microRNA-146a remt G-eiwit gekoppelde receptor-gemedieerde activatie van NF-KB via manipulatie CARD10 en COPS8 bij maagkanker

microRNA-146a remt G-eiwit gekoppelde receptor-gemedieerde activering van NF-KB door zich te richten CARD10 en COPS8 bij maagkanker
Abstracte achtergrond
Maagkanker is de tweede meest voorkomende oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen in de wereld. Inflammatory signalen afkomstig van maagkanker cellen zijn belangrijk voor de werving van ontstekingscellen en de regulering van metastase van maagkanker. Verscheidene microRNA (miRNA) bleken betrokken te zijn bij de ontwikkeling en progressie van maagkanker. miRNA-146a (miR-146a) is een modulator van inflammatoire signalen, maar er is weinig bekend over het belang ervan bij maagkanker. Daarom wilden doelwitten van miR-146a te identificeren bij maagkanker en onderzoekt zij de biologische rollen.
Resultaten
De expressie van miR-146a werd geëvalueerd door middel van kwantitatieve PCR (qPCR) en vonden up-gereguleerd in de gastrine knockout muizen een muismodel van maagkanker en in 73% van de onderzochte menselijke maag adenocarcinomen. Expressie van miR-146a door maagkanker cellen werd bevestigd door in situ
hybridisatie. Globale analyse van de veranderingen in mRNA-niveaus na miR-146a transfectie geïdentificeerd twee transcripten, caspase recruitment-domein met eiwit 10 (CARD10) en COP9 signalosome complex subunit 8 (COPS8), als nieuwe miR-146a targets. qPCR, Western blotting en luciferasetests bevestigde deze transcripties als direct miR-146a targets. CARD10 en COPS8 werden naar een deel van het G-eiwit-gekoppelde receptor (GPCR) route nucleaire factor-kappaB (NF-kappaB) activering. Lysofosfatidezuur (LPA) induceert NF-kappaB
activering via deze route en overexpressie van miR-146a remde LPA geïnduceerde NF-kappaB activering, verminderde LPA geïnduceerde expressie van tumor-bevorderende cytokinen en groeifactoren en geremd monocyt aantrekkingskracht .
Conclusies
miR-146a expressie is opgereguleerd in de meeste maagkanker wanneer het gericht CARD10 en COPS8, remmen-GPCR gemedieerde activatie van NF-kappaB, waardoor expressie van het verminderen NF-kappaB-gereguleerde tumor- cytokines en groeifactoren. Door zich te richten componenten van verschillende NF-kappaB-activerende paden, miR-146a is een belangrijke component in de regulatie van NF-kappaB activiteit.
Sleutelwoorden
Maagkanker niet-coderende RNA cytokinen Achtergrond
Globally maagkanker is de tweede meest voorkomende oorzaak van kanker-gerelateerde dood [1]. Ontwikkeling van maagkanker wordt beïnvloed door interacties tussen gastheer en bacteriële factoren milieu. Voorbeelden van synergetische risicofactoren voor maagkanker zijn polymorfismen in genen die betrokken zijn in de ontvangende ontstekingsreactie [2], Helicobacter pylori
(H. pylori
) virulentiefactoren [3] en diëten rijk aan zout en nitraat [4] . Ondanks de recente vooruitgang in de opsporing en behandeling van vroege maagkanker, de lange-termijn overleving tarief voor gevorderde maagkanker is laag [5]. De belangrijkste uitdagingen van gevorderde maagkanker zijn lymfatische, peritoneale orgaan of verre metastasen, die gelijktijdig slechte uitkomst voor deze patiënten te voorspellen [6].
Hoewel veel oncogenen en tumor suppressors gerapporteerd betrokken te zijn bij de ontwikkeling van maagcarcinomen , de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen metastase van geavanceerde maag carcinomen nog steeds slecht begrepen [7]. Een van de belangrijkste gebeurtenissen in de maag carcinogenese is een ontsteking. Ontsteking leidt tot activatie van de transcriptiefactor nucleaire factor-kappaB (NF-KB), die wordt geassocieerd met maagkanker [8, 9].
MicroRNA's (miRNA) zijn betrokken bij de ontwikkeling en progressie van maagkanker [10- 13]. miRNA is een klasse van endogene, niet-coderende, enkelstrengs RNA moleculen app. 22 nucleotiden die post-transcriptionele regulatie van genexpressie mediëren tot baseparing met de 3 'onvertaalde gebied (UTR) van het doel messenger RNA (mRNA) [14]. miRNAs zijn betrokken bij de regulatie van de meeste cellulaire processen zoals celproliferatie, migratie, differentiatie en apoptose [10, 14, 15]. miRNAs zijn afwijkend tot expressie gebracht in de meeste menselijke kankers en, zoals proteïne-coderende genen, miRNAs kan functioneren als zowel tumor- suppressors of oncogenen, waardoor carcinogenese [10, 12] reguleren. miRNA-146a (miR-146a) wordt gereguleerd door NF-KB en remt interleukine-1 receptor (IL-1R) en Toll-like receptoren (TLR) - geïnduceerde activering van NF-KB via manipulatie van interleukine-1-receptor-geassocieerde kinase 1 (IRAK1) en TNF-receptor geassocieerde factor 6 (TRAF6) [16-18]. miR-146a gemeld afwijkende expressie gebracht in verschillende ontstekingsziekten en kanker, maar de rol van miR-146a bij maagkanker blijft controversieel, aangezien de expressie van miR-146a is gevonden zowel op- en neerwaarts gereguleerd here [19-24 ]. Daarom hebben we de expressie van miR-146a onderzocht bij maagkanker en kenmerk van de doelstellingen en moleculaire functies aan de tegenstrijdige vaststellingen.
We vonden dat miR-146a is opgereguleerd in een muismodel van maagkanker en in menselijke maag adenocarcinomen en geïdentificeerd CARD10 en COPS8 als nieuwe directe doelwit van miR-146a. Beide deel uit van het G-eiwit-gekoppelde receptor (GPCR) gemedieerde signaaltransductie dat activatie van NF-kB medieert. Dit suggereert dat miR-146a werkt tumor onderdrukken door het remmen-GPCR gemedieerde activatie van NF-KB en de resulterende expressie van tumor-bevorderende cytokinen en groeifactoren.
Resultaten
miR-146a expressie is opgereguleerd in een muis model van maagkanker en in de menselijke maag adenocarcinomen
Gastrine knock-out (KO) muizen zijn achloorhydrie en de ontwikkeling van intestinale metaplasie en de maag adenomen na verloop van tijd [25]. Met behulp van kwantitatieve PCR (qPCR) vonden we de expressie van miR-146a app. 2-voudig up-gereguleerd in oude gastrine KO muizen met ofwel fundic intestinale metaplasie of antrale adenoom vergeleken met de expressie in wild type (WT) muizen (P < 0,05) (Figuur 1A). Door in situ hybridisatie
miR-146a werd gedetecteerd in metaplasie maagweefsel van gastrine KO muizen, maar niet in normaal maagweefsel van de WT-muizen (figuur 2AB) (Extra file1: Figuur S1). Na te hebben vastgesteld dat miR-146a wordt verhoogd in onze muismodel van maagkanker onderzochten we de expressie van miR-146a in gepaarde menselijke maag adenocarcinomen en aangrenzende controle biopsieën en vond dat het up-gereguleerd in 27 van de 37 gevallen (73%) ( figuur 1B). In situ
hybridisatie toonde aan dat miR-146a werd uitgedrukt door het menselijk adenocarcinoom van de maag cellen, terwijl miR-146a-positieve cellen niet in de normale maagslijmvlies (figuur 2CD) (Extra file1: Figuur S1) werden gedetecteerd. Figuur 1 verhoogde expressie van miR-146a in de gastrine KO muis maagkanker model en menselijke maagkanker. (A) De relatieve expressie van miR-146a in metaplasie fundus weefsel (n = 8) en hyperplastische antrale mucosa (n = 4) /antrale adenomen (n = 4) vanaf gastrine knockout (KO) muizen in vergelijking met de gemiddelde expressie in bijpassende wild type (WT) muizen weefsel. * = P < 0,05. (B) waterval grafiek van de expressie van miR-146a in 37 menselijke maag adenocarcinomen opzichte van de expressie in aangrenzend normaal weefsel. miR-146a werd up-gereguleerd in 27 van de 37 tumoren (73%). De expressieniveaus van miR-146a werd bepaald door qPCR en genormaliseerd aan die van de endogene controle RNU44.
Figuur 2 In situ hybridisatie detectie van miR-146a expressie in de gastrine KO muizen maagkanker model en menselijke maagkanker. (A) Expressie van miR-146a werd niet gedetecteerd in WT fundic muis weefsel, (B), terwijl miR-146a-positieve cellen (blauwe kernen) werden gedetecteerd in de metaplastische fundic weefsel van gastrine KO muizen. (C) geen signaal werd gedetecteerd met de gecodeerde LNA sonde. (D) miR-146a expressie afwezig is in normale humane maagweefsel, (E), maar in menselijk adenocarcinoom cellen (blauwe kernen). (F) Negatieve controle via een gecodeerde LNA probe. Representatieve miR-146a-positieve cellen worden aangegeven met pijlen. Oorspronkelijke vergroting x20, Schaal bar = 100 urn.
Er was geen correlatie tussen miR-146a expressie in gastrische adenocarcinomen en patiënt leeftijd, geslacht en lokalisatie of classificatie van tumoren (gegevens niet getoond). Hoewel patiënten met een hoge miR-146a expressie leek een betere totale overleving hebben dit was niet significant. (Extra file1: Figuur S2)
miR-146a targets leden van de GPCR-gemedieerde NF-KB-activering route
hebben aangetoond verhoogde expressie van miR-146a in de meeste maagkanker, wilden we de biologische werkingen van miR-146a vast karakteriseerde de directe moleculaire targets in menselijke maagkanker. We willen doen door overexpressie van miR-146a bij maagkanker cellen en vervolgens identificeren mRNAs met beperkte expressie [26]. Daarom hebben we onderzocht miR-146a expressie in een panel van cellijnen en vond gevarieerd, maar verrassend lage expressie van miR-146a in de beschikbare maag cellijnen (Extra file1: Figuur S3), rekening houdend met de gedetecteerde overexpressie in tumoren <. br> De menselijke maagkanker cellijn SNU638, die te verwaarlozen niveaus van endogene miR-146a heeft is geschikt voor miR-146a over-expressie studies gevonden. Sinds miR-146a expressie was zeer laag in de geteste maag cellijnen miR-146a remming studies werden niet uitgevoerd.
We hebben eerst getest of overexpressie van miR-146a van invloed op de groei van de SNU638 cellen en vond de celgroei onaangetast ( extra file1: Figuur S4). Vervolgens, globale veranderingen in genexpressie in SNU638 cellen na overexpressie van miR-146a werden onderzocht. Na miR-146a transfectie mRNA met voorspelde 3'UTR miR-146a doelplaatsen waren significant down-gereguleerd in vergelijking met mRNA zonder voorspelde targets sites (P < 4.6e-11, tweezijdige Wilcoxon rank-sum test) (figuur 3A) . We analyseerden alle woorden met een lengte van 5-7 voor de oververtegenwoordiging in-down gereguleerd mRNA na miR-146a transfectie en vond het woord sterkste gecorreleerd met down-regulatie was het zaad plaats complementair is aan miR-146a bases rijpen 2-7 /8 ( figuur 3B). Afschriften met voorspelde 3'UTR miR-146a doel sites die waren beduidend down-gereguleerd op miR-146a transfectie werden beschouwd als potentiële directe miR-146a targets. 847 geëvenaard deze criteria (Extra file1: Tabel S5). De top 10 meest down-gereguleerd potentieel miR-146a doelstellingen zijn weergegeven in figuur 3C. Als een negatieve validatie controle herhaalden we de procedure voor het behandelen van SNU638 cellen met een miR-146a LNA remmer. Er was geen significant up-regulatie van genen met het zaad ter complementair aan miR-146a basen volwassen (gegevens niet getoond). Figuur 3 Identificatie van miR-146a targets. (A) voorspelde miR-146a doel transcripten zijn aanzienlijk omlaag gereguleerd na miR-146a transfectie in vergelijking met uitgedrukt genen die niet voorspeld doelwitten van miR-146a (P < 4.6e-11, tweezijdige Wilcoxon rank-sum test) . (B) Top 10 woorden meest gecorreleerd met down-regulatie (correlatie Z-scores worden aangegeven aan de linkerkant van elk woord, alle 10 woorden hebben een geschatte FDR < 1e-6). Hoofdletters wijzen op de miRNA zaad regio, Watson-Crick basenparen (blauw), mismatches (rood). Het woord sterkst gecorreleerd met down-regulatie was het zaad plaats complementair is aan miRNA bases 2-7 /8 rijpen. (C) Afschriften, met 6mer of 7mer miR-146a zaad sites in de 3'UTR, die het meest down-gereguleerd op miR-146a transfectie zijn getoond. Dit zijn de mogelijke rechtstreekse miR-146a targets. Uitdrukking wordt gegeven in log2 voudige verandering. De 3'UTR 6 m /m 7 kolommen geven aantallen 6- of 7mer miR-146a zaad sites in de 3'UTR. Ondernemingen De drie meest down-gereguleerde genen bij miR-146a overexpressie, IRAK1, caspase recruitment -domein met eiwit 10 (CARD10) en COP9 constitutieve photomorphogenic homoloog subunit 8 (COPS8) (Figuur 3C) behoren allemaal tot signaalwegen die leiden tot NF-KB-activering [27-29]. IRAK1 is een bekende miR-146a doel die deze TLR- en IL-1R-bemiddelde activatie van NF-KB [16-18]. CARD10 is betrokken bij GPCR gemedieerde activatie van NF-KB [27], terwijl COPS8 wordt verondersteld betrokken te zijn bij deze route op basis van zijn betrokkenheid bij T-celreceptor (TCR) gemedieerde NF-KB-activering [28]. Verrassend, maar vergelijkbaar met de bevindingen van Boldin et al.
[30] Expressie van TRAF6, die eerder is beschreven als miR-146a doel [16, 18, 31], werd geen verlaging in de transcriptionele niveau na miR-146a overexpressie in ons modelsysteem.
in maagkanker, NF-KB moduleert celoverleving, immuniteit en ontsteking en NF-KB-activering is geassocieerd met een slechte uitkomst bij maagkanker [32, 33]. We concentreerden ons daarom op het karakteriseren CARD10 en COPS8 als direct miR-146a targets en hun rol in de NF-KB-activering bij maagkanker. We bevestigden miR-146a-gemedieerde down-regulatie van CARD10, COPS8 en IRAK1 op het transcript niveau (Figuur 4A) en vond ook dat miR-146a verlaagde CARD10, COPS8 en IRAK1 eiwit (Figuur 4B). Tenslotte direct richten van miR-146a om 3'UTRs van de doelgenen werd aangetoond onder toepassing van luciferase-assays (figuur 4C). Kortom, we bevestigen eerdere observaties laten zien dat miR-146a rechtstreeks richt IRAK1 en we bovendien geïdentificeerd twee nieuwe targets, CARD10 en COPS8, dat codeert voor eiwitten voorgesteld worden betrokken bij de NF-KB-activering. COPS8 is een onderdeel van de COP9 signalosome dat bestaat uit acht subeenheden (GPS1 en COPS2-8) [34]. COPS8 de enige subeenheid direct aan miR-146 gericht, maar omdat verandering in de hoeveelheid van de individuele subeenheden is aangetoond dat de hoeveelheid van andere subeenheden [35, 36] beïnvloeden, onderzochten we hoe transfectie met miR-146a getroffen expressie van COP9 signalosome componenten. In niet-gestimuleerde cellen werd de expressie van COPS2 verminderd (20%) (Extra file1: Figuur S5). Daarom nemen aan dat de effecten van miR-146a op de COP9 complex voornamelijk voort uit een vermindering COPS8 expressie, zij het indirect destabilisatie van het complex niet kan worden uitgesloten. Figuur 4 CARD10 en COPS8 zijn direct miR-146a targets. (A) mRNA expressie van de twee nieuwe miR-146a targets, CARD10 en COPS8 en IRAK1, een bekende miR_146a doelwit, werd bepaald door qPCR in controle- en miR-146a-getransfecteerde SNU638 cellen. Expressie van elk transcript wordt getoond ten opzichte van de expressie in controle-getransfecteerde cellen. CARD10, COPS8 en IRAK1 expressie werd down-gereguleerd na miR-146a over-expressie. De gegevens worden getoond als gemiddelde ± S.D. vier biologische herhalingen. * = P < 0,05, ** = P < 0,01, *** = P < 0.001. (B) miR-146a transfectie verminderde ook het eiwit niveaus van CARD10, COPS8 en IRAK1 in miR-146a-getransfecteerde SNU638 cellen. De expressie van elk eiwit wordt getoond ten opzichte van de expressie in controle-getransfecteerde cellen. Banden werden gekwantificeerd ten opzichte van P-actine. De gegevens worden getoond als gemiddelde ± S.D. vier biologische herhalingen. * = P < 0,05, ** = P < 0,01, *** = P < 0.001. (C) Controle van de directe en functionele doel binding met behulp van luciferase constructen die WT 3'UTRs en gemuteerde (Mut) 3'UTRs (de centrale 4 nucleotide werden vervangen in miR-146a bindingsplaats) voor CARD10, COPS8 en IRAK1. Constructen die hetzij WT en gemuteerde (Mut) 3'UTRs stroomafwaarts naar het vuurvlieg luciferasegen werden co-getransfecteerd in HEK293 cellen met Renilla luciferase controle plasmide en ofwel miR-146a of control (siglo). Linker, luciferaseactiviteit wordt gegeven ten opzichte van de activiteit in controle getransfecteerde cellen. miR-146a verminderde luciferase activiteit van constructies met WT CARD10, COPS8 en IRAK1 3'UTRs. Rechts, sequentievergelijkingen van miR-146a en potentiële WT en Mut 3'UTR doel sites worden weergegeven, gemuteerd bases worden getoond in het rood. De gegevens worden getoond als gemiddelde ± S.D. vaak biologische repliceert. *** = P < 0.001. Sequentievergelijkingen worden aangepast van DIANALab (2009).
MiR-146a remt GPCR-gemedieerde NF-KB-activiteit door zich te richten CARD10 en COPS8
CARD10 en COPS8 zijn betrokken bij GPCR-gemedieerde activering van NF-KB [28, 29 ]. We wilden daarom hun rol in signaaltransductie bij maagkanker vast te stellen en vervolgens te onderzoeken het belang van miR-146a voor het remmen van deze signalering. Hiervoor gebruikten we lysophosphatiditc acid (LPA), een bekende activator van de GPCR gemedieerde NF-KB-activatie route [29], en bevordert maagkanker celmigratie en invasie [37]. LPA-stiumlation aanzienlijk toegenomen NF-KB activiteit van de luciferase reporter (zie figuur 5). siRNA knockdown van CARD10 en COPS8 expressie remde LPA-gestimuleerde-GPCR gemedieerde activatie van NF-KB in SNU638 cellen (Figuur 5). Deze remming was vergelijkbaar met de miR-146a geïnduceerde remming. Daarentegen remmen van endogeen miR-146a geen effect op NF-KB activering. Zoals voorspeld siRNA-gemedieerde repressie van expressie IRAK1 had geen invloed op LPA-gestimuleerde activering van NF-KB (Figuur 5) zoals IRAK1 niet betrokken is de GPCR gemedieerde route. Als TRAF6 een miR-146a doel met een rol in de NF-KB activering, werd het effect van siRNA-gemedieerde repressie van expressie TRAF6 op LPA-gestimuleerde NF-KB-activiteit onderzocht. Echter, knockdown van TRAF6 niet LPA-gestimuleerde NF-KB-activiteit (Figuur 5) te remmen. Deze resultaten geven aan dat de twee nieuw geïdentificeerde miR-146a doelstellingen CARD10 en COPS8, zijn betrokken bij GPCR gemedieerde activatie van NF-KB. Daarom is het effect van miR-146a overexpressie op LPA-gestimuleerde NF-KB-activiteit werd onderzocht. miR-146a remde LPA-gestimuleerde NF-KB-activiteit in SNU638 cellen (Figuur 5). Een mix van siRNAs tegen CARD10, COPS8, IRAK1 en TRAF6 nagebootst de miR-146a-gemedieerde inhibitie van NF-KB-activiteit (fig 5). Knockdown van twee andere COP9 componenten (COPS2 en COPS5) remde ook de LPA-gestimuleerde NF-KB-activiteit, waaruit blijkt het belang van aanwezigheid van alle COP9 signalosome subeenheden voor LPA gestimuleerde activering van NF-KB. qPCR van de expressie van de verschillende componenten onderzocht bevestigd knockdown (figuur 5). Figuur 5 miR-146a targets COPS8 en CARD10 GPCR-gemedieerde NF-KB activering. SNU638 cellen werden gecotransfecteerd met NF-KB reporterplasmide en Renilla luciferase controleplasmide met controle (Siglo), siRNA of miR-146a. Cellen werden gestimuleerd met 25 uM LPA en luciferaseactiviteit werd gemeten. Luciferase activiteit wordt gegeven ten opzichte van in controlecellen getransfecteerde LPA-gestimuleerde cellen. siRNA tegen CARD10 en COPS8, miR-146a, miR-146a-remmer en een siRNA mix verminderde luciferaseactiviteit. siRNA tegen IRAK1 en TRAF6 niet verminderen luciferase-activiteit. LPA-gestimuleerde NF-KB-activering werd eveneens geremd door siRNA tegen COPS2 en COPS5, waaruit blijkt dat andere verstoring van de COP9 signalosome complex reduceert GPCR gemedieerde NF-KB activering. Simix, mix van siRNA tegen CARD10, COPS8, IRAK1 en TRAF6. De gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± S.D. van de zeven biologische herhalingen * = P <.; 0,05. De relatieve expressie van TRAF6, COPS8, IRAK1, CARD10, COPS2 en COPS5 werd gemeten met behulp van qPCR. Gray-shading wijst op een belangrijke verandering in de expressie, p < 0,05, n = 4.
De expressie van miR-146a is deels gecontroleerd door NF-KB. Daarom ook getest hoe de expressie van miR-146a werd beïnvloed door LPA en IL-1β stimulatie. We vonden dat LPA behandeling verdubbelde de expressie van miR-146a en IL-1β stimulatie gaf een 4-voudige toename van miR-146a expressie, vergelijkbaar met eerdere observaties [16, 38] (Extra file1: Figuur S6). Hoewel miR-146a LNA de expressie van drie van de miR-146a targets (TRAF6, IRAK1 en CARD10) toegenomen (figuur 5) de totale activatie van NF-kB werd geen LPA-gestimuleerde miR-146a LNA veranderde behandelde SNU638 cellen.
miR-146a vermindert LPA geïnduceerde expressie van cytokines en groeifactoren
In de meeste carcinomen micromilieu factoren dan genetische veranderingen zijn waarschijnlijk verantwoordelijk voor het activeren van NF-KB-signalering dat verschillende processen waaronder secretie van groeifactoren en cytokinen [39 regelt, 40]. Daarom onderzochten we hoe miR-146a moduleert expressie van geselecteerde NF-KB gereguleerde groeifactoren en cytokines geïnduceerd door extracellulaire signalen zoals LPA. LPA-stimulatie significant verhoogde expressie van interleukine-6, -8, 23A (IL-6, IL-8, IL-23A) en chemokine (CC motif) ligand 5 (CCL5), koloniestimulerende factor 1 (macrofaag) (CSF- 1) en van bloedplaatjes afgeleide groeifactor beta polypeptide (PDGFB) in SNU638 cellen (figuur 6). Dit bevestigt dat de expressie van deze genen wordt gereguleerd door LPA geïnduceerde NF-KB-activiteit. Over-expressie van miR-146a significant verminderde expressie van IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 en PDGFB in SNU638 cellen (figuur 6). Hoewel IL-6 is een doelgen van NF-KB, en ook opgereguleerd door LPA miR-146a overexpressie verminderde niet IL-6 expressie onder onze omstandigheden (figuur 6). Echter LPA inductie van IL-6 expressie niet alleen gemedieerd door NF-kB, maar ook via andere routes (MAPK /ERK, PI3K /Akt en p38) [41], wat kan bijdragen aan de verschillen. SNU638 cellen in de basale niveau van IL-6 is dan IL-8, die de mRNA omzet kunnen beïnvloeden. Dit kan een deel van de reden dat miR-146a heeft minder invloed op LPA-gestimuleerde IL-6 expressie dan op IL-8 expressie, die ook is gezien in andere cellulaire systemen [42] zijn. Figuur 6 miR-146a remt LPA-geïnduceerde cytokine-expressie. 25 uM LPA werd gebruikt om cytokine-expressie te induceren van humaan maagcarcinoom SNU638 cellen. LPA significant verhoogde expressie van IL-6, IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 en PDGFB, die werd gemeten met qPCR en getoond ten opzichte van het expressieniveau in onbehandelde controlecellen. Deze reactie wordt verminderd in-miR-146a getransfecteerde cellen. De gegevens worden getoond als gemiddelde ± S.D., n = 4, * = P < 0.05, ns = niet significant.
MiR-146a over-expressie in SNU638 cellen vermindert de rekrutering van monocyten
In carcinomen monocyten kan worden aangeworven door bijv. CCL5 en CSF-1 door tumorcellen tot expressie en deze tumor infiltratie van monocyten bij aan de tumor-bevorderende ontstekingsreactie in de kanker [39, 40]. Heeft aangetoond dat miR-146a verlaagd LPA-geïnduceerde expressie van cytokines, we onderzocht hoe miR-146a overexpressie getroffen rekrutering van monocyten. We vonden dat LPA-behandeling van SNU638 cellen verhoogde monocyt overgang naar geconditioneerde medium van de SNU638 cellen (Figuur 7 en bijkomende file1 Figuur S7), terwijl transfectie met miR-146a gedeeltelijk deze reactie (figuur 7) ingetrokken, hetgeen opnieuw dat miR -146a remt de biologische responsen van GPCR gemedieerde activatie van NF-KB zoals rekrutering van monocyten. Figuur 7 miR-146a vermindert monocyten migratie. Monocyten migratie tegen geconditioneerd medium uit controle- of-miR-146a getransfecteerde SNU638 cellen die onbehandeld werden gelaten of gestimuleerd met 25 uM LPA werd gevolgd meer dan 8 uur. Migratie van cellen wordt getoond ten opzichte van migratie van onbehandelde controlecellen. Monocyten migratie tegen medium LPA-gestimuleerde SNU638 cellen werd verhoogd in vergelijking met de migratie tegen medium van onbehandelde cellen, terwijl monocyten migratie tegen medium van miR-146a-getransfecteerd, werd LPA-gestimuleerde cellen gedaald ten opzichte van medium van controle getransfecteerde, LPA-gestimuleerde cellen. De gegevens worden getoond als gemiddelde ± S.D. vier biologische herhalingen. ** = P < 0,01, ns = niet significant.
Discussie
micromilieu factoren zijn belangrijk voor NF-KB-activering in inflammatie gedreven kankers zoals maagkanker en dat activatie van NF-kB kunnen kankercellen met voordelen die bijdragen tot het verschaffen tumorgenic processen [32, 43]. Modulatie van NF-KB-activerende signalering is daarom belangrijk voor het regelen van ontsteking-gemedieerde tumorontwikkeling. Hier laten we zien dat miR-146a is een centraal negatieve regulator van NF-KB-activering als het aantal NF-KB-activering inhibeert wegen.
MiR-146a expressie werd gevonden opgereguleerd in app. 2/3 van de menselijke maag adenocarcinomen en in de gastrine KO muismodel van maagkanker. Evenzo expressie van miR-146a is gevonden verhoogd cervicale, borst-, alvleesklier- en schildklierkanker [11, 44-46]. Eerder, de expressie van miR-146a is zowel up- en down-gereguleerd bij maagkanker [21-24] gevonden. Deze tegenstrijdige resultaten kunnen verschillen in tumoren en hun micro-omgeving waardoor verschillende graden van NF-KB activiteiten die miR-146a expressie [16] regelt weerspiegelen. Verrassend, vonden we lage niveaus van miR-146a in menselijke maagkanker cellijnen. Dit zou erop kunnen wijzen dat de toegenomen miR-146a levels gezien in tumoren worden coursed door micro-omgeving van factoren bijv. cellen rondom de tumorcellen.
Om de effecten van de toegenomen miR-146a levels bij maagkanker identificeerden we twee nieuwe miR-146a targets, CARD10 en COPS8, en onderzochten de rol van deze doelstellingen te onderzoeken. We vonden dat miR-146a remde GPCR-gemedieerde NF-KB activering door direct targeting en down-reguleren van de expressie van CARD10 en COPS8. CARD10 bekend vereist is voor GPCR-geïnduceerde activering van NF-KB [27, 29], terwijl COPS8 is een subeenheid van COP9 signalosome dat NF-KB-activering [28, 47] regelt. We toonden aan dat CARD10 betrokken is bij GPCR gemedieerde activatie van NF-KB, en mits nieuwe feiten die COPS8 is betrokken bij deze route ook. miR-146a overexpressie leidde ook tot een vermindering van de expressie van COPS2, een andere subunit van de COP9 signalosome. We nemen aan dat dit een indirect effect, aangezien er geen miR-146a bindingsplaats in COPS2 3'UTR en veranderingen in de expressie van één subeenheid is aangetoond dat af aan deze van de andere [35, 36]. Het is dus mogelijk dat miR-146a enigszins kunnen optreden door niet alleen gericht COPS8 maar destabiliserende COP9 signalosome.
Afwijkende signalering door middel van GPCRs is verbonden met tumorcel groei en overleving en NF-KB-activering GPCRs zijn blijkt bij te dragen aan een breed scala van kanker (overzicht door Dörsam & Gutkind [48]). GPCRs kunnen NF-KB activeren via of the CARD10 /BCL10 /MALT1 complex na binding liganden zoals LPA, enothelin-1, angiotensine II (Ang II) en chemokine (CXC motief) ligand 12 (CXCL12) (figuur 8) [ ,,,0],29, 49]. In ons onderzoek gebruikten we LPA GPCR gemedieerde activatie van NF-KB te modelleren. LPA geïnduceerde GPCR-signalering leidt tot tumorprogressie [49]. Zo zou miR-146a-gemedieerde remming van GPCR-signalering tumor onderdrukkende effecten. Figuur 8 miR-146a targets meerdere NF-KB activering trajecten. Schematische weergave van NF-KB-activering trajecten. miR-146a Eerder is aangetoond targeten IRAK1 en TRAF6 en in deze studie tonen we aan dat miR-146a gericht CARD10 en COPS8. miR-146a targets zijn gemarkeerd met rode cirkels.
Naast GPCR-gemedieerde NF-KB activering, kunnen NF-KB worden geactiveerd via
tumor necrosis factor receptor (TNFR), IL-1R, TLR, TCR en B-cel receptor (BCR) [50] (figuur 8). Eerder heeft miR-146a aangetoond dat NF-KB activering te remmen via
deze receptoren door omlaag reguleren van expressie van TRAF6 en IRAK1 [16, 18, 30, 31]. miR-146a richt IRAK1 bij maagkanker cellen, maar niet TRAF6. Hoewel we hier laten zien dat miR-146a target-GPCR gemedieerde activatie van NF-KB, naast de activering via
TNFR, IL-1R, TLR, TCR en BCR worden gemikt CARD10 en COPS8 (figuur 8). Aldus miR-146a gericht meerdere componenten van NF-KB-activering trajecten in maagkanker cellen. Dit is niet aangetoond dat de NF-kB route voor, maar is eerder gezien in de transformerende groeifactor-β (TGF-β) route, waarbij zowel miR-21 en miR-17-92 cluster doelwit verscheidene mRNAs coderend voor eiwitten in de TGF-β pathway [51, 52]. Door zich te richten meerdere componenten van verschillende NF-KB-activerende verspreiding in miR-146a bemiddelt een robuuste en complexe controle van de NF-KB-activiteit. Verschillende andere miRNAs kunnen regelen ook NF-KB-signalering, maar miR-146a doelen verscheidene genen in verschillende NF-KB-activering routes suggereert miR-146a als een belangrijke modulator van NF-KB activering.
NF-kB reguleert expressie van cytokines en groeifactoren betrokken bij verschillende aspecten van tumorprogressie [43]. Aangezien miR-146a afneemt NF-KB-activiteit, is het mogelijk dat miR-146a werkt tumor onderdrukken door het verminderen expressie van dergelijke cytokinen en groeifactoren. Inderdaad vonden we dat miR-146a overexpressie verminderde expressie van verscheidene cytokinen en groeifactoren met een bekende rol in tumorigenese; IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 en PDGFB. Deze genen kunnen celproliferatie, celadhesie en angiogenese [53-55] verbeteren, de tumor lymfevatontwikkeling [56], activeert fibroblasten [57], rekruteren monocyten tumoren [39, 40] en induceren tumor-geassocieerde macrofagen (TAM) aan scheiden tumorbevorderend mediatoren [58] (figuur 9). Figuur 9 Biologische processen bij maagkanker cellen geremd door miR-146a. Linkerpaneel, miR-146a rechtstreeks richt IRAK1, CARD10 en COPS8 in SNU638 cellen. Dit leidt tot remming van NF-KB-activering en bijgevolg onderdrukte expressie van NF-KB gereguleerde cytokines en groeifactoren. Expressie van miR-146a wordt ook gereguleerd door NF-KB [16]. Rechter panel, miR-146a verlaagt expressie van CCL5, CSF-1, IL-8, PDGF en IL-23A, die betrokken zijn bij migratie van monocyten en differentiatie, proliferatie, angiogenese, lymfangiogenese en fibroblast groeifactor en macrofaag release. Zo zou miR-146a fungeren als een tumor suppressor door het verminderen van kanker-bevorderende effecten van NF-KB-activiteit.
Chemotactische cytokinen vrijgegeven door tumorcellen kunnen monocyten tumor plaatsen [39, 59] te werven. Deze monocyten kan bevorderen tumorprogressie [60]. CCL5 en CSF-1 zijn voorbeelden van monocyt werving van cytokines vrijgegeven door tumorcellen [39, 40]. Zoals verwacht, monocyten gemigreerd minder tegen geconditioneerd medium LPA-gestimuleerde SNU638 cellen overexpressie miR-146a vergeleken met LPA-gestimuleerde controlecellen. Figuur S2. Figuur S3. Figuur S4. Figuur S5. Figuur S6. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.

• Gelijktijdige overexpressie van serum p53 mutatie in verband met Helicobacter pylori infection
• Intraneurale uitzaaiing van maagcarcinoom leidt tot heupzenuw palsy