микроРНК-146a ингибирует G-белком активации рецептора опосредованного NF-kB путем пристреливать CARD10 и COPS8 при раке желудка

микроРНК-146a ингибирует G-белком активации рецептора опосредованного NF-kB путем пристреливать CARD10 и COPS8 при раке желудка
Аннотация
Справочная информация
Желудочный рак является второй наиболее распространенной причиной, связанной с раком смерти в Мир. Воспалительные сигналов, исходящих из клеток рака желудка имеют важное значение для набора воспалительных клеток и регуляции метастазирования рака желудка. Было показано несколько микроРНК (миРНК) принимать участие в развитии и прогрессировании рака желудка. микроРНК-146а (микроРНК-146а) представляет собой модулятор воспалительных сигналов, но мало известно о его важности в развитии рака желудка. Поэтому мы хотели определить цели СИК-146а при раке желудка и исследовать его биологические роли.
Результаты
экспрессии микроРНК-146а оценивали с помощью количественной ПЦР (КПЦР) и обнаружили, повышающей регуляции у мышей гастрин нокаутных , мышиная модель рака желудка, а у 73% обследованных желудка аденокарциномы человека. Выражение MIR-146а от клеток рака желудка была подтверждена Ситу
гибридизации в. Глобальный анализ изменений уровня мРНК после микроРНК-146а трансфекции определили два транскриптов, набора каспазы домен-содержащий белок 10 (CARD10) и COP9 signalosome комплекс субъединица 8 (COPS8), в качестве новых мишеней микроРНК-146a. КПЦР, вестерн-блоттинга и люциферазы анализы подтвердили эти стенограммы, как прямые цели микроРНК-146a. CARD10 и COPS8 было показано, часть G-белком рецептор (GPCR) пути ядерного фактора-kappaB (NF-kappaB) активации. Лизофосфатидную кислота (LPA) вызывает активацию NF-kappaB через
этого пути и избыточная экспрессия микроРНК-146а ингибировать МПУ-индуцированной активации NF-kappaB, снижение МПУ-индуцированную экспрессию опухолевых способствующих цитокинов и факторов роста и препятствует привлечению моноцитов .
Выводы
выражение микроРНК-146а вверх-регулируется в большинстве рака желудка, где она предназначается CARD10 и COPS8, ингибирования GPCR опосредованной активации NF-kappaB, тем самым уменьшая экспрессию NF-kappaB-регулируемых tumor- содействие цитокины и факторы роста. Ориентируясь компоненты нескольких NF-kappaB-активирующих путей, микроРНК-146а является ключевым компонентом в регуляции активности NF-kappaB.
Ключевые слова
рак Желудок Некодирующих РНК Цитокины фона изображения во всем мире раком желудка второй наиболее распространенной причиной, связанной с раком смерти [1]. Развитие рака желудка зависит от взаимодействия между хозяином, окружающей среды и бактериальных факторов. Примеры синергетических факторов риска развития рака желудка являются полиморфизмы в генах, участвующих в воспалительной реакции хозяина [2], хеликобактер пилори
(H. Pylori
) вирулентности факторы [3] и диеты, богатой солью и нитрата [4] , Несмотря на недавний прогресс в диагностике и лечении ранних стадий рака желудка, скорость выживания в долгосрочной перспективе для поздних стадий рака желудка низка [5]. Основными задачами в лечении распространенного рака желудка являются лимфатической, перитонеального или отдаленные метастазы орган, который одновременно прогнозировать неблагоприятный исход для этих пациентов [6].
Хотя многие онкогенов и опухолевых супрессоров сообщалось, участвует в развитии желудка карцином , молекулярные механизмы, лежащие в основе метастазирования передовых желудочных карцином все еще плохо изучены [7]. Одним из ключевых событий в желудочном канцерогенезе воспаление. Воспаление приводит к активации фактора транскрипции ядерного фактора-kappaB (NF-kB), который связан с желудка канцерогенеза [8, 9].
МикроРНК (миРНК) участвуют в развитии и прогрессии рака желудка [10- 13]. микроРНК является классом эндогенного, некодирующих, одноцепочечных молекул РНК приложения. 22 нуклеотида, которые опосредуют пост-транскрипционной регуляции экспрессии генов посредством спаривания оснований с нетранслируемой области 3 '(UTR) целевых РНК (мРНК) [14]. микроРНК участвуют в регуляции большинства клеточных процессов, включая пролиферацию клеток, миграцию, дифференцировку и апоптоз [10, 14, 15]. микроРНК аберрантно выражены в большинстве злокачественных опухолей человека и, как белок-кодирующих генов, микроРНК может функционировать либо как супрессоров опухолей или онкогенов, тем самым регулируя канцерогенез [10, 12]. микроРНК-146а (MIR-146a) регулируется NF-kB и ингибирует интерлейкин-1 рецептор (IL-1R) и Toll-подобных рецепторов (TLR) - индуцированную активацию NF-кВ путем охвата интерлейкин-1 рецептор-ассоциированной киназы 1 (irak1) и TNF рецептор фактора, связанный 6 (TRAF6) [16-18]. микроРНК-146а было сообщено аберрантно выражается в ряде воспалительных заболеваний и рака, но роль микроРНК-146а при раке желудка остается спорным, как выражение микроРНК-146а был найден как вверх и вниз регулируется здесь [19-24 ]. Таким образом, мы исследовали экспрессию микроРНК-146а при раке желудка и охарактеризованы его цели и молекулярные функции прояснить противоречивые выводы.
Мы обнаружили, что микроРНК-146а составляет Регулируют в мышиной модели рака желудка, а также в желудка аденокарциномы человека и определил CARD10 и COPS8 в качестве новых прямых целей микроРНК-146а. Оба являются частью G-белком рецептор (GPCR) опосредованной трансдукции сигнала, который опосредует активацию NF-kB. Это говорит о том, что микроРНК-146а действует опухолевый подавляя путем ингибирования GPCR-опосредованной активации NF-kB и полученное выражение опухолевых промотирующее цитокинов и факторов роста.

Результаты экспрессии микроРНК-146а является повышающей регуляции в мыши модель рака желудка и в желудочном аденокарциномы человеческих
гастрин нокаута (КО) мышей ахлоргидрия и развивать кишечной метаплазии и желудка аденомы с течением времени [25]. С помощью количественной ПЦР (КПЦР) мы нашли выражение микроРНК-146а приложения. В 2 раза до регулируемой в старых гастрина мышей KO либо с фундальном кишечной метаплазии или антральном аденомы по сравнению с выражением в дикого типа (WT) мышей (P < 0,05) (рис 1А). Использование in-situ
гибридизация MIR-146а был обнаружен в метапластического желудочной ткани от гастрина мышей KO, но не в нормальной ткани желудка у мышей WT (рис 2ab) (Дополнительный file1: Рисунок S1). Установив, что микроРНК-146а увеличивается в нашей мышиной модели рака желудка мы исследовали экспрессию микроРНК-146а в спаренных желудка аденокарциномы человека и прилегающих к ним биопсий контроля и обнаружили, что это было до регулируемых в 27 из 37 случаев (73%) ( Фигура 1В). In-situ гибридизации
показали, что микроРНК-146а выражалось человеческих клеток аденокарциномы желудка, в то время как микроРНК-146а-позитивные клетки не были обнаружены в нормальном слизистой оболочки желудка (рис 2CD) (Дополнительный файл1: Рисунок S1). Рисунок 1 Увеличение экспрессии микроРНК-146а в гастрина KO мыши модели рака желудка и рака желудка человека. (A) Относительное выражение микроРНК-146а в метапластического фундальном ткани (п = 8) и гиперпластический антральный слизистую оболочку (п = 4) /антральных аденомы (п = 4) от гастрина нокаута (KO) мышей по сравнению со средним выражением в согласовании дикого типа (WT) мышей ткани. * = Р &л; 0.05. (B) Водопад участок экспрессии микроРНК-146а в 37 желудка аденокарциномы человека по отношению к экспрессии в соседней нормальной ткани. микроРНК-146а был до регулируемых в 27 из 37 опухолей (73%). Уровни экспрессии микроРНК-146а определялись кПЦР и нормализовали к тем эндогенного управления RNU44.
Рисунок 2 На месте обнаружения гибридизации экспрессии микроРНК-146а в гастрин KO мыши желудка модели рака и рака желудка человека. (А) Выражение MIR-146а не был обнаружен в WT ткани фундальную мыши, (б) в то время как микроРНК-146а-позитивные клетки (синие ядра) были обнаружены в метапластического фундальном ткани из гастрина мышей KO. (С), сигнал не был обнаружен с зашифрованным МШУ зонда. (D) экспрессии микроРНК-146а отсутствовал в нормальной человеческой ткани желудка, (Е), но присутствуют в желудочных клеток аденокарциномы человека (синие ядер). (F) Отрицательный контроль с использованием шифрованного МШУ зонда. Представитель MIR-146A-позитивные клетки обозначены стрелками. Оригинальное увеличение x20, Шкала бар = 100 мкм.
Там не было никакой корреляции между экспрессией микроРНК-146а в желудочном аденокарциномы и пациентов "возраст, пол и локализация или классификация опухолей (данные не показаны). Хотя пациенты с высокой экспрессии микроРНК-146а, казалось, лучше общую выживаемость в этом не было статистически значимым. (Дополнительная file1: Рисунок S2)
микроРНК-146A задания членов GPCR-опосредованной NF-kB активации пути
Продемонстрировав повышенная экспрессия микроРНК-146а в большинстве рака желудка, мы хотели установить биологические действия микроРНК-146а, характеризуя свои прямые молекулярные мишени при раке желудка человека. Мы хотели сделать это сверхэкспресирующим MIR-146a в клетках рака желудка, а затем идентифицировать мРНК с уменьшенным выражением [26]. Таким образом, мы исследовали экспрессию микроРНК-146а в панели клеточных линий и нашли разнообразное, но на удивление низкой экспрессии микроРНК-146а в доступных желудка клеточных линий (Дополнительная файла1: Рисунок S3), принимая во внимание обнаруженный избыточная экспрессия в опухолях <. BR> The желудка человека линии клеток рака SNU638, которая имеет пренебрежимо уровни эндогенных микроРНК-146а был найден подходит для микроРНК-146a сверхэкспрессии исследований. Так как экспрессия микроРНК-146а была очень низкой в ​​тестируемых линий клеток желудка исследования ингибирования микроРНК-146A не были проведены.
Мы сначала проверили, если избыточная экспрессия микроРНК-146а повлияло на рост SNU638 клеток и обнаружили рост клеток не влияет ( Дополнительные file1: Рисунок S4). Впоследствии были рассмотрены глобальные изменения в экспрессии генов в клетках SNU638 следующие избыточная экспрессия микроРНК-146а. После того, как микроРНК-146a трансфекции с предсказанными мРНК 3'UTR микроРНК-146a целевых сайтов были значительно понижающей регуляции по сравнению с прогнозируемыми без мРНК мишеней сайтов (P &Лт; 4.6e-11, два хвостами Уилкоксона тест суммы рангов) (рис 3А) , Мы проанализировали все слова длины 5-7 для перепредставленности в понижающей регуляции мРНК после микроРНК-146а трансфекцией и нашел слово сильнейшим коррелировала с понижающей регуляции был местом семян, комплементарную зрелых микроРНК-146а основания 2-7 /8 ( Фигура 3В). Стенограммы с предсказанными 3'UTR микроРНК-146a целевых сайтов, которые были значительно понижающей регуляции при микроРНК-146а трансфекцией рассматривались в качестве потенциальных мишеней прямых микроРНК-146a. 847 соответствует этим критериям (дополнительный file1: Таблица S5). Топ-10 наиболее понижающего регулируемые потенциальные мишени микроРНК-146A показаны на рисунке 3C. В качестве отрицательного контроля проверки мы повторили процедуру для обработки SNU638 клеток с ингибитором МШУ с микроРНК-146а. Там не было никакого существенного повышающая регуляция генов с сайта семян, комплементарным зрелых микроРНК-146а оснований (данные не показаны). Рисунок 3 Идентификация микроРНК-146a целей. (A) Прогнозируемая микроРНК-146A мишени транскрипты значительно вниз регулируется после микроРНК-146а трансфекции по сравнению с выраженными генами, которые не предсказанных целей микроРНК-146а (P &ЛТ; 4.6e-11, двусторонний Уилкоксона тест суммы рангов) , (B) Топ слова 10 наиболее коррелируют с понижающей регуляции (корреляции Z-баллы указаны слева от каждого слова, все 10 слов имеют расчетную FDR &1е Лт;-6). Заглавные буквы выделить семян область микроРНК, Уотсона-Крика пар оснований (синий), несовпадения (красный). Слово сильнейшим коррелировало с понижающую регуляцию был местом семян дополнением к зрелой микроРНК основания 2-7 /8. (C) Стенограммы, имеющие 6mer или 7mer семян сайты микроРНК-146A в 3'UTR, которые являются наиболее понижающей регуляции на микроРНК-146а трансфекцией показаны. Они являются потенциальными объектами прямых микроРНК-146A. Выражение дается в изменении log2 сгиба. В 3'UTR 6 м /7 м столбцах указывается количество 6- или 7mer микроРНК-146a семенных участков в 3'UTR.
Трех наиболее понижающей регуляции генов при MIR-146а избыточная экспрессия, irak1, набора каспазы домен-содержащий белок 10 (CARD10) и COP9 конститутивный photomorphogenic гомолог субъединица 8 (COPS8) (рис 3C) принадлежат к сигнальных путей, приводящих к активации NF-kB [27-29]. Irak1 является известной мишенью микроРНК-146а участвует в TLR- и IL-1R-опосредованной активации NF-kB [16-18]. CARD10 участвует в GPCR опосредованной активации NF-kB [27], в то время как COPS8, как полагают, вовлечены в этот путь на основе его участия в клеточного рецептора Т (TCR) -опосредованной активации NF-kB [28]. Удивительно, но похоже на выводы Болдин и др.
[30], выражение TRAF6, который ранее был описан в качестве мишени микроРНК-146а [16, 18, 31], не была уменьшена на транскрипционном уровне после микроРНК-146а избыточная экспрессия в нашей модели системы.
при раке желудка, NF-kB модулирует выживаемость клеток, иммунитет и воспаление, и активация NF-kB связана с плохим исходом при раке желудка [32, 33]. Таким образом, мы сосредоточены на характеризующие CARD10 и COPS8, как прямой микроРНК-146a целей и их роли в активации NF-kB при раке желудка. Мы подтвердили микроРНК-146а-опосредованной понижающей регуляции CARD10, COPS8 и irak1 на уровне транскрипт (рис 4A), а также обнаружили, что микроРНК-146а пониженные уровни CARD10, COPS8 и белка irak1 (рис 4б). Наконец, прямая ориентация на MIR-146а к 3'UTRs генов-мишеней была продемонстрирована с использованием люциферазы анализов (рис 4в). Таким образом, мы подтвердили более ранние наблюдения, показывающие, что микроРНК-146а непосредственно цели irak1 и мы, кроме того, определили две новые цели, CARD10 и COPS8, который кодирует белки предложили участвовать в активации NF-kB. COPS8 является компонентом COP9 signalosome, который состоит из восьми субъединиц (GPS1 и COPS2-8) [34]. COPS8 является единственной субъединицей мишенью непосредственно MIR-146, но так как изменения в количестве отдельных субъединиц Было показано, что влияет на количество других субъединиц [35, 36], мы рассмотрели, как трансфекция с микроРНК-146а повлияло выражение всех COP9 signalosome компоненты. В нестимулированных клетках экспрессия COPS2 была снижена (20%) (дополнительный файла1: Рисунок S5). Поэтому мы предполагаем, что влияние микроРНК-146а на COP9 комплекса в основном являются результатом снижения экспрессии COPS8, хотя косвенным дестабилизация комплекса не может быть исключена. Рисунок 4 CARD10 и COPS8 являются прямыми целями микроРНК-146A. (A) экспрессия мРНК двух новых мишеней микроРНК-146a, CARD10 и COPS8 и irak1, известной мишени miR_146a, определяли кПЦР в контрольную или микроРНК-146a-трансфицировали SNU638 клеток. Экспрессия каждого транскрипта показана по отношению к экспрессии в контрольных клетках трансфецированных. CARD10, COPS8 и экспрессия irak1 подавлялась следующие MIR-146A избыточная экспрессия. Данные представлены в виде среднего значения ± S.D. из четырех биологических повторностях. * = Р &л; 0,05, ** = Р &л; 0,01, *** = P &л; 0,001. (B) микроРНК-146а трансфекцию также снижает уровни протеина CARD10, COPS8 и irak1 в микроРНК-146а-трансфицированных SNU638 клеток. Выражение каждого белка показана по отношению к экспрессии в контрольных клетках трансфецированных. Полосы были количественно определены по отношению к бета-актина. Данные представлены в виде среднего значения ± S.D. из четырех биологических повторностях. * = Р &л; 0,05, ** = Р &л; 0,01, *** = P &л; 0,001. (C) Проверка прямого и функционального связывания мишени с использованием люциферазы конструкции, удерживающие WT 3'UTRs и мутировавшие (MUT) 3'UTRs (центральный 4 нуклеотид были заменены на сайт связывания микроРНК-146а) для CARD10, COPS8 и irak1. Конструкты, содержащие либо WT или мутантный (MUT) 3'UTRs вниз по течению к гену люциферазы светлячка котрансфицируют в клетки НЕК293 вместе с Renilla управления люциферазы плазмиды и либо MIR-146а или контроля (Siglo). Слева, активность люциферазы задается относительно активности в контрольных-трансфицированных клетках. микроРНК-146a снижается активность люциферазы конструкций с WT CARD10, COPS8 и irak1 3'UTRs. Право, последовательность створах MIR-146а и потенциального WT и целевых сайтов Мут 3'UTR показаны, мутированные основания показаны красным цветом. Данные представлены в виде среднего значения ± S.D. часто биологические повторности. *** = P &л; 0,001. Выравнивание последовательностей адаптированы из DIANALab (2009).
MIR-146a ингибирует GPCR-опосредованную активность NF-кВ путем пристреливать CARD10 и COPS8
CARD10 и COPS8 участвуют в GPCR опосредованной активации NF-kB [28, 29 ]. Поэтому мы хотели установить их роль в передаче сигнала при раке желудка, а затем исследовать важность микроРНК-146а для ингибирования эту сигнализацию. Для этого мы использовали lysophosphatiditc кислоту (LPA), которая является известным активатором GPCR-опосредованной NF-kB-активации пути [29], а также способствует желудочной миграции раковых клеток и инвазии [37]. МПУ-stiumlation значительно возросла активность NF-kB в нашей люциферазы системы репортер (рисунок 5). миРНК нокдаун CARD10 и экспрессия COPS8 значительно ингибирует МПУ-стимулированный GPCR опосредованной активации NF-kB в клетках SNU638 (рисунок 5). Это торможение было сравнимо с торможением с микроРНК-146а-индуцированной. В противоположность этому, ингибирование эндогенного микроРНК-146а был без эффекта на активацию NF-kB. Как и предсказывалось, миРНК-опосредованной подавление экспрессии irak1 не влияет на МПУ-стимулированную активацию NF-kB (рисунок 5) в качестве irak1 не участвует в GPCR-опосредованный путь. Поскольку TRAF6 является мишенью микроРНК-146а с ролью в активации NF-kB, эффект киРНК-опосредованного подавления экспрессии TRAF6 на МПУ-стимулированной активности NF-kB была исследована. Однако нокдаун TRAF6 не ингибирует МПУ-стимулированный NF-kB активность (рисунок 5). Эти результаты указывают на то, что две вновь выявленные цели микроРНК-146A, CARD10 и COPS8, участвуют в ХВГФ-опосредованной активации NF-kB. Таким образом, было изучено влияние микроРНК-146а избыточная экспрессия на МПУ-стимулированной активности NF-kB. микроРНК-146а значительно ингибирует МПУ-стимулированной активности NF-kB в клетках SNU638 (рисунок 5). Смесь миРНК против CARD10, COPS8, irak1 и TRAF6 имитировал микроРНК-146а-опосредованное ингибирование активности NF-kB (рисунок 5). Нокдаун двух других компонентов КС9 (COPS2 и COPS5) также ингибирует МПУ-стимулированной активности NF-kB, демонстрируя важность присутствия всех COP9 signalosome субъединиц для МПУ-стимулированной активации NF-kB. КПЦР экспрессии различных компонентов, рассмотренных подтвердили нокдаун (рис 5). Рисунок 5 мишеней микроРНК-146A COPS8 и CARD10 GPCR опосредованной активации NF-kB. Клетки были SNU638 котрансфицируют NF-kB репортер плазмиды и плазмиды Renilla управления люциферазы наряду с контролем (Siglo), миРНК или микроРНК-146а. Клетки стимулировали измеряли 25 мкМ LPA и активность люциферазы. Активность люциферазы задается относительно деятельности в управлении трансфицированных МПУ-стимулированных клеток. миРНК против CARD10 и COPS8, MIR-146а, ингибитор микроРНК-146а и миРНК смесь пониженной активности люциферазы. миРНК против irak1 и TRAF6 не снижают активность люциферазы. МПУ-стимулированной активации NF-kB также ингибируется миРНК против COPS2 и COPS5, демонстрируя, что другое возмущение COP9 signalosome комплекса уменьшает GPCR-опосредованную активацию NF-kB. siMix, смесь из миРНК против CARD10, COPS8, irak1 и TRAF6. Данные представлены как среднее ± S.D. из семи биологических повторностей * = Р &л.; 0.05. Относительное выражение TRAF6, COPS8, irak1, CARD10, COPS2 и COPS5 измеряли с помощью КПЦР. Серо-затенение указывает на существенное изменение в экспрессии, р &ЛТ; 0,05, п = 4.
экспрессии микроРНК-146а частично контролируется NF-kB. Поэтому мы также проверили, как экспрессия микроРНК-146а была затронута МПУ и IL-1 стимуляции. Мы обнаружили, что лечение МПУ удвоилась экспрессию микроРНК-146а и IL-1 стимуляции дал 4-кратное увеличение экспрессии микроРНК-146а, что сравнимо с более ранними наблюдениями [16, 38] (Дополнительный файл1: Рисунок S6). Хотя микроРНК-146а МШУ увеличил экспрессию трех микроРНК-146a мишеней (TRAF6, irak1 и CARD10) (рисунок 5) общая активация NF-kB не был изменен в МПУ-стимулированной микроРНК-146а МШУ лечение SNU638 клетки.
микроРНК-146а снижает МПУ-индуцированную экспрессию цитокинов и факторов роста,
В большинстве карцином микросреды факторов, а не генетические изменения, вероятно, ответственны за активацию сигналов NF-kB, который регулирует несколько процессов, в том числе секреции факторов роста и цитокинов [39, 40]. Поэтому мы исследовали, как микроРНК-146a модулирует экспрессию выбранных NF-kB-регулируемых факторов роста и цитокинов, индуцируемых внеклеточному сигналами, такими как LPA. МПУ-стимуляция значительно повышенную экспрессию интерлейкина-6, -8, 23А (ИЛ-6, ИЛ-8, IL-23A) и хемокинов (CC мотив) лигандом 5 (CCL5), колониестимулирующий фактор 1 (макрофаг) (CSF- 1) и тромбоцитарный фактор роста бета полипептид (PDGFB) в SNU638 клетках (рис 6). Это подтверждает, что экспрессия этих генов регулируется МПУ-индуцированной активности NF-kB. Избыточная экспрессия микроРНК-146а значительно уменьшилось экспрессию IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 и PDGFB в SNU638 клеток (рисунок 6). Несмотря на то, IL-6 представляет собой целевой ген NF-kB, а также повышалась от МПУ MIR-146а избыточная экспрессия не снижал экспрессию IL-6 в наших условиях (рисунок 6). Тем не менее, МПУ индукция экспрессии IL-6 не только опосредовано NF-kB, но и через другие пути (МАРК /ERK, PI3K /Akt и p38) [41], которые могут способствовать различия. В клетках SNU638 базальный уровень IL-6 выше, чем IL-8, которые могут повлиять на оборот мРНК. Это может быть частью той причине, что микроРНК-146а оказывает меньшее влияние на МПУ-стимулированной экспрессии IL-6, чем на IL-8 выражение, которое также было замечено в других клеточных системах [42]. Рисунок 6 микроРНК-146a ингибирует МПУ-индуцированную экспрессию цитокинов. 25 мкМ LPA использовали для индукции экспрессии цитокинов из карциномы желудка SNU638 клеток человека. МПУ значительно усиленную экспрессию IL-6, IL-8, IL-23A, CCL5, КСФ-1 и PDGFB, которое было измерено с помощью КПЦР и показанного по отношению к уровню экспрессии в необработанных клетках контроля. Этот ответ снижается в микроРНК-146a-трансфецированных клеток. Данные представлены в виде среднего значения ± S.D., п = 4, * = Р &л; 0,05, нс = не значительна.
MIR-146A избыточная экспрессия в клетках SNU638 уменьшает набор моноцитов
В карцином моноциты могут быть приняты на работу, например, CCL5 и КСФ-1 выражали опухолевыми клетками, и эта опухоль инфильтрацию моноцитов способствует опухолевой способствующего воспалительной реакции в раке [39, 40]. Продемонстрировав, что микроРНК-146а снижается МПУ-индуцированную экспрессию цитокинов, мы рассмотрели, как микроРНК-146а избыточная экспрессия влияет набор моноцитов. Мы обнаружили, что МПУ-обработка клеток SNU638 усиление миграции моноцитов в сторону кондиционированной среды из SNU638 клеток (рисунок 7 и дополнительным file1: Рисунок S7), тогда как трансфекция с микроРНК-146а частично аннулировал этот ответ (рисунок 7), снова демонстрируя, что MIR -146a ингибирует биологическую реакцию GPCR-опосредованной активации NF-kB, такие как, набора моноцитов. Рисунок 7 микроРНК-146а снижает миграцию моноцитов. Моноцитов миграция против кондиционированной среды из или микроРНК должного обеспечения-146a-трансфицировали SNU638 клеток, которые оставляли необработанными или стимулированных 25 мкМ LPA последовало в течение 8 часов. Миграция клеток показана по отношению к миграции с необработанными контрольными клетками. Моноцитов миграция против среды из МПУ-стимулированных SNU638 клеток была увеличена по сравнению с миграцией против среды из необработанных клеток, в то время как моноциты миграция против среды от MIR-146а-трансфицировали, МПУ-стимулированных клеток была снижена по сравнению с среды из контрольно-трансфицировали, МПУ-стимулированной клетки. Данные представлены в виде среднего значения ± S.D. из четырех биологических повторностях. ** = P &л; 0,01, нс = не значительна.
Обсуждение
микросреды факторы играют важную роль для активации NF-kB в воспалительных процессах управляемых видов рака, таких как рак желудка и этой активации NF-kB может обеспечить раковые клетки с преимуществами, которые вносят вклад в tumorgenic процессы [32, 43]. Модуляция NF-kB-активирующей сигнализации Поэтому очень важно для контроля развития опухоли воспаление опосредованной. Здесь мы покажем, что микроРНК-146а является центральным негативным регулятором активации NF-kB, как он ингибирует несколько NF-kB-активирующие пути.
Экспрессии микроРНК-146а был найден до регулируемых в приложении. 2/3 желудка аденокарциномы человека, а также в гастрина KO мышиной модели рака желудка. Аналогичным образом, экспрессия микроРНК-146а было обнаружено, увеличилось в шейки матки, молочной железы, поджелудочной железы и рака щитовидной железы [11, 44-46]. Ранее экспрессия микроРНК-146а был найден как вверх и вниз регулируется при раке желудка [21-24]. Эти противоречивые результаты могут отражать различия в опухолях и их микросреду, что приводит к различным степеням деятельности NF-kB, который контролирует экспрессию микроРНК-146а [16]. Удивительно, но мы обнаружили низкие уровни микроРНК-146а в желудочном линиях раковых клеток человека. Это может свидетельствовать о том, что повышенные уровни микроРНК-146A видели в опухолях являются пробежала факторами микроокружения например клетки, окружающие клетки опухоли.
Для изучения влияния повышенных уровней микроРНК-146a при раке желудка мы определили две новые цели микроРНК-146а, CARD10 и COPS8 и исследованные роли этих целей. Мы обнаружили, что микроРНК-146а ингибировать GPCR-опосредованную активацию NF-кВ непосредственно ориентации и вниз регуляции экспрессии CARD10 и COPS8. CARD10, как известно, требуется для ХВГФ-индуцированной активации NF-kB [27, 29], в то время как COPS8 является субъединицей COP9 signalosome, который контролирует активацию NF-kB [28, 47]. Мы показали, что CARD10 участвует в GPCR опосредованной активации NF-kB, и при условии, что новые доказательства того, COPS8 участвует в этом пути, а также. микроРНК-146а избыточная экспрессия также приводил к снижению экспрессии COPS2, другой субъединицы COP9 signalosome. Мы предполагаем, что это косвенный эффект, так как не существует сайт связывания микроРНК-146а в COPS2 3'UTR и изменения в экспрессии одной субъединицы было показано, что влияет на другого [35, 36]. Поэтому возможно, что микроРНК-146а в некоторой степени может действовать не только против COPS8 но дестабилизацию COP9 signalosome.
Аберрантной сигнализации через GPCR, был связан с ростом опухоли и выживаемость клеток и NF-kB-активирующие GPCRs было показано, что вклад в широком диапазоне видов рака (обзор Dorsam &Amp; Gutkind [48]). GPCRs могут активировать NF-kB с помощью
в CARD10 /BCL10 /MALT1 комплекса после связывания лигандов, таких как МПУ, enothelin-1, ангиотензин II (Ang II) и хемокина (СХС мотив) лиганда 12 (CXCL12) (рисунок 8) [ ,,,0],29, 49]. В нашем исследовании мы использовали МПУ для моделирования GPCR-опосредованную активацию NF-kB. МПУ-индуцированной GPCR сигнализации приводит к опухолевой прогрессии [49]. Таким образом, микроРНК-146а-опосредованная ингибирование GPCR сигнализации может иметь опухолевые подавления эффектов. Рисунок 8 микроРНК-146A мишени множественные NF-kB путей активации. Схематическое изображение NF-kB-активирующие путей. микроРНК-146а ранее было показано, что целевой irak1 и TRAF6 и в этом исследовании мы показали, что микроРНК-146а цели CARD10 и COPS8. микроРНК-146A цели отмечены красными кругами.
В дополнение к GPCR опосредованной активации NF-kB, NF-kB может быть активирована с помощью
некроза опухолей-рецептора фактора (TNFR), IL-1R, TLR, ТКС и В-клеточный рецептор (BCR) [50] (рис 8). Ранее микроРНК-146а было показано, ингибирует активацию NF-kB через
этих рецепторов путем снижения регуляции экспрессии TRAF6 и irak1 [16, 18, 30, 31]. микроРНК-146а цели irak1 в желудочном раковых клеток, но не TRAF6. Несмотря на то, мы здесь, показывают, что микроРНК-146а цели GPCR-опосредованной активации NF-kB, в дополнение к активации через
TNFR, IL-1R, TLR, TCR и BCR, путем ориентации CARD10 и COPS8 (рисунок 8). Таким образом, микроРНК-146а предназначено для нескольких компонентов NF-kB-активирующих путей в клетках рака желудка. Это не было показано на пути NF-kB и раньше, но ранее был замечен в трансформирующего фактора роста-бета (TGF-бета) пути, где оба MIR-21 и целевой кластер микроРНК-17-92 несколько мРНК, кодирующей белки в TGF-бета пути [51, 52]. Ориентируясь несколько компонентов различной NF-kB-активирующий дорожками микроРНК-146а медиатором надежный и комплексный контроль активности NF-kB. Несколько других микроРНК может также регулировать NF-kB-сигнализацию, но только микроРНК-146A мишени нескольких генов в различных NF-kB-активирующие пути, предлагая MIR-146A в качестве ключевого модулятора активации NF-kB.
NF-kB регулирует экспрессия цитокинов и факторов роста, участвующих в нескольких аспектах прогрессии опухоли [43]. Учитывая, что микроРНК-146а снижает активность NF-kB, то возможно, что микроРНК-146а действует опухолевый подавляя путем снижения экспрессии таких цитокинов и факторов роста. Действительно, мы обнаружили, что микроРНК-146а сверхэкспрессии пониженную экспрессию нескольких цитокинов и факторов роста с известной роли в развитии рака; ИЛ-8, IL-23A, CCL5, КСФ-1 и PDGFB. Эти гены могут увеличить клеточную пролиферацию, клеточную адгезию и ангиогенез [53-55], способствуют опухоли лимфангиогенеза [56], активировать фибробласты [57], рекрутировать моноциты опухолей [39, 40] и индуцируют ассоциированные с опухолью макрофаги (ТАМ) к секретируют опухолевые промотирующее медиаторы [58] (рисунок 9). Рисунок 9 биологических процессов в клетках рака желудка ингибируется MIR-146а. Левая панель, микроРНК-146а непосредственно нацелен на irak1, CARD10 и COPS8 в SNU638 клетках. Это приводит к ингибированию активации NF-кВ и, следовательно, к подавленной экспрессией NF-kB-регулируемых цитокинов и факторов роста. Выражение MIR-146а также регулируется NF-kB [16]. Правая панель, микроРНК-146а снижает экспрессию CCL5, CSF-1, IL-8, PDGF и IL-23A, которые участвуют в миграции моноцитов и дифференцировки, пролиферации, ангиогенеза, лимфангиогенеза и фибробластов и роста макрофагального фактора высвобождения. Таким образом, микроРНК-146а может выступать в качестве супрессора опухоли путем уменьшения рака способствующего влияния активности NF-kB.
Хемотактической цитокины, выделяемые опухолевыми клетками могут рекрутировать моноциты опухолевых участков [39, 59]. Эти моноциты могут способствовать прогрессии опухоли [60]. CCL5 и CSF-1 являются примерами моноцитов набора цитокинов, выпущенных опухолевых клеток [39, 40]. Как и ожидалось, моноциты миграция меньше против кондиционированной среды из МПУ-стимулированных клеток SNU638 сверхэкспресирующим MIR-146A по сравнению с МПУ-стимулированных контрольных клеток. Рисунок S2. Рисунок S3. Рисунок S4. Рисунок S5. Рисунок S6. Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• Одновременная избыточная экспрессия мутации р53 в сыворотке крови, связанной с Helicobacter Pylori infection
• Интраневрального метастазирования рака желудка приводит к седалищного нерва palsy