43]. Modulering av NF-kB-aktivering signalering er derfor viktig for å kontrollere inflammasjon-mediert tumorutvikling. Her viser vi at MIR-146a er en sentral negativ regulator av NF-kB aktivering som det hemmer flere NF-kB-aktiverende veier.
MIR-146a uttrykk ble funnet oppregulert i app. 2/3 av de humane gastriske adenokarsinomer, så vel som i den gastrin KO mus modell av magekreft. Tilsvarende uttrykk for MIR-146a er funnet økt i cervical, bryst, bukspyttkjertel og skjoldbruskkjertelkreft [11, 44-46]. Tidligere uttrykk for MIR-146a har blitt funnet både opp- og ned-regulert i magekreft [21-24]. Disse motstridende resultatene kan gjenspeile forskjeller i svulster og deres mikromiljø som resulterer i ulike grader av NF-kB aktiviteter, som kontrollerer MIR-146a uttrykk [16]. Overraskende, har vi funnet lave nivåer av MIR-146a i humane mage kreft cellelinjer. Dette kan tyde på at de økte MIR-146a nivåer sett i svulster er rant av microenvironmental faktorer f.eks Cellene som omgir kreftceller.
For å undersøke effekten av økte MIR-146a nivået i magekreft vi identifiserte to nye MIR-146a mål, CARD10 og COPS8, og undersøkt rollene til disse målene. Vi fant ut at Mir-146a hemmet GPCR-mediert NF-kB aktivering av direkte målretting og nedregulere uttrykk for CARD10 og COPS8. CARD10 er kjent for å være nødvendig for GPCR-indusert aktivering av NF-kB [27, 29], mens COPS8 er en subenhet av COP9 signalosome som styrer NF-kB-aktivering [28, 47]. Vi viste at CARD10 er involvert i GPCR-mediert aktivering av NF-kB, og gitt nye bevis på at COPS8 er involvert i denne veien også. MIR-146a over-uttrykk førte også til redusert uttrykk for COPS2, en annen underenhet av COP9 signalosome. Vi antar at dette er en indirekte effekt, siden det ikke er MIR-146a bindingssete i COPS2 3'UTR og endringer i ekspresjonen av en subenhet har vist seg å påvirke den til den andre [35, 36]. Det er derfor mulig at MIR-146a til en viss grad kan opptre ved ikke bare rettet mot COPS8 men destabiliserende COP9 signalosome.
Aberrant signal gjennom GPCRs har vært knyttet til tumorcellevekst og overlevelse, og NF-kB-aktive GPCRs har vært vist seg å bidra til et bredt spekter av cancere (gjennomgått av Dorsam &Co. Gutkind [48]). GPCR kan aktivere NF-kB via
CARD10 /BCL10 /malt1 komplekset etter bindende ligander som LPA, enothelin-1, angiotensin II (Ang II) og kjemokin (CXC motiv) ligand 12 (CXCL12) (figur 8) [ ,,,0],29, 49]. I vår studie har vi brukt LPA å modellere GPCR-mediert aktivering av NF-kB. LPA-indusert GPCR-signalering fører til tumorprogresjon [49]. Dermed kunne MIR-146a-mediert hemming av GPCR-signale har svulst undertrykke effekter. Figur 8 MIR-146a mål flere NF-kB aktivering veier. Skjematisk illustrasjon av NF-kB-aktiverende veier. MIR-146a har tidligere vist seg å målrette IRAK1 og TRAF6 og i denne studien viser vi at Mir-146a rettet CARD10 og COPS8. MIR-146a mål er merket med røde sirkler.
I tillegg til GPCR-mediert NF-kB aktivering, kan NF-kB aktiveres via
tumor-nekrose-faktor reseptor (TNFR), IL-1R, TLR, TCR og B-celle-reseptoren (BCR) [50] (figur 8). Tidligere har MIR-146a blitt vist å inhibere NF-kB-aktivering via
disse reseptorene ved å nedregulere ekspresjon av TRAF6 og IRAK1 [16, 18, 30, 31]. MIR-146a rettet IRAK1 i magekreftceller, men ikke TRAF6. Selv om vi her viser at MIR-146a er rettet mot GPCR-mediert aktivering av NF-kB, i tillegg til aktivering via
TNFR, IL-1 R, TLR, TCR og BCR, ved å målrette CARD10 og COPS8 (figur 8). Dermed rettet MIR-146a flere komponenter av NF-kB-aktivering pathways i mage kreftceller. Dette har ikke blitt vist for NF-kB svei før, men har tidligere blitt sett i den transformerende vekstfaktor-β (TGF-β) vei, hvor både MIR-21 og MIR-17-92 target klynge flere mRNA som koder for proteinene i TGF-β veien [51, 52]. Ved å målrette flere komponenter av forskjellig NF-kB-aktivering trasé MIR-146a formidler en robust og kompleks styring av NF-kB aktivitet. Flere andre mirnas kan også regulere NF-kB-signalering, men bare MIR-146a mål flere gener i ulike NF-kB-aktiverende veier, noe som tyder på MIR-146a som en viktig modulator av NF-kB aktivering.
NF-kB regulerer ekspresjon av cytokiner og vekstfaktorer som er involvert i flere aspekter av tumorprogresjon [43]. Gitt at MIR-146a reduserer NF-kB aktivitet, er det mulig at MIR-146a virker undertrykkende tumor ved å redusere ekspresjon av slike cytokiner og vekstfaktorer. Faktisk fant vi at Mir-146a over-uttrykk redusert uttrykk av flere cytokiner og vekstfaktorer med en kjent rolle i kreftutvikling; IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 og PDGFB. Disse genene kan øke celleproliferasjon, celleadhesjon og angiogenese [53-55], bidrar til tumor lymphangiogenesis [56], aktiverer fibroblaster [57], rekruttere monocytter til svulster [39, 40] og induserer tumorassosierte makrofager (TAM) til skiller tumor-fremme meklere [58] (figur 9). Figur 9 Biologiske prosesser i mage kreftceller hemmes av MIR-146a. Venstre panel, MIR-146a rettet direkte IRAK1, CARD10 og COPS8 i SNU638 celler. Dette fører til inhibisjon av NF-kB-aktivering og følgelig undertrykket ekspresjon av NF-kB-regulerte cytokiner og vekstfaktorer. Uttrykk av MIR-146a er også regulert av NF-kB [16]. Høyre panel, MIR-146a reduserer ekspresjon av CCL5, CSF-1, IL-8, PDGF og IL-23A, som er involvert i monocytt migrering og differensiering, proliferasjon, angiogenese, lymphangiogenesis og fibroblast og makrofag vekstfaktor frigivelse. Dermed kan MIR-146a fungere som en tumor suppressor ved å redusere kreftfremmende effekten av NF-kB aktivitet.
Kjemotaktiske cytokiner utgitt av kreftceller kan rekruttere monocytter til kreft nettsteder [39, 59]. Disse monocytter kan fremme tumorprogresjon [60]. CCL5 og CSF-1 er eksempler på monocytter-rekruttere cytokiner utgitt av kreftceller [39, 40]. Som forventet, monocytter migrert mindre mot kondisjonert medium fra LPA-stimulerte SNU638 celler over-uttrykker Mir-146a i forhold til LPA-stimulerte kontrollceller. Figur S2. Figur S3. Figur S4. Figur S5. Figur S6. 0,05. Alle forfattere lese og godkjent den endelige manuskriptet.

• Samtidig overekspresjon av serum p53 mutasjon beslektet med Helicobacter pylori infeksjon
• Intraneural metastasering av magekreft fører til isjiasnerven parese