microRNA-146a inhibuje spriahnutý s G proteínom aktivácie receptora sprostredkovanej NF-kB zacielením CARD10 a COPS8 u karcinómu žalúdka

mikroRNA-146a inhibuje aktiváciu receptorov sprostredkovanú G-proteínom NF-kB zacielením CARD10 a COPS8 u karcinómu žalúdka
abstraktné
pozadia
žalúdka Rakovina je druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu súvisiacich v svet. Zápalové signály pochádzajúce z buniek karcinómu žalúdka sú dôležité pre nábor zápalové bunky a regulácia metastázy rakoviny žalúdka. Niekoľko microRNA (miRNA), bolo preukázané, že sa podieľajú na rozvoji a progresiu karcinómu žalúdka. miRNA-146a (MIR-146a) je modulátor zápalových signálov, ale málo sa vie o jeho význame v rakovine žalúdka. Preto sme chceli identifikovať cieľov Mir-146a v karcinómu žalúdka a posúdi jeho biologická úloha.
Výsledky
expresie MIR-146a bola hodnotená pomocou kvantitatívnej PCR (qPCR) a zistilo sa, up-regulované u myší gastrín vyraďovacích , myší model karcinómu žalúdka, a v 73% skúmaných v žalúdku človeka adenokarcinómov. Expresie MIR-146a od buniek karcinómu žalúdka bola potvrdená in situ hybridizácia
. Globálna analýza zmien hladiny mRNA po MIR-146a transfekcia identifikovali dva zápisy, kaspázy nábor doménu obsahujúce proteín 10 (CARD10) a COP9 signalosomu komplex podjednotky 8 (COPS8), pretože nové MIR-146a cieľov. qPCR, Westernový prenos a luciferázové testy potvrdili tieto prepisy ako priame cieľov MIR-146a. CARD10 a COPS8 bolo preukázané, že je súčasťou spriahnutý s G proteínom receptor (GPCR) dráhy aktivácie jadrového faktora-kappaB (NF-kappaB). kyselina lysofosfatidová (LPA) indukuje aktiváciu NF-kappa B prostredníctvom
tejto dráhy, a zvýšená expresia Mir-146a inhibuje LPA-indukovanú aktiváciu NF-kappa B, znižuje LPA-indukovanú expresiu cytokínov, tumor-propagáciu a rastových faktorov a inhibuje monocytov príťažlivosť .
závery
MIR-146a expresie je up-regulovaná u väčšiny karcinómov žalúdka, kde sa zameriava na CARD10 a COPS8, inhibícia GPCR sprostredkovanú aktiváciu NF-kappa B, čím sa znižuje expresia NF-kappa B-regulované tumor- propagáciu cytokínov a rastových faktorov. Zacielením komponenty niekoľkých NF-kappaB-aktivačných dráh, MIR-146a je kľúčovým prvkom v regulácii NF-kappa B aktivitou.
Kľúčové
rakovina žalúdka Non-kódovanie RNA cytokíny pozadí
rakovina žalúdka Globálne je druhou najčastejšou príčinou úmrtí na nádorové ochorenia [1]. Rozvoj rakoviny žalúdka je ovplyvnená interakcií medzi hostiteľom, životného prostredia a bakteriálnych faktorov. Príklady synergických rizikovými faktormi pre vznik rakoviny žalúdka sú polymorfizmy v génoch zúčastňujúcich sa zápalovej odpovede hostiteľa [2], Helicobacter pylori
(H. pylori
) virulentné faktory [3] a strava bohatá na soli a dusičnanu [4] , Aj napriek nedávny pokrok v detekcii a liečbe včasného karcinómu žalúdka je dlhodobá miera prežitia u pokročilého karcinómu žalúdka je nízka [5]. Najväčšími výzvami pri liečbe pokročilého karcinómu žalúdka sú lymfatické, peritoneálnej alebo vzdialených orgánov metastázy, ktoré zároveň predpovedajú zlý výsledok u týchto pacientov [6].
Hoci mnoho onkogény a nádorové supresormi boli hlásené sa podieľa na rozvoji žalúdočných karcinómov molekulárne mechanizmy, na ktorých sa zakladá metastázy pokročilých karcinómov žalúdka sú stále slabo rozumie [7]. Jednou z kľúčových udalostí v žalúdočnej karcinogenéze je zápal. Zápal vedie k aktivácii transkripčného faktora nukleárneho faktora-kappaB (NF-kB), ktorý je spojený s žalúdočné karcinogenézy [8, 9].
MikroRNA (miRNA), sa podieľajú na rozvoji a progresiu karcinómu žalúdka [10- 13]. miRNA je trieda endogénne nekódujúca, jednovláknové RNA molekúl app. 22 nukleotidov, ktoré sprostredkujú post-transkripčný regulácia génovej expresie pomocou párovanie báz s 3 'netranslatované oblasti (UTR) cieľového messenger RNA (mRNA) [14]. miRNA sa podieľajú na regulácii mnohých bunkových procesov, vrátane bunkovej proliferácie, migrácie, diferenciácie a apoptózy [10, 14, 15]. miRNA aberantne vyjadruje v mnohých ľudských nádorov a, rovnako ako gény kódujú proteíny, miRNA môže fungovať buď ako nádorové supresormi alebo onkogénov, a tým regulovať karcinogenéze [10, 12]. miRNA-146a (MIR-146a), sa riadi NF-kB a inhibuje interleukín-1 receptor (IL-1R) a Toll-like receptora (TLR) - indukovanú aktiváciu NF-kB prostredníctvom zacielenia interleukín 1-kináza 1 spojené s receptorom, (IRAK1) a TNF receptor faktorov súvisiace 6 (TRAF6) [16-18]. MIR-146a bol hlásený aberantne vyjadruje v niekoľkých zápalových ochorení a rakoviny, ale role Mir-146a v karcinómu žalúdka je stále sporná, zatiaľ čo expresia MIR-146a bolo zistené, a to ako hore a down-regulované tu [19-24 ]. Preto sme skúmali expresiu Mir-146a v karcinómu žalúdka a charakterizovaný na jeho ciele a molekulárnej funkcie k objasneniu si odporujúce zistenie.
Zistili sme, že mier-146a je up-regulovaný v myšiam modeli karcinómu žalúdka, ako aj v ľudských žalúdočných adenokarcinómov a identifikovať CARD10 a COPS8 ako nové priame cieľov MIR-146a. Oba sú súčasťou spriahnutý s G proteínom receptor (GPCR) sprostredkovanú signálnu transdukciu, ktorá sprostredkováva aktiváciu NF-kB. To naznačuje, že mier-146a pôsobí nádoru Potlačenie inhibíciou GPCR-sprostredkovanú aktiváciu NF-kB a výsledný expresiu cytokínov, tumor-propagáciu a rastové faktory.
Výsledky
MIR-146a expresie je up-regulovaný v myši model rakoviny žalúdka a v žalúdku človeka adenokarcinómov
gastrín knockout (KO) myši sú achlorhydric a rozvíjať črevné metaplázia a žalúdočných adenómy v priebehu času [25]. Použitie kvantitatívne PCR (qPCR) sme našli expresiu app MIR-146a. 2-násobné up-regulované v starej gastrínu KO myší buď fundusu črevnú metaplázia alebo antrálnej adenóm v porovnaní s expresiou v divokého typu (WT) myší (P menšia ako 0,05) (obrázok 1A). bol detekovaný s použitím in situ hybridizácia
Mir-146a v metaplastického žalúdočnej tkanive z gastrínu KO myší, ale nie v normálnej žalúdočnej tkaniva z WT myší (obr 2ab) (ďalej súbor1: Obrázok S1). Po zistení, že mier-146a je v našej myšiam modeli rakoviny žalúdka zvýšila sme vyšetrili expresiu Mir-146a v párových ľudských žalúdočných adenokarcinómov a priľahlých kontrolných biopsiou a zistil, že to bol up-regulovaný v 27 z 37 prípadov (73%) ( obrázok 1B). In situ hybridizácia
ukázali, že mier-146a bol vyjadrený ľudské bunky adenokarcinómu žalúdka, zatiaľ čo MIR-146a-pozitívne bunky boli v normálnej žalúdočnej sliznice (obr 2CD) (ďalej file1: Obrázok S1) nebol detekovaný. Obrázok 1 Zvýšená expresia Mir-146a v gastrínu KO myši modelu rakoviny žalúdka a ľudskej rakoviny žalúdka. (A) Relatívna expresie MIR-146a v metaplastického fundusu tkanive (n = 8) a hyperplastické antrálnej sliznice (n = 4) /antrálnej adenómov (n = 4) z gastrín knockout (KO) myší v porovnaní s priemernou expresiu v párovaní divokého typu (WT) myší tkanivo. * = P < 0.05. (B) vodopád graf expresie Mir-146a v 37 ľudských žalúdočných adenokarcinómov vzhľadom k expresii v priľahlej normálne tkanive. MIR-146a bola up-regulovaná v 27 z 37 nádorov (73%). Hladiny expresie MIR-146a boli stanovené pomocou qPCR a normalizované k tým endogénnej kontrolnej RNU44.
Obrázok 2 in situ detekciu hybridizácie MIR-146a expresiu v gastrín KO myši žalúdka modeli karcinómu a ľudského karcinómu žalúdka. (A) Expresia MIR-146a nebol detekovaný v WT fundu myší tkanive, (B), zatiaľ čo bolo zistené MIR-146a-pozitívne bunky (modrá jadra) v metaplastického fundusu tkaniva gastrínu KO myší. (C) Žiadny signál nebol detekovaný s miešanými LNA sondy. (D) MIR-146a výraz bol neprítomný v normálnom ľudskom žalúdočné tkaniva, (E), ale ktoré v ľudských bunkách adenokarcinóme žalúdka (modré jadier). (F) Negatívny ovládanie pomocou kódovaného LNA sondy. Reprezentatívny Mir-146A-pozitívne bunky sú označené šípkami. Pôvodný zväčšenie x20, Mierka = 100 um.
Došlo v žalúdočných adenokarcinómov a pacientov 'vek, pohlavie a lokalizácia alebo klasifikácie nádorov žiadna korelácia medzi MIR-146a expresiu (dáta nie sú ukázaná). Aj keď pacienti s vysokým Mir-146a výrazu sa zdalo, že majú lepšie celkové prežívanie toto nebolo významné. (Ďalšie file1: Obrázok S2)
MIR-146A sa zameriava na členov GPCR-sprostredkovanej NF-kB aktivácia dráhy
Potom, čo preukázal zvýšená expresia MIR-146a u väčšiny karcinómov žalúdka, chceli sme nadviazať biologické účinky Mir-146a v charakterizácii jej priame molekulárnej ciele v ľudskom karcinómu žalúdka. Chceli sme to urobiť s nadmernou expresiou Mir-146a v rakovinových bunkách žalúdočnej a potom identifikáciu mRNA so zníženou expresiou [26]. Z tohto dôvodu sme sa zaoberali Mir-146a výraz v paneli bunkových línií a zistil, rozmanitý, ale prekvapivo nízka expresie Mir-146a v dostupných bunkových línií žalúdočných (dodatkového file1: Obrázok S3), so zreteľom na detekovaný nadmernú expresiu v nádoroch <. br> bolo zistené, že rakovina žalúdka ľudská bunková línia SNU638, ktorý má zanedbateľné hladiny endogénneho Mir-146a sa hodí pre mier-146a nadmernú expresiu štúdií. Vzhľadom k tomu, Mir-146a expresie bola veľmi nízka v testovaných bunkových línií, žalúdočné inhibičný štúdie MIR-146A neboli vykonané.
Sme najprv skúmal v prípade nadmernej expresie MIR-146a vplyv na rast buniek, a zistilo sa, SNU638 rast buniek bez zmeny ( ďalšie file1: Obrázok S4). Následne boli skúmané globálne zmeny v génovej expresii v SNU638 bunky nasledujúcej zvýšená expresia MIR-146a. Po MIR-146a transfekčních mRNA s predpokladanými 3'UTR cieľových miestach MIR-146a boli výrazne down-regulované v porovnaní s mRNA bez predpokladaných cieľových hodnôt miest (P < 4.6e-11, dvojchvostý Wilcoxon rank-súčet test) (obrázok 3A) , Analyzovali sme všetky slová s dĺžkou 5-7 pre nadmerné zastúpenie v mRNA down-regulované po MIR-146a transfekcia a zistil, že slovo najsilnejší koreláciu s down-reguláciou bol pozemok semien komplementárne k zrelej Mir-146a základne 2-7 /8 ( obrázok 3B). Prepisy s predpokladanými 3'UTR cieľových miestach MIR-146a, ktoré boli významne down-regulované na MIR-146a transfekciu boli považované za potenciálne priame cieľov MIR-146a. 847 uzavreté týchto kritérií (ďalej súbor1: Tabuľka S5). Prvých 10 najviac down-regulované potenciálnym cieľom MIR-146A sú uvedené na obrázku 3C. Ako negatívna kontrola overenie sme opakovaný postup ošetrujúceho SNU638 bunky inhibítorom MIR-146a LNA. Nebol žiadny významný up-regulácia génov v mieste semien komplementárna zrieť MIR-146a základne (dáta nie sú uvedené). Obrázok 3 Identifikácia MIR-146a cieľov. (A) predpokladaná MIR-146A cieľovej prepisy sú významne down-regulované po MIR-146a transfekciu v porovnaní s exprimovaných génov, ktoré nie sú predpokladaných cieľov MIR-146a (P < 4.6e-11, dvojchvostý Wilcoxonova rank-sum testu) , (B) Top 10 slov najviac koreluje s down-reguláciou (korelačný Z-skóre sú uvedené na ľavej strane každého slova, všetkých 10 slová majú odhadovanú FDR < 1e-6). Veľké písmená zvýrazniť semien regiónu Mirna, Watson-Crick párov báz (modré), V prípade nesúladu (červená). Slovo najsilnejší koreláciu s down-reguláciou bol pozemok semeno komplementárne k zrelej miRNA základne 2-7 /8. sú zobrazené (C) Prepisy, ktoré majú 6mer alebo 7mer semeno miesta MIR-146A v 3 'UTR, ktoré sú najviac down-regulované na MIR-146a transfekciu. Ide o potenciálne priame ciele MIR-146A. Expresia je uvedený v zmene log2 fold. 3'UTR 6 m /7 m stĺpca označujú čísla 6- alebo 7mer MIR-146a semien miest v 3 'UTR.
Troch najviac gény upon MIR-146a over-expresie, IRAK1, kaspázy náboru down-regulované doménu obsahujúce proteín 10 (CARD10) a COP9 konštitutívny photomorphogenic homológov podjednotka 8 (COPS8) (3C), patrí do signálnych dráh, ktoré vedú k NF-kB aktivácia [27-29]. IRAK1 je známy cieľ MIR-146a zúčastňuje TLR- a IL-1R-sprostredkovanú aktiváciu NF-kB [16-18]. CARD10 sa podieľa na GPCR sprostredkovanej aktivácie NF-kB [27], zatiaľ čo COPS8 je myšlienka byť zapojený do tejto dráhy na základe jeho zapojenie do T-buniek (TCR) sprostredkovanej NF-kB aktivácia [28]. Prekvapivo, ale podobná zistenie Boldin et al.
[30], expresia TRAF6, ktorý bol predtým opísaný ako cieľ MIR-146a [16, 18, 31], nebola znížená na transkripčný úrovni po MIR-146a nadmernej expresie v našom modeli systému.
rakoviny žalúdka, NF-kB moduluje bunkové prežitie, imunity a zápal a aktivácia NF-kB je spojená so zlou prognózou u rakoviny žalúdka [32, 33]. Preto sme sa zamerali na charakterizáciu CARD10 a COPS8 ako priamy MIR-146a cieľov a ich úloha v aktivácii NF-kB u rakoviny žalúdka. Potvrdilo sa Mir-146a-sprostredkovanej down-regulácia, CARD10 COPS8 a IRAK1 na úrovni transkriptov (obr 4A), a tiež zistil, že mier-146a zníženej hladiny CARD10, COPS8 a IRAK1 proteínu (Obrázok 4B). Konečne, priame cielenie Mir-146a na 3'UTRs cieľových génov bola preukázaná za použitia luciferázové testy (obrázok 4C). Stručne povedané, potvrdzuje, že by sme skoršie pozorovania ukazujú, že mier-146a sa priamo zameriava na IRAK1 a my navyše identifikovali dva nové ciele, CARD10 a COPS8, ktoré kódujú bielkoviny navrhol, aby sa zapojili do aktivácie NF-kB. COPS8 je súčasťou COP9 signalosomu ktorý sa skladá z ôsmich podjednotiek (GPS1 a COPS2-8) [34]. COPS8 je len podjednotka cielené priamo MIR-146, ale pretože zmena v množstve jednotlivých podjednotiek bolo preukázané, že vplyv na množstvo ďalších podjednotiek [35, 36], sme skúmali, ako transfekcia MIR-146a vplyv expresie všetkých COP9 signalosomové zložky. V nestimulovaných bunkách expresie COPS2 bola znížená (20%) (doplňujúce file1: Obrázok S5). Možno teda súdiť, že účinky Mir-146a na COP9 komplexu vznikajú prevažne z znížením COPS8 výrazu, aj keď nepriamo destabilizácie komplexu nemožno vylúčiť. Obrázok 4 CARD10 a COPS8 sú priame ciele MIR-146A. (A) mRNA expresie dvoch nových MIR-146a cieľov, CARD10 a COPS8 a IRAK1, známym miR_146a cieľ, bola stanovená pomocou qPCR v kontrolnej časti a mier-146a-transfekovány SNU638 bunky. Expresia každého transkriptov je uvedený vo vzťahu k expresii v bunkách kontrolných transfekciou. CARD10, COPS8 a IRAK1 expresie bola down-regulované nasledujúce MIR-146a v priebehu expresie. Dáta sú uvedené ako stredná hodnota ± S.D. zo štyroch biologických opakovaní. * = P < 0,05, ** = P < 0,01, *** = P < 0,001. (B) MIR-146a transfekcia tiež znížil hladiny proteínovej CARD10, COPS8 a IRAK1 v Mir-146a-transfekciou SNU638 bunky. Expresia každého proteínu je ukázaný vo vzťahu k expresii v bunkách kontrolných transfekciou. Pásy boli kvantifikované vzhľadom k p-aktínu. Dáta sú uvedené ako stredná hodnota ± S.D. zo štyroch biologických opakovaní. * = P < 0,05, ** = P < 0,01, *** = P < 0,001. (C) Overenie priame a funkčné cieľ väzbu použitím luciferázové konštrukty drží WT 3'UTRs a zmutované (Mut) 3'UTRs (centrálne 4 nukleotidov boli nahradené v Mir-146a väzobné miesto) pre CARD10, COPS8 a IRAK1. Konštrukty, ktoré obsahujú buď WT alebo mutovaného (MUT) 3'UTRs nadväzujúcom na svetlušky génu luciferázy boli kotransfekovány do buniek HEK293 s Renilla kontrolnej luciferázy plazmidu a buď Mir-146a alebo kontrolou (Siglo). Vľavo, Aktivita luciferázy sú uvedené vo vzťahu k aktivite v bunkách transfekciou kontrolnými. MIR-146a znižuje aktivitu luciferázy u konštrukcií s WT CARD10, COPS8 a IRAK1 3'UTRs. Jasne, sú uvedené sekvenčné zarovnanie Mir-146a a potenciálny WT a cieľových miestach Mut 3'UTR, mutované bázy sú zobrazené v červenej farbe. Dáta sú uvedené ako stredná hodnota ± S.D. Často biologické opakovania. *** = P < 0,001. Porovnanie sekvencií sú prispôsobené z DIANALab (2009).
Mir-146a inhibuje GPCR-sprostredkovanú aktivitu NF-kB zacielením CARD10 a COPS8
CARD10 a COPS8 sú zapojené do GPCR-sprostredkovanú aktiváciu NF-kB [28, 29 ]. Preto sme chceli vytvoriť svoju úlohu v prenose signálu pri karcinóme žalúdka a následne skúmať význam MIR-146a pre inhibíciu túto signalizáciu. Pre tento účel sme použili kyseliny lysophosphatiditc (LPA), ktorý je známym aktivátorom GPCR-sprostredkovanej NF-kB aktivácia dráhy [29], a podporuje žalúdočné migráciu a inváziu [37] rakovinových buniek. LPA-stiumlation výrazne zvýšil NF-kB aktivity v našej luciferázového reporterového systému (obrázok 5). siRNA Vyradenie CARD10 a COPS8 expresie významne inhibujú LPA-stimulovanou aktiváciu GPCR sprostredkovanej NF-kB v bunkách SNU638 (obrázok 5). Táto inhibícia bola porovnateľná s inhibíciu k Mir-146a-indukovanú. Na rozdiel od toho inhibícia endogénnej MIR-146a bol bez vplyvu na aktiváciu NF-kB. Ako bolo predpovedané, siRNA sprostredkované represie expresie IRAK1 neovplyvnilo LPA-stimulovanou aktiváciu NF-kB (obrázok 5), ako je IRAK1 sa nepodieľa GPCR sprostredkovanú dráhu. Ako TRAF6 je MIR-146a terč s rolou pri aktivácii NF-kB, bol skúmaný vplyv siRNA sprostredkované represie TRAF6 prejave na LPA stimulovanej aktivity NF-kB. Avšak, Vyradenie TRAF6 neinhiboval LPA-stimulovanej NF-kB aktivita (Obrázok 5). Tieto výsledky ukazujú, že obaja novo identifikované MIR-146A ciele, CARD10 a COPS8, sú zapojené do GPCR-sprostredkovanú aktiváciu NF-kB. Preto je účinok Mir-146a v priebehu expresie na LPA-stimulovanej aktivity NF-kB bola študovaná. MIR-146a významne inhibujú LPA-stimulovanou aktivitu NF-kB v bunkách SNU638 (obrázok 5). Mix siRNA proti CARD10, COPS8, IRAK1 a TRAF6 napodobnil Mir-146a-sprostredkovanú inhibíciu NF-kB aktivity (obrázok 5). Vyradenie dvoch ďalších zložiek (COP9 COPS2 a COPS5) tiež inhiboval LPA-stimulovanou aktivitu NF-kB, čo dokazuje, že je dôležité prítomnosti všetkých COP9 signalosomové podjednotiek pre LPA stimulovanej aktiváciu NF-kB. qPCR expresie rôznych zložiek skúmaných potvrdila vyraďujúce (Obrázok 5). Obrázok 5 MIR-146A ciele COPS8 a CARD10 GPCR sprostredkovanú aktiváciu NF-kB. SNU638 bunky boli kotransfekovány NF-kB reportérovým plazmidom a Renilla kontrolné luciferázy plazmidu spolu s kontrolou (siglo), siRNA alebo MIR-146a. Bunky boli stimulované 25 uM bola meraná LPA a aktivita luciferázy. Aktivita luciferázy sú uvedené vo vzťahu k činnosti v kontrole transfekované LPA-stimulovaných buniek. siRNA proti CARD10 a COPS8, mier-146a, inhibítor Mir-146a a siRNA mix zníženú aktivitu luciferázy. siRNA proti IRAK1 a TRAF6 neznížila aktivity luciferázy. LPA stimulácia aktivácie NF-kB bola tiež inhibovaná siRNA proti COPS2 a COPS5, čo dokazuje, že druhá odchýlka od COP9 signalosomu komplexu znižuje GPCR-sprostredkovanú aktiváciu NF-kB. SIMIX, mix siRNA proti CARD10, COPS8, IRAK1 a TRAF6. Dáta sú uvedené ako stredná hodnota ± S.D. zo siedmich biologických replika * = P <.; 0.05. Relatívna expresia TRAF6, COPS8, IRAK1, CARD10, COPS2 a COPS5 sa merala qPCR experimentu. Gray-tieňovanie indikuje významnú zmenu v expresii P < 0,05, n = 4.
expresie MIR-146a je čiastočne pod kontrolou NF-kB. Preto sme tiež testovaný, ako je expresia MIR-146a bol ovplyvnený LPA a stimuláciu IL-1. Zistili sme, že liečba LPA zdvojnásobil expresiu Mir-146a a stimuláciu IL-1 dal 4-násobné zvýšenie MIR-146a prejavu, ktorá je porovnateľná s predchádzajúcimi pozorovaniami [16, 38] (ďalej file1: Obrázok S6). Aj keď MIR-146a LNA zvýšil expresiu troch MIR-146a cieľov (TRAF6, IRAK1 a CARD10) (obrázok 5), celková aktivácia NF-kB sa nezmenila v LPA-stimulovaných MIR-146a LNA liečených SNU638 bunky.
MIR-146a znižuje LPA-indukovanej expresiu cytokínov a rastových faktorov
Vo väčšine karcinómov mikroprostredie faktory, skôr než genetické zmeny sú pravdepodobne zodpovedné za aktiváciu NF-kB signalizácia, ktorý reguluje rad procesov, vrátane sekrécia rastových faktorov a cytokínov, [39, 40]. Preto sme skúmali, ako MIR-146a moduluje expresiu vybraných NF-kB-regulovaných rastovými faktormi a cytokínmi indukovaných extracelulárnych signálov, ako je napríklad LPA. LPA-stimulácia významne zvýšili expresiu interleukínu-6, -8, 23A (IL-6, IL-8, IL-23A) a chemokiny (CC motívom) ligand 5 (CCL5), faktor stimulujúci kolónie 1 (makrofágov) (CSF- 1) a od doštičiek odvodený rastový faktor beta polypeptid (PDGFB) v SNU638 bunkách (Obrázok 6). Táto skutočnosť potvrdzuje, že expresie týchto génov je regulované LPA-indukovanú aktivitu NF-kB. Nadmerná expresia MIR-146a významne znížená expresia IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 a PDGFB v SNU638 bunkách (obrázok 6). Aj napriek tomu, že IL-6 je cieľový gén NF-kB, a tiež stimulovaná LPA MIR-146a nadmernej expresie neznižuje expresiu IL-6 v našich podmienkach (obrázok 6). Avšak, LPA indukcia IL-6 expresie nie je iba sprostredkované NF-kB, ale aj prostredníctvom iných cestami (MAPK /ERK, PI3K /Akt a p38) [41], ktoré môžu prispieť k rozdielom. V SNU638 buniek bazálnej hladina IL-6 je vyššia ako IL-8, čo môže mať vplyv na obrat mRNA. To by mohlo byť jedným z dôvodov, že mier-146a má menší vplyv na LPA stimulovanej IL-6 expresie než na IL-8 prejave, ktorý bol tiež videný v iných bunkových systémoch [42]. Obrázok 6 MIR-146a inhibuje LPA-indukovanú expresiu cytokínov. 25 uM LPA bola použitá pre indukciu expresie cytokínov z ľudských karcinómu žalúdka SNU638 bunky. LPA významne zvýšená expresia IL-6, IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 a PDGFB, ktoré bolo merané qPCR experimentu a znázornené v porovnaní s úrovňou expresie u neliečených kontrolných buniek. Táto odozva je znížená v bunkách Mir-146a-transfekovány. Údaje sú uvedené ako priemer ± S. D., n = 4, * = P < 0,05, ns = nevýznamný.
Mir-146a nadmerná expresia v bunkách SNU638 znižuje nábor monocytov
karcinómov monocyty môžu byť prijatí napr. CCL5 a CSF-1 exprimovaný nádorovými bunkami, a to tumor infiltráciu monocytov prispieva k nádorovej podporujúcich zápalové odpovede v rakoviny [39, 40]. Ak preukázali, že mier-146a znížená LPA-indukovanú expresiu cytokínov, sme skúmali, ako Mir-146a v priebehu expresie ovplyvnený nábor monocytov. Zistili sme, že LPA-ošetrenie SNU638 bunky zvýšila migráciu monocytov smerom k kondicionovaného média z SNU638 bunky (obrázok 7 a ďalšie súbor1: obr S7), zatiaľ čo transfekcia s Mir-146a čiastočne zrušil túto odpoveď (obrázok 7), opäť dokazuje, že mier -146 inhibuje biologické odozvy GPCR-sprostredkovanú aktiváciu NF-kB, ako je nábor monocytov. Obrázok 7 MIR-146a znižuje migráciu monocytov. Migráciu monocytov proti upraveného média z ovládajúcimi alebo MIR-146a-transfekovány SNU638 buniek, ktoré boli nelieči alebo stimulovaných 25 mikrónov LPA bola sledovaná po dobu 8 hodín. Migrácia buniek je uvedené vo vzťahu k migrácii neošetrených kontrolných buniek. Migráciu monocytov proti médium z LPA-stimulovaných SNU638 buniek bola zvýšená v porovnaní s migráciou proti médiá z neošetrených buniek, zatiaľ čo migráciu monocytov proti médium z MIR-146a-transfekovaly, LPA-stimulované bunky sa znížila v porovnaní s médiom z ovládacieho transfekovány, LPA stimulovaná buniek. Dáta sú uvedené ako stredná hodnota ± S.D. zo štyroch biologických opakovaní. ** = P < 0,01, ns = nevýznamný.
Diskusia
mikroprostredie faktory sú dôležité pre aktiváciu NF-kB pri zápalových rakoviny-riadené, ako je rakovina žalúdka a táto aktivácia NF-kB môže poskytnúť rakovinové bunky s výhodami, ktoré prispievajú k tumorgenic procesy, [32, 43]. Modulácia NF-kB aktivácia signalizácia je preto dôležité pre riadenie vývoja nádoru zápaly sprostredkované. Tu ukazujeme, že mier-146a je centrálna negatívny regulátor aktivácie NF-kB a inhibuje niekoľko NF-kB aktivácia dráhy.
MIR-146a expresie bolo zistené, up-regulované v aplikácii. 2/3 ľudského adenokarcinómu žalúdka, ako aj v gastrínu KO myšiam modeli karcinómu žalúdka. Podobne, expresia MIR-146a bol nájdený v krčka maternice, prsníka, pankreasu a rakovina štítnej žľazy [11, 44-46] zvýšil. Skôr, expresia MIR-146a bolo zistené, a to ako hore a down-regulované u karcinómu žalúdka [21-24]. Tieto protichodné výsledky môžu odrážať rozdiely v nádoroch a ich mikroprostredie, čo vedie k rôznym stupňom činnosti NF-kB, ktorý riadi MIR-146a vyjadrenie [16]. S prekvapením sme zistili, nízke hladiny Mir-146a v ľudských nádorových bunkových línií žalúdka. To by mohlo naznačovať, že zvýšené hladiny MIR-146A pozorované u nádorov sú chodmi podľa mikroprostredie faktory, napr Bunky obklopujúce nádorové bunky.
Ak chcete skúmať účinky zvýšených hladín Mir-146a v karcinómu žalúdka sme identifikovali dva nové MIR-146a ciele, CARD10 a COPS8, a vyšetroval úloha týchto cieľov. Zistili sme, že mier-146a inhibuje GPCR-sprostredkovanú aktiváciu NF-kB priamo zacielenie a down-reguláciu expresie CARD10 a COPS8. CARD10 je známe, že sa vyžaduje pre GPCR-indukovanú aktiváciu NF-kB [27, 29], zatiaľ čo COPS8 je podjednotka COP9 signalosomu, ktorý riadi NF-kB aktivácia [28, 47]. Ukázali sme, že CARD10 sa podieľa na GPCR sprostredkovanej aktivácie NF-kB a za predpokladu, nové dôkazy, ktoré COPS8 sa podieľa na tejto dráhe rovnako. Mir-146a v priebehu expresie tiež viedlo k zníženiu expresie COPS2, ďalšie podjednotku COP9 signalosomu. Domnievame sa, že ide o nepriamy vplyv, pretože neexistuje žiadny MIR-146a väzobné miesto v COPS2 3 'UTR a zmeny v expresii jednej podjednotky bolo preukázané, že vplyv, že na strane [35, 36]. Je teda možné, že mier-146a do istej miery môže pôsobiť tým, že sa len zacielenie COPS8 ale destabilizácie COP9 signalosomové.
Aberantne signalizácia prostredníctvom GPCR bol napojený na rast nádorových buniek a prežitie, a NF-kB-aktivujúcich GPCR boli preukázané, že prispievajú k širokej škále nádorov (prehľad Dorsam &Co. Gutkind [48]). GPCR môže aktivovať NF-kB prostredníctvom
CARD10 /BCL10 /MALT1 komplexu po väzbe ligandu, ako je LPA, enothelin-1, angiotenzín II (Ang II) a chemokiny (CXC motívom) ligand 12 (CXCL12) (obrázok 8) [ ,,,0],29, 49]. V našej štúdii sme LPA model GPCR-sprostredkovanú aktiváciu NF-kB. LPA-indukovanej GPCR signalizáciu vedie k progresii nádoru [49]. Tak, mier-146a-sprostredkovanú inhibíciu GPCR signalizácia môže mať účinky nádorové potlačenie. Obrázok 8 MIR-146A ciele viac NF-kB aktivácia dráh. Schematické znázornenie NF-kB-aktivačných dráh. MIR-146a Už skôr bolo preukázané, že cieľové IRAK1 a TRAF6 a v tejto štúdii ukazujú, že mier-146a ciele CARD10 a COPS8. MIR-146A ciele sú označené červenými kruhmi.
Okrem GPCR-sprostredkovanú aktiváciu NF-kB, NF-kB môže byť aktivovaný pomocou
tumor-nekrotizujúceho faktora receptora (TNFR), IL-1R, TLR, TCR a B bunkového receptora (BCR) [50] (Obrázok 8). Skôr, MIR-146a bolo preukázané, že inhibuje aktiváciu NF-kB prostredníctvom
týchto receptorov down-reguláciu expresie TRAF6 a IRAK1 [16, 18, 30, 31]. MIR-146a ciele IRAK1 do buniek karcinómu žalúdka, ale nie TRAF6. Aj keď sme sa tu ukazuje, že mier-146a sa zameriava na GPCR-sprostredkovanú aktiváciu NF-kB, navyše k aktivácii cez
TNFR, IL-1R, TLR, TCR a BCR, zameraním CARD10 a COPS8 (Obrázok 8). Tak, mier-146a cielia na viac komponenty NF-kB aktivácia dráh v buniek karcinómu žalúdka. Toto nebolo preukázané pre cesty NF-kB pred, ale bola už skôr vidieť v transformujúceho rastového faktora-beta (TGF-p) dráhy, kde obaja Mir-21 a cieľové klastra Mir-17-92 niekoľko mRNA kódujúce bielkoviny v TGF-p dráhou [51, 52]. Zacieliť na niekoľko zložiek rôznych NF-kB aktivácia dráh MIR-146a sprostredkováva robustné a komplexnú kontrolu NF-kB aktivity. Niekoľko ďalších miRNA môžu regulovať NF-kB signalizácia, ale iba MIR-146A ciele niekoľkých génov v rôznych NF-kB-aktivačných dráh, čo naznačuje, Mir-146a ako kľúčový modulátorom aktivácia NF-kB.
NF-kB reguluje expresie cytokínov a rastových faktorov v niekoľkých aspektoch progresie nádoru [43]. Vzhľadom na to, že mier-146a znižuje NF-kB aktivity, je možné, že mier-146a pôsobí nádoru Potlačenie znížením expresie týchto cytokínov a rastových faktorov. V skutočnosti sme zistili, že mier-146a v priebehu expresie znižuje expresiu niekoľkých cytokínov a rastových faktorov sa známou úlohu v rozvoji rakoviny; IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 a PDGFB. Tieto gény môžu zvyšovať bunkovú proliferáciu, bunkovú adhéziu a angiogenézu [53-55], prispievajú k nádoru Lymfangiogeneze [56], aktivovať fibroblasty [57], nábor monocytmi nádory [39, 40] a indukujú makrofágy tumor asociované (TAM), do vylučujú nádor podporujúci mediátorov [58] (obrázok 9). Obrázok 9 biologických procesov v rakovinových bunkách žalúdku inhibované MIR-146a. Ľavý panel, Mir-146a sa priamo zameriava na IRAK1, CARD10 a COPS8 v SNU638 bunkách. To vedie k inhibícii aktivácie NF-kB a v dôsledku toho potlačený expresie NF-kB-regulované cytokínov a rastových faktorov. Expresie Mir-146a sa riadi tiež NF-kB [16]. Pravý panel, mier-146a znižuje expresiu CCL5, CSF-1, IL-8, PDGF a IL-23A, ktoré sa podieľajú na migráciu monocytov a diferenciácie, proliferácie, angiogenézy, Lymfangiogeneze a fibroblastov a rastu makrofágov uvoľňovanie faktora. Tak, mier-146a môže pôsobiť ako nádorový supresor znížením rakoviny podporujúce účinky NF-kB aktivity.
Chemotaktické cytokíny uvoľnené nádorovými bunkami môže regrutovať monocytov lokalizačné [39, 59]. Tieto monocyty môžu podporovať progresiu tumoru [60]. CCL5 a CSF-1 sú príklady monocytov nábor cytokínov uvoľňovaných nádorovými bunkami [39, 40]. Ako sa dalo očakávať, monocytmi prenesené menej proti upraveného média z LPA-stimulovaných SNU638 bunky s nadmernou expresiou Mir-146a v porovnaní s LPA-stimulovanými kontrolnými bunkami. Obrázok S2. Obrázok S3. Obrázok S4. Obrázok S5. Obrázok S6.

• Súbežné zvýšená expresia p53 v sére mutácie spojené s Helicobacter pylori infection
• Intraneural metastázy karcinómu žalúdka vedie k sedacieho nervu palsy