microRNA-146a inhiberer G-protein-koblet receptor-medieret aktivering af NF-KB ved at målrette CARD10 og COPS8 i gastrisk cancer

microRNA-146a hæmmer G-protein-koblet receptor-medieret aktivering af NF-KB ved at målrette CARD10 og COPS8 i mavekræft
Abstract
Baggrund
mavekræft er den næsthyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i verden. Inflammatoriske signaler stammer fra gastriske kræftceller er vigtige for at rekruttere inflammatoriske celler og regulering af metastaser af mavekræft. Flere microRNA (miRNA) har vist sig at være involveret i udvikling og progression af mavekræft. miRNA-146a (miR-146a) er en modulator af inflammatoriske signaler, men lidt er kendt om dens betydning i mavekræft. Vi ønskede derfor at identificere mål af miR-146a i gastrisk kræft og undersøge sine biologiske roller.
Resultater
udtryk for miR-146a blev vurderet ved kvantitativ PCR (qPCR) og fundet opreguleret i gastrin knockout-mus , en musemodel af mavekræft, og i 73% af undersøgte humane gastriske adenokarcinomer. Ekspression af MIR-146a ved gastrisk cancerceller blev bekræftet ved in situ
hybridisering. Global analyse af ændringer i mRNA-niveauer efter miR-146a transfektion identificeret to udskrifter, caspase rekruttering domæne-holdigt protein 10 (CARD10) og COP9 signalosom kompleks underenhed 8 (COPS8), som nye miR-146a mål. qPCR, Western blotting og luciferaseassays bekræftede disse transkripter som direkte MIR-146a mål. CARD10 og COPS8 viste sig at være en del af G-protein-koblet receptor (GPCR) vej af nuklear faktor-kappaB (NF-kappaB) aktivering. Lysophosphatidsyre (LPA) inducerer NF-kappaB aktivering via
denne vej og over-ekspression af MIR-146a hæmmede LPA-induceret NF-kappaB-aktivering, reduceres LPA-induceret ekspression af tumor-fremmende cytokiner og vækstfaktorer og hæmmede monocyt tiltrækning .
konklusioner
mIR-146a-ekspression opreguleres i et flertal af gastriske cancere, hvor det mål CARD10 og COPS8, inhibering GPCR-medieret aktivering af NF-kappaB og dermed reducere ekspression af NF-kappaB-reguleret tumor- fremme cytokiner og vækstfaktorer. Ved at målrette dele af flere NF-kappaB-aktiverende veje, miR-146a er et centralt element i reguleringen af ​​NF-kappaB aktivitet.
Nøgleord
Mavekræft Ikke-kodning RNA Cytokiner Baggrund
Globalt mavekræft er den næsthyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald [1]. Udvikling af gastrisk cancer påvirkes af interaktioner mellem værten, miljømæssige og bakterielle faktorer. Eksempler på synergistiske risikofaktorer for mavekræft er polymorfier i gener involveret i værtens inflammatoriske respons [2], Helicobacter pylori
(H. pylori
) virulensfaktorer [3] og kost rig på salt og nitrat [4] . Trods nylige fremskridt i påvisning og behandling af tidlig mavekræft, den langsigtede overlevelse for avanceret mavekræft er lav [5]. De største udfordringer i behandlingen af ​​fremskreden mavekræft er lymfe, peritoneal eller fjernt organ metastaser, der samtidig forudsiger dårligt resultat for disse patienter [6].
Selvom mange onkogener og tumor undertrykkere er blevet rapporteret at være involveret i udviklingen af ​​gastriske carcinomer , de molekylære mekanismer, der ligger metastase af avancerede gastriske carcinomer stadig dårligt forstået [7]. Et af de vigtigste begivenheder i gastrisk carcinogenese er betændelse. Inflammation fører til aktivering af transskription faktor nukleare faktor-kappaB (NF-KB), som er forbundet med gastrisk carcinogenese [8, 9].
MicroRNA (miRNA) er involveret i udviklingen og progressionen af ​​gastrisk kræft [10- 13]. miRNA er en klasse af endogen, ikke-kodende, enkeltstrengede RNA-molekyler af app. 22 nukleotider der medierer post-transkriptionel regulering af genekspression gennem baseparring med den 3'-utranslaterede region (UTR) af mål-messenger-RNA (mRNA) [14]. miRNA er involveret i reguleringen af ​​de fleste cellulære processer, herunder celleproliferation, migration, differentiering og apoptose [10, 14, 15]. miRNA er aberrerende udtrykt i de fleste humane cancere og ligesom proteinkodende gener, kan miRNA fungere som enten tumorsuppressorer eller onkogener, for derved at regulere carcinogenese [10, 12]. miRNA-146a (MIR-146a) reguleres af NF-KB og inhiberer interleukin-1 receptor (IL-1R) og toll-like receptor (TLR) - induceret aktivering af NF-KB ved at målrette interleukin-1-receptor-associeret kinase 1 (IRAK1) og TNF-receptor associeret faktor 6 (TRAF6) [16-18]. MIR-146a er blevet rapporteret udtrykkes afvigende i flere inflammatoriske sygdomme og cancere, men er stadig kontroversiel rolle MIR-146a i gastrisk cancer, som ekspression af MIR-146a er fundet både op- og nedreguleres her [19-24 ]. Derfor undersøgte vi ekspressionen af ​​miR-146a i mavekræft og karakteriseret sine mål og molekylære funktioner til at afklare de modstridende resultater.
Vi fandt, at miR-146a er opreguleret i en musemodel af mavekræft samt i humane gastriske adenokarcinomer og identificeret CARD10 og COPS8 som nye direkte mål for miR-146a. Begge er en del af G-protein-koblede receptorer (GPCR) -medieret signaltransduktion som medierer aktiveringen af ​​NF-KB. Dette antyder, at MIR-146a virker tumor undertrykke ved at hæmme GPCR-medieret aktivering af NF-KB og den resulterende ekspression af tumor-fremmende cytokiner og vækstfaktorer.
Resultater Salg MIR-146a-ekspression opreguleres i en mus model af gastrisk cancer og i humane gastriske adenokarcinomer Salg Gastrin knockout (KO) mus er achlorhydric og udvikle intestinal metaplasi og gastriske adenomer med tiden [25]. Brug kvantitativ PCR (qPCR) fandt vi ekspressionen af ​​miR-146a app. 2-fold opreguleret i gamle gastrin KO-mus med enten fundiske intestinal metaplasi eller antral adenom sammenlignet med ekspression i vildtype (WT) mus (P < 0,05) (figur 1A). Anvendelse af in situ hybridisering
MIR-146a blev påvist i metaplastisk gastriske væv fra gastrin KO-mus, men ikke i normalt gastrisk væv fra WT mus (figur 2AB) (Yderligere file1: Figur S1). Efter at have konstateret, at miR-146a er steget i vores musemodel af mavekræft vi undersøgte udtryk for miR-146a i parrede humane gastriske adenokarcinomer og tilstødende kontrol biopsier og fandt, at det var opreguleret i 27 ud af 37 tilfælde (73%) ( Figur 1B). In situ hybridisering
viste, at MIR-146a blev udtrykt af humane gastriske adenocarcinomceller, mens MIR-146a-positive celler ikke blev påvist i normal gastrisk mucosa (fig 2CD) (Yderligere file1: Figur S1). Figur 1 Øget ekspression af miR-146a i gastrin KO mus mavekræft model og human mavekræft. (A) Den relative ekspression af MIR-146a i metaplastisk fundiske væv (n = 8) og hyperplastiske antral mucosa (n = 4) /antrale adenomer (n = 4) fra gastrin knockout (KO) mus sammenlignet med den gennemsnitlige ekspression i matching vildtype (WT) musevæv. * = P < 0,05. (B) vandfaldsdiagram af ekspressionen af ​​MIR-146a i 37 humane gastriske adenokarcinomer i forhold til ekspression i tilstødende normale væv. MIR-146a blev opreguleret i 27 ud af 37 tumorer (73%). Ekspressionsniveauerne af MIR-146a blev bestemt ved qPCR og normaliseret til dem i den endogene kontrol RNU44.
Figur 2 In situ-hybridisering påvisning af MIR-146a ekspression i gastrin KO mus mavekræft model og human gastrisk cancer. (A) Ekspression af MIR-146a blev ikke påvist i WT fundiske musevæv, (B), mens MIR-146a-positive celler (blå kerner) blev påvist i metaplastisk fundiske væv fra gastrin KO-mus. (C) Intet signal blev påvist med scrambled LNA sonden. (D) MIR-146a-ekspression var til stede i normalt humant gastrisk væv, (E), men til stede i humane gastrisk adenocarcinom-celler (blå kerner). (F) Negativ kontrol under anvendelse af en krypteret LNA sonde. Repræsentative MIR-146a-positive celler er angivet med pile. Original forstørrelse x20, Scale bar = 100 um.
Der var ingen sammenhæng mellem miR-146a udtryk i gastrisk adenokarcinomer og patienter 'alder, køn og lokalisering eller klassificering af tumorer (data ikke vist). Selv patienter med højt miR-146a udtryk syntes at have en bedre samlet overlevelse var dette ikke signifikant. (Yderligere file1: Figur S2)
miR-146a mål medlemmer af GPCR-medieret NF-KB-aktivering pathway
have demonstreret forøget ekspression af miR-146a i størstedelen af ​​gastrisk kræft, ønskede vi at etablere de biologiske virkninger af miR-146a ved at karakterisere sine direkte molekylære mål i human gastrisk cancer. Vi ønskede at gøre dette ved at over-udtrykkende miR-146a i gastriske kræftceller og derefter identificere mRNA med reduceret udtryk [26]. Derfor undersøgte vi MIR-146a ekspression i et panel af cellelinier og fundet varieret, men overraskende lav ekspression af MIR-146a i de tilgængelige gastriske cellelinjer (Yderligere file1: Fig S3) overvejer den detekterede overekspression i tumorer <. br> Den menneskelige mavekræft cellelinje SNU638, som har ubetydelig niveauer af endogen miR-146a blev fundet egnet til miR-146a overekspression undersøgelser. Siden miR-146a udtryk var meget lav i de testede gastrisk cellelinier miR-146a hæmning undersøgelserne ikke er blevet foretaget.
Vi først testet, hvis overekspression af miR-146a påvirkede væksten af ​​SNU638 celler og fundet cellevækst upåvirket ( yderligere file1: Figur S4). Efterfølgende blev de globale ændringer i genekspression i SNU638 celler efter overekspression af miR-146a undersøgt. Efter miR-146a transfektion mRNA med forudsagte 3'UTR miR-146a målsteder var signifikant nedreguleret i forhold til mRNA uden forudsagte mål sites (P < 4.6e-11, to-halet Wilcoxon rank-sum test) (figur 3A) . Vi analyserede alle ord længde 5-7 til overrepræsentation i ned-regulerede mRNA efter miR-146a transfektion og fandt ordet stærkest korreleret med nedregulering var stedet frø komplementære til modne miR-146a baser 2-7 /8 ( Figur 3B). Udskrifter med forudsagte 3'UTR miR-146a mål websteder, der var betydeligt nedreguleret på miR-146a transfektion blev betragtet som potentielle direkte miR-146a mål. 847 matchede disse kriterier (Ekstra file1: Tabel S5). De øverste 10 mest nedreguleret potentielle miR-146a mål er vist i figur 3C. Som en negativ validering kontrol gentog vi proceduren behandle SNU638 celler med et miR-146a LNA-hæmmer. Der var ingen signifikant opregulering af gener med frøet stedet komplementær til modne MIR-146a baser (data ikke vist). Figur 3 Identifikation af MIR-146a mål. (A) Predicted miR-146a mål udskrifter er betydeligt nedreguleret efter miR-146a transfektion sammenlignet udtrykte gener, der ikke er forudsagt mål for miR-146a (P < 4.6e-11, to-halet Wilcoxon rank-sum test) . (B) Top 10 ord mest korreleret med nedregulering (korrelation Z-scores er angivet til venstre for hvert ord, alle 10 ord har en anslået FDR < 1e-6). Store bogstaver fremhæve miRNA frø region, Watson-Crick basepar (blå), misforholdet (rød). Ordet stærkeste korreleret med nedregulering var frøet stedet supplerer modne miRNA baserne 2-7 /8. (C) Udskrifter, der har 6mer eller 7mer miR-146a frø steder i 3'UTR, der er mest nedreguleret på miR-146a transfektion vises. Disse er potentielle direkte MIR-146a mål. Ekspression er givet i log2 gange ændring. 3'UTR 6 m /7 m kolonner angiver antallet af 6- eller 7mer miR-146a frø steder i 3'UTR.
De tre mest ned-regulerede gener upon miR-146a overekspression, IRAK1, caspase rekruttering domæne-holdigt protein 10 (CARD10) og COP9 konstitutive photomorphogenic homolog subunit 8 (COPS8) (figur 3C) tilhører alle signalveje, der fører til NF-KB-aktivering [27-29]. IRAK1 er et kendt MIR-146a target involveret i TLR- og IL-1R-medieret aktivering af NF-KB [16-18]. CARD10 er involveret i GPCR-medieret aktivering af NF-KB [27], mens COPS8 menes at være involveret i denne vej baseret på dens engagement i T-celle-receptor (TCR) -medieret NF-KB-aktivering [28]. Overraskende, men magen til resultaterne af Boldin et al.
[30], ekspression af TRAF6, som tidligere er blevet beskrevet som en MIR-146a target [16, 18, 31], blev ikke reduceret på det transskriptionelle niveau efter miR-146a overekspression i vores model-system. Salg In mavekræft, NF-KB-modulerer celle overlevelse, immunitet og inflammation, og NF-KB-aktivering er forbundet med dårligt resultat i gastrisk kræft [32, 33]. Vi fokuserede derfor på at karakterisere CARD10 og COPS8 som direkte miR-146a mål og deres roller i NF-KB-aktivering i mavekræft. Vi bekræftede MIR-146a-medieret nedregulering af CARD10, COPS8 og IRAK1 på transkriptet niveau (figur 4A) og fandt også, at MIR-146a reducerede niveauer af CARD10, COPS8 og IRAK1 protein (figur 4B). Endelig blev direkte målretning af miR-146a til 3'UTRs af målgener demonstreret ved hjælp luciferaseassays (Figur 4C). Sammenfattende vi bekræftede tidligere observationer viser, at miR-146a direkte henvender IRAK1 og vi desuden identificeret to nye mål, CARD10 og COPS8, som koder for proteiner foreslået at være involveret i NF-KB-aktivering. COPS8 er en bestanddel af COP9 signalosom som består af otte underenheder (GPS1 og COPS2-8) [34]. COPS8 er den eneste underenhed rettet direkte af miR-146, men da ændring i mængden af ​​de enkelte underenheder har vist sig at påvirke mængden af ​​andre underenheder [35, 36], vi undersøgt, hvordan transfektion med miR-146a påvirket udtryk for alle COP9 signalosom komponenter. I ustimulerede celler ekspressionen af ​​COPS2 blev reduceret (20%) (Yderligere file1: Figur S5). Vi antager derfor, at virkningerne af miR-146a på COP9 komplekse primært skyldes en reduktion i COPS8 udtryk, selv indirekte destabilisering af komplekset ikke kan udelukkes. Figur 4 CARD10 og COPS8 er direkte miR-146a mål. (A) mRNA-ekspression af de to nye mål MIR-146a, CARD10 og COPS8, og IRAK1, en kendt miR_146a mål, blev bestemt ved qPCR i styre- og MIR-146a-transficerede SNU638 celler. Ekspression af hvert transkript er vist i forhold til ekspression i kontrol-transficerede celler. CARD10, COPS8 og IRAK1 ekspression blev nedreguleret efter miR-146a overekspression. Data er vist som middelværdi ± S.D. af fire biologiske replikater. * = P < 0,05, ** = P < 0,01, *** = P < 0,001. (B) miR-146a transfektion reducerede også protein niveauer af CARD10, COPS8 og IRAK1 i miR-146a-transfekterede SNU638 celler. Ekspressionen af ​​hvert protein er vist i forhold til ekspression i kontrol-transficerede celler. Bånd blev kvantificeret i forhold til p-actin. Data er vist som middelværdi ± S.D. af fire biologiske replikater. * = P < 0,05, ** = P < 0,01, *** = P < 0,001. (C) Verifikation af direkte og funktionel mål bindende hjælp luciferase konstruktioner holder WT 3'UTRs og muterede (Mut) 3'UTRs (den centrale 4 nukleotider blev udskiftet i miR-146a bindingssted) for CARD10, COPS8 og IRAK1. Konstruktioner indeholdende enten WT eller muterede (Mut) 3'UTRs nedstrøms til ildflue-luciferasegenet blev cotransficeret ind i HEK293-celler sammen med Renilla luciferase kontrol plasmid og enten MIR-146a eller kontrol (Siglo). Venstre, luciferaseaktivitet er givet i forhold til aktiviteten i kontrolceller-transficerede celler. MIR-146a reduceret luciferaseaktivitet af konstruktioner med WT CARD10, COPS8 og IRAK1 3'UTRs. Right, er sekvensopstillinger af miR-146a og potentiel WT og Mut 3'UTR målsteder vist, muterede baser er vist i rødt. Data er vist som middelværdi ± S.D. ofte biologiske gentagelser. *** = P < 0,001. Sekvensopstillinger er tilpasset fra DIANALab (2009).
MiR-146a hæmmer GPCR-medieret NF-KB-aktivitet ved at målrette CARD10 og COPS8
CARD10 og COPS8 er involveret i GPCR-medieret aktivering af NF-KB [28, 29 ]. Vi ønskede derfor at etablere deres roller i signaltransduktion i mavekræft og efterfølgende undersøge betydningen af ​​miR-146a til hæmning denne signalering. Til dette formål anvendte vi lysophosphatiditc acid (LPA), som er en kendt aktivator af GPCR-medieret NF-KB-aktivering pathway [29], og fremmer gastrisk cancer cellemigration og invasion [37]. LPA-stiumlation steg betydeligt NF-KB-aktivitet i vores luciferase reporter-system (figur 5). siRNA knockdown af CARD10 og COPS8 ekspression inhiberede signifikant LPA-stimuleret GPCR-medieret aktivering af NF-KB i SNU638 celler (figur 5). Denne inhibering var sammenlignelig med MIR-146a-induceret hæmning. I modsætning hertil inhiberer endogen MIR-146a var uden virkning på NF-KB-aktivering. Som forudsagt, siRNA-medieret repression af IRAK1 ekspression påvirkede ikke LPA-stimuleret aktivering af NF-KB (figur 5) som IRAK1 ikke er involveret GPCR-medieret vej. Som TRAF6 er en MIR-146a mål med en rolle i NF-KB-aktivering, blev virkningen af ​​siRNA-medieret repression af TRAF6 ekspression på LPA-stimuleret NF-KB-aktivitet undersøgt. Men knockdown af TRAF6 ikke inhiberer LPA-stimuleret NF-KB-aktivitet (figur 5). Disse resultater indikerer, at målene for to nyligt identificerede MIR-146a, CARD10 og COPS8, er involveret i GPCR-medieret aktivering af NF-KB. Derfor blev virkningen af ​​MIR-146a over-ekspression på LPA-stimuleret NF-KB-aktivitet undersøgt. MIR-146a inhiberede signifikant LPA-stimulerede NF-KB-aktivitet i SNU638 celler (figur 5). En blanding af siRNA'er mod CARD10, COPS8, IRAK1 og TRAF6 efterlignede MIR-146a-medieret inhibering af NF-KB-aktivitet (figur 5). Knockdown af to andre COP9 komponenter (COPS2 og COPS5) inhiberede også LPA-stimulerede NF-KB-aktivitet, hvilket viser betydningen af ​​tilstedeværelsen af ​​alle COP9 signalosom underenheder for LPA-stimuleret aktivering af NF-KB. qPCR af ekspressionen af ​​de forskellige komponenter undersøgte bekræftede knockdown (figur 5). Figur 5 MIR-146a mål COPS8 og CARD10 GPCR-medieret NF-KB-aktivering. SNU638 celler blev co-transficeret med NF-KB-reporterplasmid og Renilla luciferase kontrol plasmid sammen med kontrol (Siglo), siRNA eller MIR-146a. Celler blev stimuleret med 25 pM LPA og luciferaseaktivitet blev målt. Luciferaseaktivitet givet i forhold til aktiviteten i kontrol- transficerede LPA-stimulerede celler. siRNA mod CARD10 og COPS8, miR-146a, miR-146a-hæmmer og en siRNA mix reduceret luciferaseaktivitet. siRNA mod IRAK1 og TRAF6 reducerede ikke luciferaseaktivitet. LPA-stimuleret NF-KB-aktivering blev også hæmmet af siRNA mod COPS2 og COPS5, viser, at andre forstyrrelse af COP9 signalosom kompleks reducerer GPCR-medieret NF-KB-aktivering. siMix, bland siRNA'er mod CARD10, COPS8, IRAK1 og TRAF6. Data er vist som middelværdi ± S.D. syv biologiske replikater * = P <.; 0,05. Den relative udtryk for TRAF6, COPS8, IRAK1, CARD10, COPS2 og COPS5 blev målt ved hjælp af qPCR. Grå-shading indikerer en betydelig ændring i udtryk, p < 0,05, n = 4.
Ekspressionen af ​​MIR-146a er delvis styret af NF-KB. Vi har derfor også testet hvordan udtrykket af miR-146a er påvirket af LPA og IL-1β stimulation. Vi fandt, at LPA behandling fordoblet ekspressionen af ​​MIR-146a og IL-1β stimulering gav en 4 gange stigning i MIR-146a ekspression, der kan sammenlignes med tidligere observationer [16, 38] (Yderligere file1: Figur S6). Selvom miR-146a LNA forøget ekspression af tre af miR-146a mål (TRAF6, IRAK1 og CARD10) (figur 5) den samlede aktivering af NF-KB blev ikke ændret i LPA-stimuleret miR-146a LNA behandlede SNU638 celler.
mIR-146a reducerer LPA-induceret ekspression af cytokiner og vækstfaktorer
i de fleste karcinomer microenvironmental faktorer snarere end genetiske ændringer er sandsynligvis ansvarligt for aktivering NF-KB-signalering, der regulerer flere processer, herunder udskillelsen af ​​vækstfaktorer og cytokiner [39, 40]. Derfor undersøgte vi, hvordan MIR-146a modulerer ekspression af udvalgte NF-KB-regulerede vækstfaktorer og cytokiner induceret af ekstracellulære signaler, såsom LPA. LPA-stimulation signifikant forøget ekspression af interleukin-6, -8, 23A (IL-6, IL-8, IL-23A) og kemokin (CC motiv) ligand 5 (CCL5), kolonistimulerende faktor 1 (makrofag) (CSF- 1) og blodpladeafledt vækstfaktor beta polypeptid (PDGFB) i SNU638 celler (figur 6). Dette bekræftede, at ekspression af disse gener reguleres af LPA-induceret NF-KB-aktivitet. Over-ekspression af MIR-146a signifikant nedsat ekspression af IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 og PDGFB i SNU638 celler (figur 6). Selvom IL-6 er et målgen af ​​NF-KB, og også opreguleret af LPA MIR-146a overekspression ikke reducerede IL-6-ekspression under vore betingelser (figur 6). Imidlertid er LPA induktion af IL-6-ekspression ikke kun medieres af NF-KB, men også via andre veje (MAPK /ERK, PI3K /Akt, og p38) [41], som kan bidrage til forskellene. I SNU638 celler basisniveauet af IL-6 er højere end IL-8, hvilket kan påvirke mRNA omsætning. Dette kunne være en del af grunden til, at miR-146a har mindre effekt på LPA-stimuleret IL-6 udtryk end på IL-8 udtryk, som også er blevet set i andre cellulære systemer [42]. Figur 6 MIR-146a inhiberer LPA-induceret cytokin-ekspression. 25 uM LPA blev anvendt til at inducere cytokinekspression fra humane gastriske carcinoma SNU638 celler. LPA signifikant forøget ekspression af IL-6, IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 og PDGFB, som blev målt ved anvendelse qPCR og vist i forhold til ekspressionsniveauet i ubehandlede kontrolceller. Denne reaktion er reduceret i MIR-146a-transficerede celler. Data er vist som middelværdi ± S.D., n = 4, * = P < 0,05, ns = ikke signifikant.
MiR-146a overekspression i SNU638 celler reducerer rekruttering af monocytter Salg In carcinomer monocytter kan rekrutteres ved f.eks CCL5 og CSF-1 udtrykkes af tumorceller og denne tumor infiltration af monocytter bidrager til tumorfremmende inflammatorisk respons i cancer [39, 40]. Efter at have vist, at miR-146a reducerede LPA-induceret ekspression af cytokiner, vi undersøgt, hvordan miR-146a overekspression påvirket rekrutteringen af ​​monocytter. Vi fandt, at LPA-behandling af SNU638 celler forøget monocyt vandring mod konditioneret medium fra SNU638 celler (figur 7 og yderligere file1: Figur S7), hvorimod transfektion med MIR-146a delvis ophævet denne respons (figur 7), hvilket igen demonstrerer, at miR -146a inhiberer de biologiske reaktioner af GPCR-medieret aktivering af NF-KB, såsom rekruttering af monocytter. Figur 7 miR-146a reducerer monocyt migration. Monocyt migration mod konditioneret medium fra kontrol- eller miR-146a-transficerede SNU638 celler, der blev efterladt ubehandlet eller stimuleret med 25 pM LPA blev fulgt over 8 timer. Migration af celler er vist i forhold til migration af ubehandlede kontrolceller. Monocyt migration mod medium fra LPA-stimulerede SNU638 celler blev øget i forhold til migration mod medium fra ubehandlede celler, mens monocyt migration mod medium fra miR-146a-transficeret, blev LPA-stimulerede celler faldet i forhold til medium fra kontrol-transficerede, LPA-stimuleret celler. Data er vist som middelværdi ± S.D. af fire biologiske replikater. ** = P < 0,01, ns = ikke signifikant.
Diskussion
Microenvironmental faktorer er vigtige for NF-KB-aktivering i inflammations-drevne cancerformer, såsom gastrisk cancer og denne NF-KB aktivering kan give cancerceller med fordele, som bidrager til tumorgenic processer [32, 43]. Modulering af NF-KB-aktivering signalering er derfor vigtigt for styring af inflammation medieret tumorudvikling. Her viser vi, at MIR-146a er en central negativ regulator af NF-KB-aktivering og hæmmer flere NF-KB-aktiverende pathways.
MIR-146a ekspression blev fundet opreguleret i app. 2/3 af de humane gastriske adenokarcinomer samt i gastrin KO musemodel for gastrisk cancer. Tilsvarende ekspression af MIR-146a har vist forøget i hals-, bryst-, pankreas- og thyreoideacancer [11, 44-46]. Tidligere udtryk for miR-146a er fundet både op- og nedreguleret i gastrisk kræft [21-24]. Disse modstridende resultater kan afspejle forskelle i tumorer og deres mikromiljø resulterer i forskellige grader af NF-KB aktiviteter, som kontrollerer MIR-146a-ekspression [16]. Overraskende fandt vi lave niveauer af MIR-146a i humane gastriske cancercellelinier. Dette kunne tyde på, at den øgede miR-146a niveau i tumorer er coursed af microenvironmental faktorer f.eks celler, der omgiver tumorcellerne.
For at undersøge effekten af ​​øgede miR-146a-niveauer i mavekræft vi identificeret to nye mål miR-146a, CARD10 og COPS8, og undersøgte roller disse mål. Vi fandt, at MIR-146a inhiberede GPCR-medieret NF-KB-aktivering ved direkte målretning og nedregulering ekspression af CARD10 og COPS8. CARD10 vides at være påkrævet for GPCR-induceret aktivering af NF-KB [27, 29], mens COPS8 er en underenhed af COP9 signalosom der styrer NF-KB-aktivering [28, 47]. Vi viste, at CARD10 er involveret i GPCR-medieret aktivering af NF-KB, og forudsat nye beviser, at COPS8 er involveret i denne vej også. MIR-146a overekspression også ført til reduceret ekspression af COPS2, en anden subunit af COP9 signalosom. Vi antager, at dette er en indirekte effekt, da der ikke er miR-146a bindingssted i COPS2 3'UTR og ændringer i ekspressionen af ​​en underenhed har vist sig at påvirke den for anden [35, 36]. Det er derfor muligt, at MIR-146a til en vis grad kan virke ved ikke kun at målrette COPS8 men destabilisere COP9 signalosom.
Aberrant signalering gennem GPCR'er er blevet forbundet med tumorcellevækst og overlevelse, og NF-KB-aktiverende GPCR'er har været vist sig at bidrage til en bred vifte af cancere (gennemgået af Dorsam & Gutkind [48]). GPCR'er kan aktivere NF-KB via
CARD10 /BCL10 /MALT1 kompleks efter binding ligander, såsom LPA, enothelin-1, angiotensin II (Ang II) og kemokin (CXC-motivet) ligand 12 (CXCL12) (figur 8) [ ,,,0],29, 49]. I vores undersøgelse anvendte vi LPA at modellere GPCR-medieret aktivering af NF-KB. LPA-induceret GPCR-signalering fører til tumorudvikling [49]. Således kunne MIR-146a-medieret inhibering af GPCR-signalering har tumor undertrykke virkninger. Figur 8 MIR-146a mål flere NF-KB-aktivering veje. Skematisk illustration af NF-KB-aktiverende pathways. MIR-146a er tidligere blevet vist at målrette IRAK1 og TRAF6 og i denne undersøgelse viser vi, at MIR-146a målretter CARD10 og COPS8. MIR-146a mål er markeret med røde cirkler.
Foruden GPCR-medieret NF-KB-aktivering, kan NF-KB aktiveres via
tumor-nekrose-faktor-receptor (TNFR), IL-1R, TLR, TCR og B-celle receptor (BCR) [50] (figur 8). Tidligere har MIR-146a vist sig at hæmme NF-KB-aktivering via Salg disse receptorer ved nedregulering ekspression af TRAF6 og IRAK1 [16, 18, 30, 31]. MIR-146a målretter IRAK1 i gastriske cancerceller, men ikke TRAF6. Selv om vi viser her, at MIR-146a målretter GPCR-medieret aktivering af NF-KB, der ud over aktivering via
TNFR, IL-1R, TLR, TCR og BCR, ved at målrette CARD10 og COPS8 (figur 8). Målretter således miR-146a flere komponenter af NF-KB-aktivering veje i mavens kræftceller. Dette er ikke blevet vist for NF-KB-vejen før, men har tidligere været set i den transformerende vækstfaktor-β (TGF-β) pathway, hvor både MIR-21 og MIR-17-92 klynge target flere mRNA'er der koder for proteiner i TGF-β pathway [51, 52]. Ved at målrette flere komponenter af forskellige NF-KB-aktiverende veje miR-146a medierer en robust og kompleks styring af NF-KB-aktivitet. Flere andre miRNA kan også regulere NF-KB-signalering, men kun MIR-146a mål adskillige gener i forskellige NF-KB-aktiverende veje, hvilket tyder MIR-146a som et centralt modulator af NF-KB-aktivering.
NF-KB regulerer ekspression af cytokiner og vækstfaktorer, der er involveret i adskillige aspekter af tumorprogression [43]. Da MIR-146a reducerer NF-KB-aktivitet, er det muligt, at MIR-146a virker tumor undertrykke ved at reducere ekspressionen af ​​sådanne cytokiner og vækstfaktorer. Vi fandt faktisk, at miR-146a overekspression reduceret ekspression af flere cytokiner og vækstfaktorer med kendt rolle i udviklingen af ​​kræft; IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 og PDGFB. Disse gener kan øge celleproliferation, celleadhæsion og angiogenese [53-55], bidrager til tumor lymfangiogenese [56], aktivere fibroblaster [57], rekruttere monocytter til tumorer [39, 40] og inducerer tumorassocierede makrofager (TAM'er) til secernerer tumorfremmende mediatorer [58] (figur 9). Figur 9 Biologiske processer i gastrisk cancerceller hæmmede af miR-146a. Venstre panel, miR-146a direkte henvender IRAK1, CARD10 og COPS8 i SNU638 celler. Dette fører til inhibering af NF-KB-aktivering og dermed undertrykt ekspression af NF-KB-regulerede cytokiner og vækstfaktorer. Ekspression af miR-146a er også reguleret af NF-KB [16]. Højre panel, MIR-146a reducerer ekspression af CCL5, CSF-1, IL-8, PDGF og IL-23A, som er involveret i monocyt migration og differentiering, proliferation, angiogenese, lymfangiogenese og fibroblast og makrofag vækstfaktor frigivelse. Således kan MIR-146a fungere som en tumorsuppressor ved at reducere cancer-fremmende virkninger af NF-KB-aktivitet.
Kemotaktiske cytokiner frigivet af tumorceller kan rekruttere monocytter til tumorpositionen [39, 59]. Disse monocytter kan fremme tumorudvikling [60]. CCL5 og CSF-1 er eksempler på monocyt-rekruttere cytokiner frigivet af tumorceller [39, 40]. Som forventet, monocytter migrerede mindre mod konditioneret medium fra LPA-stimulerede SNU638 celler overudtrykker MIR-146a i forhold til LPA-stimulerede kontrolceller. Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• Samtidig overekspression af serum p53 mutation relateret til Helicobacter pylori infection
• Intraneural metastase af gastrisk karcinom fører til iskiasnerven parese