microARN-146a inhibe G activation de NF-kB médiée par un récepteur couplé à la protéine en ciblant CARD10 et COPS8 dans cancer

gastrique microARN-146a inhibe G activation de NF-kB médiée par un récepteur couplé à la protéine en ciblant CARD10 et COPS8 dans le cancer gastrique
Résumé de l'arrière-plan
le cancer gastrique est la deuxième cause la plus fréquente de décès liés au cancer dans le monde. signaux inflammatoires provenant de cellules de cancer gastrique sont importantes pour le recrutement de cellules inflammatoires et la régulation des métastases du cancer gastrique. Plusieurs microARN (miARN) ont été révélés être impliqués dans le développement et la progression du cancer gastrique. miRNA-146a (miR-146a) est un modulateur de signaux inflammatoires, mais on sait peu de son importance dans le cancer gastrique. Résultats de Nous voulions donc d'identifier des cibles de miR-146a dans le cancer gastrique et examiner ses rôles biologiques.
L'expression de miR-146a est évaluée par PCR quantitative (qPCR) et trouvé régulés à la hausse chez les souris knock-out gastrine un modèle murin de cancer de l'estomac, et dans 73% des adénocarcinomes gastriques humaines étudiées. L'expression de miR-146a par des cellules de cancer de l'estomac a été confirmée par hybridation in situ de. Analyse globale des changements dans les niveaux d'ARNm après miR-146a transfection a identifié deux transcriptions, le recrutement de caspase domaine contenant des protéines 10 (CARD10) et COP9 signalosome complexe sous-unité 8 (COPS8), que de nouvelles cibles miR-146a. qPCR, analyses blot et luciférase occidentaux a confirmé ces transcriptions comme cibles miR-146a directs. CARD10 et COPS8 ont été présentés comme faisant partie de la voie du récepteur couplé aux protéines G (GPCR) du facteur nucléaire kappa B (NF-kB) activation. L'acide lysophosphatidique (LPA) induit l'activation de NF-kappa B via
cette voie et surexpression de miR-146a inhibée induite par le LPA l'activation de NF-kB, l'expression réduite induite par le LPA de cytokines favorisant les tumeurs et les facteurs de croissance et inhibée monocytes attraction .
Conclusions
expression miR-146a est régulée à la hausse dans la majorité des cancers gastriques où il cible CARD10 et COPS8, inhibition de l'activation de GPCR-médiée de NF-kB, réduisant ainsi l'expression de NF-kappa B-régulée une tumeur la promotion des cytokines et des facteurs de croissance. En ciblant les composants de plusieurs voies NF-kappa B-activation, miR-146a est un élément clé dans la régulation de l'activité NF-kappaB.
Mots-clés
cancer de l'estomac non codantes Contexte ARN Cytokines
cancer gastrique est globalement la deuxième cause la plus fréquente de décès liés au cancer [1]. Développement du cancer gastrique est influencée par des interactions entre l'hôte, l'environnement et les facteurs bactériens. Des exemples de facteurs de risque synergiques pour le cancer gastrique sont des polymorphismes dans les gènes impliqués dans la réponse inflammatoire de l'hôte [2], Helicobacter pylori
(H. pylori
) facteurs de virulence [3] et les régimes alimentaires riches en sel et nitrate [4] . Malgré les progrès récents dans la détection et le traitement du cancer gastrique précoce, le taux de survie à long terme pour le cancer gastrique avancé est faible [5]. Les principaux défis dans le traitement du cancer gastrique avancé sont des métastases d'organes lymphatiques, péritonéale ou lointains, qui prédisent simultanément un mauvais pronostic pour ces patients [6].
Bien que de nombreux oncogènes et suppresseurs de tumeur ont été rapportés d'être impliqués dans le développement des cancers gastriques , les mécanismes moléculaires sous-jacents des métastases des cancers gastriques avancés sont encore mal connus [7]. L'un des événements clés dans la carcinogenèse gastrique est l'inflammation. L'inflammation conduit à l'activation du facteur de transcription du facteur-kappaB nucléaire (NF-kB), qui est associé à la cancérogenèse gastrique [8, 9].
MicroARN (miARN) sont impliqués dans le développement et la progression du cancer gastrique [10- 13]. miARN est une classe endogène, non-codage, les molécules d'ARN simple brin d'application. 22 nucléotides qui médient la régulation post-transcriptionnelle de l'expression génique par appariement de bases avec la région non traduite 3 '(UTR) de l'ARN messager cible (ARNm) [14]. miARN sont impliqués dans la régulation de la plupart des processus cellulaires, y compris la prolifération cellulaire, la migration, la différenciation et l'apoptose [10, 14, 15]. miARN sont aberrants exprimés dans la plupart des cancers humains et, comme les gènes codant pour des protéines, miARN peut fonctionner soit comme suppresseurs de tumeur ou oncogènes, régulant ainsi la cancérogenèse [10, 12]. miRNA-146a (miR-146a) est régulée par NF-kB et inhibe le récepteur de l'interleukine-1 (IL-1R) et le récepteur Toll-like (TLR) - induite par l'activation de NF-kB, en ciblant l'interleukine-1 receptor-associated kinase 1 (IRAK1) et récepteur de TNF facteur 6 associé (TRAF6) [16-18]. miR-146a a été rapporté aberrantly exprimé dans plusieurs maladies inflammatoires et les cancers, mais le rôle de miR-146a dans le cancer gastrique est encore controversée, comme l'expression de miR-146a a été trouvé à la fois en amont et en réglementé ici [19-24 ]. Par conséquent, nous avons étudié l'expression de miR-146a dans le cancer gastrique et caractérisé ses objectifs et fonctions moléculaires de clarifier les résultats contradictoires.
Nous avons constaté que miR-146a est régulée à la hausse dans un modèle murin de cancer de l'estomac, ainsi que dans adénocarcinomes gastriques humaines et CARD10 identifiés et COPS8 que de nouvelles cibles directes de miR-146a. Les deux font partie du récepteur couplé aux protéines G (RCPG) médié par la transduction du signal qui médie l'activation de NF-kB. Les résultats de cette suggère que miR-146a agit suppression tumorale en inhibant l'activation de GPCR-médiée de NF-kB et l'expression résultante de cytokines favorisant les tumeurs et les facteurs de croissance.
expression miR-146a est régulée à la hausse dans une souris modèle de cancer gastrique et Gastrin le KO adénocarcinomes gastriques humaines (KO) souris sont achlorhydriques et développent la métaplasie intestinale et des adénomes gastriques au fil du temps [25]. En utilisant la PCR quantitative (qPCR) nous avons trouvé l'expression de l'application miR-146a. 2 fois régulés à la hausse dans la vieille gastrine souris KO soit avec métaplasie intestinale fundique ou adénome antrale par rapport à l'expression de type sauvage (WT) les souris (P < 0,05) (figure 1A). En utilisant l'hybridation miR-146a de l'in situ a été détectée dans le tissu gastrique métaplasique des souris KO de la gastrine, mais pas dans le tissu gastrique normale chez les souris WT (figure 2AB) (en fichier1 supplémentaires: Figure S1). Ayant établi que miR-146a est augmentée dans notre modèle murin de cancer de l'estomac, nous avons examiné l'expression de miR-146a dans les adénocarcinomes gastriques humaines appariés et des biopsies de contrôle adjacents et a constaté qu'il était régulée à la hausse dans les cas 27 sur 37 (73%) ( La figure 1B). Dans l'hybridation in situ a montré que de miR-146a a été exprimée par les cellules d'adénocarcinomes gastriques humaines, tandis que les cellules miR-146a-positifs n'a été détecté dans la muqueuse gastrique normale (figure 2CD) (en fichier_1 supplémentaires: Figure S1). Figure 1 Augmentation de l'expression de miR-146a dans le KO souris modèle de cancer de l'estomac de la gastrine et le cancer gastrique humain. (A) L'expression relative de miR-146a dans les tissus fundique métaplasique (n = 8) et de la muqueuse antrale hyperplasiques (n = 4) /adénomes antraux souris (n = 4) à partir de gastrine KO (KO) par rapport à l'expression moyenne en correspondance de type sauvage (WT) tissus de la souris. * = P < 0,05. parcelle (B) Chute de l'expression de miR-146a dans 37 adénocarcinomes gastriques humaines par rapport à l'expression dans le tissu normal adjacent. miR-146a a été régulée à la hausse dans les tumeurs 27 sur 37 (73%). Les niveaux de miR-146a expression ont été déterminés par qPCR et normalisées par rapport à celles du RNU44 de contrôle endogène.
De la figure 2 dans la détection d'une hybridation in situ de l'expression de miR-146a dans le modèle de cancer de l'estomac gastrine KO souris et le cancer gastrique humain. (A) L'expression de miR-146a n'a pas été détectée dans les tissus de la souris WT fundique, (B), tandis que les cellules ont été détectées (noyaux bleus), miR-146a-positives dans le tissu métaplasique fundique de souris KO de la gastrine. (C) Aucun signal n'a été détecté avec la sonde LNA brouillé. (D) l'expression de miR-146a était absente dans le tissu gastrique humain normal, (E), mais présente dans les cellules d'adénocarcinome gastrique humain (noyaux bleus). (F) témoin négatif en utilisant une sonde LNA brouillé. cellules représentatives miR-146a-positifs sont indiqués par des flèches. x20 d'origine de grossissement, barre d'échelle = 100 um.
Il n'y avait aucune corrélation entre l'expression de miR-146a dans les adénocarcinomes gastriques et patients 'âge, le sexe et la localisation ou la classification des tumeurs (données non représentées). Bien que les patients présentant une expression élevée miR-146a semblait avoir une meilleure survie globale ce ne fut pas significative. (File1 supplémentaires: Figure S2)
cibles miR-146a membres de la voie d'activation de NF-kB GPCR médiée
Après avoir démontré augmentation de l'expression de miR-146a dans la majorité des cancers gastriques, nous avons voulu mettre en place les actions biologiques de miR-146a en caractérisant ses cibles moléculaires directs dans le cancer gastrique humain. Nous voulions faire en surexpression de miR-146a dans les cellules de cancer gastrique et ensuite identifier les ARNm avec une expression réduite [26]. Par conséquent, nous avons examiné l'expression de miR-146a dans un panel de lignées cellulaires et on a trouvé l'expression variée, mais étonnamment faible de miR-146a dans les lignées de cellules gastriques disponibles (file1 supplémentaires: Figure S3), compte tenu de la détection sur-expression dans les tumeurs <. br> La gastrique lignée cellulaire de cancer humain SNU638, qui a un niveau négligeable de endogène miR-146a a été trouvé approprié pour miR-146a surexpression études. Puisque l'expression de miR-146a était très faible dans les lignées de cellules gastriques testées études d'inhibition de miR-146a ne sont pas réalisées.
Nous avons d'abord testé si surexpression de miR-146a affecté la croissance des cellules SNU638 et a trouvé la croissance cellulaire non affecté ( file1 supplémentaires: Figure S4). Par la suite, les changements globaux dans l'expression des gènes dans les cellules SNU638 suivantes surexpression de miR-146a ont été examinés. Après miR-146a transfection avec ARNm 3'UTR miR-146a sites cibles prédites étaient significativement régulée à la baisse par rapport aux ARNm cibles sans les sites prévus (P < 4.6e-11, à deux queues test de Wilcoxon rank-sum) (figure 3A) . Nous avons analysé tous les mots de longueur 5-7 pour surreprésentation dans les ARNm régulés à la baisse après miR-146a transfection et on a trouvé le mot le plus fort en corrélation avec la régulation a été le site de semences complémentaires à mûrir bases miR-146a 2-7 /8 ( La figure 3B). Transcriptions avec 3'UTR miR-146a sites cibles prédites qui étaient significativement régulée à la baisse sur miR-146a transfection ont été considérés comme des cibles miR-146a de directs potentiels. 847 appariés ces critères (fichier1 supplémentaires: Tableau S5). Les 10 cibles miR-146a potentiels les plus bas réglementés sont présentés dans la figure 3C. Comme un contrôle de validation négative, nous avons répété le processus de traitement SNU638 cellules avec un inhibiteur de miR-146a LNA. Il n'y avait pas une régulation significative de gènes avec le site de semences complémentaires à mûrir bases miR-146a (données non présentées). Figure 3 Identification des cibles miR-146a. (A) prédites miR-146a transcrits cibles sont nettement régulée à la baisse après miR-146a transfection par rapport aux gènes exprimés qui ne sont pas prédits cibles de miR-146a (P < 4.6e-11, deux tailed test de Wilcoxon rank-sum) . (B) Top 10 des mots les plus corrélés avec la régulation (corrélation Z-scores sont indiqués à la gauche de chaque mot, tous les 10 mots ont un FDR <estimée; 1E-6). Les lettres majuscules soulignent la région miRNA de semences, Watson-Crick paires de bases (bleu), inadéquations (rouge). Le mot le plus fort en corrélation avec la régulation a été le site de semences complémentaires à maturité bases miRNA 2-7 /8. (C) Transcriptions, ayant 6mer ou 7mer sites de semences miR-146a dans la 3'UTR, qui sont les plus régulés à la baisse sur miR-146a transfection sont présentés. Ce sont des cibles miR-146a de directs potentiels. L'expression est donnée dans le changement de log2 fois. Les 3'UTR 6 m /7 m colonnes indiquent le nombre de 6- ou 7mer miR-146a sites de semences dans le 3'UTR.
Les trois la plupart des gènes régulés à la baisse sur miR-146a sur-expression, IRAK1, le recrutement de caspase protéines contenant le domaine-10 (CARD10) et COP9 constitutive homolog photomorphogenic sous-unité 8 (COPS8) (figure 3C) appartiennent tous à des voies conduisant à l'activation de NF-kB [27-29] signalisation. IRAK1 est une cible miR-146a connue impliquée dans TLR- et l'activation de NF-kB [16-18] IL-1R médiation. CARD10 est impliqué dans l'activation de GPCR à médiation par NF-kB [27], tandis que COPS8 on pense être impliqués dans cette voie en fonction de son implication dans le récepteur des cellules T (TCR) médiée par l'activation de NF-kB [28]. Étonnamment, mais semblable aux conclusions de Boldin et al.
[30], l'expression de TRAF6, qui a déjà été décrit comme une cible de miR-146a [16, 18, 31], n'a pas été réduite au niveau transcriptionnel après miR-146a sur-expression dans notre système modèle.
dans le cancer gastrique, NF-kB modulant la survie cellulaire, l'immunité et l'inflammation, et l'activation de NF-kB est associée à un mauvais pronostic dans le cancer gastrique [32, 33]. Nous avons donc mis l'accent sur la caractérisation CARD10 et COPS8 comme cibles miR-146a directe et leur rôle dans l'activation de NF-kB dans le cancer gastrique. Nous avons confirmé miR-146a-médiée la régulation des CARD10, COPS8 et IRAK1 au niveau de la transcription (figure 4A) et a également constaté que miR-146a niveaux de CARD10, COPS8 et de protéines IRAK1 (figure 4B) réduit. Enfin, le ciblage direct de miR-146a pour 3'UTRs des gènes cibles a été démontrée en utilisant des essais de luciférase (Figure 4C). En résumé, nous avons confirmé les observations antérieures montrant que miR-146a cible directement IRAK1 et nous en outre identifié deux nouvelles cibles, CARD10 et COPS8, qui code pour les protéines ont suggéré d'être impliqués dans l'activation de NF-kB. COPS8 est un composant de signalosome COP9 qui se compose de huit sous-unités (GPS1 et COPS2-8) [34]. COPS8 est la seule sous-unité ciblée directement par miR-146, mais étant donné que la modification de la quantité des sous-unités individuelles a été montré pour affecter la quantité d'autres sous-unités [35, 36], nous avons examiné comment l'expression de toute la transfection avec miR-146a affecté composants COP9 de signalosome. Dans les cellules non stimulées l'expression de COPS2 a été réduit (20%) (file1 supplémentaires: Figure S5). Nous supposons donc que les effets de miR-146a sur le complexe COP9 résultent principalement d'une réduction de l'expression de COPS8, bien que la déstabilisation indirecte du complexe ne peut pas être exclue. La figure 4 CARD10 et COPS8 sont des cibles de miR-146a direct. (A) L'expression d'ARNm des deux nouvelles cibles miR-146a, et COPS8 CARD10 et IRAK1, une cible connue miR_146a, a été déterminée par PCR quantitative dans les cellules et SNU638 contrôleurs miR-146a-transfecté. L'expression de chaque produit de transcription est indiquée par rapport à l'expression dans les cellules témoins transfectées. CARD10, COPS8 et expression IRAK1 a été régulés à la baisse suivant miR-146a sur-expression. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± E.T. de quatre répétitions biologiques. * = P < 0,05, ** = P < 0,01, *** = P < 0,001. (B) miR-146a transfection a également réduit les niveaux de CARD10, COPS8 et IRAK1 protéines dans les cellules SNU638 miR-146a-transfectées. L'expression de chaque protéine est représentée par rapport à l'expression dans les cellules témoins transfectées. Les bandes ont été quantifiées par rapport à la ß-actine. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± E.T. de quatre répétitions biologiques. * = P < 0,05, ** = P < 0,01, *** = P < 0,001. (C) Vérification de la cible directe et fonctionnelle de liaison en utilisant des constructions luciférase tenant WT 3'UTRs et mutées (Mut) 3'UTRs (la centrale 4 nucléotides ont été remplacés dans le site de liaison miR-146a) pour CARD10, COPS8 et IRAK1. Constructs contenant mutées (Mut) 3'UTRs en aval du gène de la luciférase de luciole soit WT ou ont été co-transfectés dans des cellules HEK293 conjointement avec le plasmide Renilla de contrôle de la luciférase et soit miR-146a ou le contrôle (Siglo). À gauche, l'activité luciférase est donnée par rapport à l'activité dans les cellules témoins transfectées. miR-146a réduit l'activité de la luciférase des constructions avec WT CARD10, COPS8 et IRAK1 3'UTRs. A droite, des alignements de séquences de miR-146a et WT potentiel et sites cibles Mut 3'UTR sont présentés, les bases mutées sont indiquées en rouge. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± E.T. répétitions souvent biologiques. *** = P < 0,001. l'activation de NF-kB [28, 29 alignements de séquences sont adaptés de DIANALab (2009). Le plus miR-146a inhibe l'activité de NF-kB à médiation par GPCR en ciblant CARD10 et COPS8 de CARD10 et COPS8 sont impliqués dans la médiation de GPCR- ]. Nous voulions donc d'établir leur rôle dans la transduction du signal dans le cancer gastrique et ensuite enquêter sur l'importance de miR-146a pour inhiber cette signalisation. A cet effet, on a utilisé l'acide lysophosphatiditc (LPA) qui est un activateur connu de la voie NF-kB à médiation par l'activation de GPCR-[29], et favorise la migration des cellules de cancer de l'estomac et de l'invasion [37]. LPA-stiumlation augmenté de manière significative l'activité de NF-kB dans notre système de rapporteur de la luciférase (figure 5). ARNsi knock-down de l'expression de CARD10 et COPS8 significativement inhibé l'activation du GPCR à médiation par le LPA stimulée de NF-kB dans les cellules SNU638 (figure 5). Cette inhibition est comparable à l'inhibition de miR-146a-induite. En revanche, l'inhibition endogène miR-146a a été sans effet sur l'activation de NF-kB. Comme prévu, à médiation par ARNi répression de l'expression IRAK1 n'a pas affecté l'activation stimulée par le LPA de NF-kB (figure 5) comme IRAK1 ne participe pas à la voie à médiation par le GPCR. Comme TRAF6 est une cible miR-146a avec un rôle dans l'activation de NF-kB, on a étudié l'effet de répression à médiation par ARNsi de l'expression de TRAF6 sur l'activité de NF-kB stimulée par le LPA. Cependant, knockdown de TRAF6 n'a pas inhibé l'activité stimulée par le LPA de NF-kB (figure 5). Ces résultats indiquent que les deux cibles de miR-146a nouvellement identifiés, CARD10 et COPS8, sont impliqués dans l'activation GPCR-médiée de NF-kB. Par conséquent, l'effet de miR-146a sur-expression de l'activité de NF-kB APL stimulée a été étudiée. miR-146a inhibe de manière significative l'activité de NF-kB par le LPA dans SNU638 stimulée par des cellules (figure 5). Un mélange d'ARNsi contre CARD10, COPS8, et TRAF6 IRAK1 mimée l'inhibition de miR-146a à médiation par l'activité de NF-kB (figure 5). Knockdown de deux autres composantes de la COP9 (de COPS2 et COPS5) a également inhibé l'activité de NF-kB LPA stimulée, ce qui démontre l'importance de la présence de toutes les sous-unités COP9 de signalosome pour l'activation LPA stimulée par NF-kB. qPCR de l'expression des différents éléments examinés a confirmé l'effet de choc (figure 5). La figure 5 cibles miR-146a et COPS8 CARD10 GPCR-activation médiée par le NF-kB. cellules SNU638 ont été co-transfectées avec NF-kB plasmide rapporteur et Renilla contrôle de luciférase plasmidique ainsi que le contrôle (Siglo), siRNA ou miR-146a. Les cellules ont été stimulées avec 25 uM de LPA et de l'activité de la luciférase a été mesurée. L'activité luciférase est donnée par rapport à l'activité dans le contrôle des cellules transfectées LPA stimulées. ARNsi contre CARD10 et COPS8, miR-146a, un inhibiteur de miR-146a et d'une activité de luciférase ARNsi mélange réduite. siRNA contre IRAK1 et TRAF6 n'a pas réduit l'activité luciférase. LPA stimulée par l'activation de NF-kB a été également inhibée par l'ARNsi contre COPS2 et COPS5, ce qui démontre que d'autres perturbations du complexe COP9 signalosome réduit GPCR-activation médiée NF-kB. SIMIX, mélange de siRNA contre CARD10, COPS8, IRAK1 et TRAF6. Les données sont montrées comme la moyenne ± E.T. de sept répétitions biologiques * = P <. 0,05. L'expression relative de TRAF6, COPS8, IRAK1, CARD10, et COPS2 COPS5 a été mesurée à l'aide qPCR. Gray-ombrage indique un changement significatif dans l'expression, p < 0,05, n = 4. The expression de miR-146a est en partie contrôlé par le NF-kB. Nous avons donc également testé comment l'expression de miR-146a a été affectée par l'APL et la stimulation de l'IL-1β. Nous avons constaté que le traitement LPA a doublé l'expression de miR-146a et la stimulation de l'IL-1β a donné une augmentation de 4 fois de l'expression de miR-146a, qui est comparable à des observations antérieures [16, 38] (file1 supplémentaires: Figure S6). Bien que miR-146a LNA a augmenté l'expression de trois des cibles miR-146a (TRAF6, IRAK1 et CARD10) (figure 5) l'activation de l'ensemble de NF-kB n'a pas été modifiée dans le LPA stimulée par LNA miR-146a traitée SNU638 cellules. miR-146a réduit LPA induit des cytokines et des facteurs de croissance
Dans la plupart des carcinomes facteurs microenvironnementales plutôt que des altérations génétiques sont probablement responsables de l'activation de signalisation NF-kB qui réglemente plusieurs processus, y compris la sécrétion de facteurs de croissance et de cytokines [39, 40]. Par conséquent, nous avons étudié la façon dont miR-146a modulant l'expression de certains facteurs et des cytokines induites par des signaux extracellulaires, tels que le LPA croissance de NF-kB réglementées. LPA-stimulation augmente significativement l'expression de l'interleukine-6, -8, 23A (IL-6, IL-8, IL-23A) et chimiokines (CC motif) ligand 5 (CCL5), le facteur de stimulation des colonies 1 (macrophage) (CSF 1) et platelet-derived growth factor bêta polypeptide (PDGFB) dans SNU638 cellules (figure 6). Ceci a confirmé que l'expression de ces gènes est régulée par l'activité du NF-kB induite par le LPA. Surexpression de miR-146a diminué de manière significative l'expression de l'IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 et PDGFB dans SNU638 cellules (figure 6). Même si l'IL-6 est un gène cible de NF-kB, et également augmentée par LPA miR-146a sur-expression n'a pas réduit l'IL-6 expression dans nos conditions (figure 6). Cependant, LPA induction de l'IL-6 est l'expression non seulement médiée par le NF-kB, mais aussi par d'autres voies (MAPK /ERK, PI3K /Akt et p38) [41], ce qui peut contribuer aux différences. Dans les cellules SNU638 le niveau de base de l'IL-6 est supérieure à celle de l'IL-8, ce qui peut affecter la rotation de l'ARNm. Cela pourrait faire partie de la raison que miR-146a a moins d'effet sur la LPA stimulée par l'IL-6 expression que sur l'IL-8 expression, qui a également été vu dans d'autres systèmes cellulaires [42]. Figure 6 miR-146a inhibe l'expression des cytokines induite par le LPA. 25 uM LPA a été utilisé pour induire l'expression de cytokines à partir de cellules de carcinome SNU638 gastriques humaines. LPA expression significativement accrue d'IL-6, IL-8, IL-23A, CCL5, le CSF-1 et PDGFB, qui a été mesurée à l'aide qPCR et montrée par rapport au niveau d'expression dans les cellules témoins non traitées. Cette réponse est réduit dans des cellules miR-146a-transfecté. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± E.T., n = 4, * = P < 0,05, ns = non significatif.
MiR-146a sur-expression dans les cellules SNU638 réduit le recrutement des monocytes
Dans les carcinomes monocytes peuvent être recrutés par exemple CCL5 et du CSF-1 exprimé par les cellules tumorales et cette infiltration tumorale des monocytes contribue à la réponse inflammatoire favorisant la tumeur dans le cancer [39, 40]. Après avoir démontré que miR-146a réduit l'expression induite par le LPA de cytokines, nous avons examiné comment miR-146a surexpression affecté le recrutement des monocytes. Nous avons constaté que le LPA traitement des cellules SNU638 la migration des monocytes augmente vers le milieu conditionné à partir des cellules SNU638 (figure 7 et fichier1 supplémentaires: La figure S7), tandis que la transfection avec miR-146a en partie abrogeait cette réponse (figure 7) démontre encore que miR -146a inhibe les réactions biologiques de l'activation de GPCR à médiation par NF-kB, tels que le recrutement des monocytes. Figure 7 miR-146a réduit la migration des monocytes. la migration des monocytes contre un milieu conditionné à partir de cellules SNU638 de contrôle ou des miR-146a-transfectées qui ont été laissées non traitées ou stimulées avec 25 uM LPA a été suivie de plus de 8 heures. La migration des cellules est indiquée par rapport à la migration des cellules témoins non traitées. la migration des monocytes contre moyen à partir de cellules SNU638 LPA stimulées a été augmenté par rapport à la migration contre moyen de cellules non traitées, tandis que la migration des monocytes contre moyen de miR-146a-transfectées, les cellules LPA stimulées a été réduite par rapport à moyen du contrôle transfectées, LPA-stimulé cellules. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± E.T. de quatre répétitions biologiques. ** = P < 0,01, ns = Discussion
. Non significative
facteurs microenvironnement sont importants pour l'activation de NF-kB dans les cancers de l'inflammation entraînée comme le cancer gastrique et cette activation de NF-kB peut fournir des cellules cancéreuses avec des avantages, qui contribuent à la tumorigène processus [32, 43]. La modulation de la signalisation de NF-kB activation est donc important pour le contrôle du développement d'une tumeur à médiation par une inflammation. Ici, nous montrons que miR-146a est un régulateur négatif central de l'activation de NF-kB car elle inhibe plusieurs voies NF-kB activation.
Expression miR-146a a été trouvé régulés à la hausse dans l'application. 2/3 des adénocarcinomes gastriques humaines, ainsi que dans le modèle de souris KO de la gastrine d'un cancer gastrique. De même, l'expression de miR-146a a été trouvé augmenté du col utérin, du sein, du pancréas et le cancer de la thyroïde [11, 44-46]. Auparavant, l'expression de miR-146a a été trouvé à la fois en amont et régulé à la baisse dans le cancer gastrique [21-24]. Ces résultats contradictoires peuvent refléter des différences dans les tumeurs et leur microenvironnement résultant en différents degrés d'activité de NF-kB, qui contrôle l'expression de miR-146a [16]. De manière surprenante, nous avons trouvé de faibles niveaux de miR-146a dans des lignées cellulaires de cancer gastrique humain. Cela pourrait indiquer que les niveaux accrus de miR-146a vu dans les tumeurs sont couraient par des facteurs du microenvironnement par exemple les cellules entourant les cellules tumorales.
Pour examiner les effets de l'augmentation des niveaux miR-146a dans le cancer gastrique nous avons identifié deux nouvelles cibles miR-146a, CARD10 et COPS8, et étudié les rôles de ces objectifs. Nous avons constaté que miR-146a inhibée GPCR médiée activation de NF-kB en ciblant directement et l'expression de CARD10 et COPS8 down-régulation. CARD10 est connu pour être nécessaire à l'activation de GPCR induite par NF-kB [27, 29], tandis que COPS8 est une sous-unité de la CdP9 signalosome qui contrôle l'activation de NF-kB [28, 47]. Nous avons montré que CARD10 est impliqué dans l'activation GPCR-médiée de NF-kB, et a fourni de nouvelles preuves que COPS8 est impliqué dans cette voie aussi. miR-146a surexpression a également conduit à une expression réduite de COPS2, une autre sous-unité du signalosome COP9. Nous supposons que cela est un effet indirect, car il n'y a pas de site de liaison miR-146a dans COPS2 3'UTR et a été montré des changements dans l'expression d'une sous-unité d'affecter celle de l'autre [35, 36]. Il est donc possible que miR-146a dans une certaine mesure peut agir non seulement en ciblant COPS8 mais déstabiliser le signalosome COP9.
Signalisation Aberrant par GPCR a été liée à la croissance de la tumeur et la survie cellulaire, et GPCR NF-kB activation ont été montré à contribuer à un large éventail de cancers (revue par Dörsam & Gutkind [48]). Les GPCR peuvent activer NF-kB par l'intermédiaire
le complexe CARD10 /BCL10 /MALT1 après des ligands tels que le LPA, de enothelin-1, l'angiotensine II (Ang II) et de chimiokines (CXC motif) ligand 12 (CXCL12) (figure 8) la liaison [ ,,,0],29, 49]. Dans notre étude, nous avons utilisé l'APL pour modéliser l'activation GPCR-médiée de NF-kB. GPCR de signalisation conduit à la progression de la tumeur [49] induite par le LPA. Ainsi, l'inhibition de miR-146a médiée par des GPCR de signalisation pourrait avoir des effets de suppression de tumeur. Figure 8 cibles miR-146a multiples voies d'activation de NF-kB. Illustration schématique des voies NF-kB activation. miR-146a a été montré précédemment pour cibler IRAK1 et TRAF6 et dans cette étude, nous montrons que miR-146a cible CARD10 et COPS8. les cibles miR-146a sont marqués par des cercles rouges.
En plus de l'activation de GPCR à médiation par NF-kB, NF-kB peut être activé par l'intermédiaire du récepteur
nécrose tumorale facteur (TNFR), IL-1R, TLR, récepteur des cellules TCR et B (BCR) [50] (figure 8). Auparavant, miR-146a a été montré pour inhiber l'activation de NF-kB par l'intermédiaire
ces récepteurs par l'expression de la régulation négative de TRAF6 et IRAK1 [16, 18, 30, 31]. miR-146a IRAK1 cible dans des cellules cancéreuses de l'estomac, mais pas TRAF6. Bien que nous montrons ici que miR-146a cible activation du GPCR médiation par NF-kB, en plus de l'activation par
TNFR, IL-1R, TLR, TCR et BCR, en ciblant CARD10 et COPS8 (figure 8). Ainsi, miR-146a cibles multiples composants des voies dans les cellules cancéreuses gastriques NF-kB activation. Cela n'a pas été montré pour la voie NF-kB avant, mais a déjà été vu dans le facteur β de croissance transformant (TGF-β) voie, où les deux miR-21 et la cible de cluster miR-17-92 plusieurs ARNm codant pour les protéines de la voie du TGF-β [51, 52]. En ciblant de multiples composants de différentes NF-kB activation pathways miR-146a médie une commande robuste et complexe de l'activité de NF-kB. Plusieurs autres miARN peuvent également réguler le NF-kB signalisation, mais seulement des cibles miR-146a plusieurs gènes dans différentes voies de NF-kB, ce qui suggère l'activation miR-146a en tant que modulateur clé d'activation de NF-kB.
NF-kB régule l'expression des cytokines et des facteurs de croissance impliqués dans plusieurs aspects de la progression des tumeurs [43]. Étant donné que miR-146a diminue l'activité de NF-kB, il est possible que miR-146a agit suppresseur de tumeur en réduisant l'expression de ces cytokines et facteurs de croissance. En effet, nous avons découvert que miR-146a surexpression expression de plusieurs cytokines et de facteurs de croissance ayant un rôle connu dans le développement du cancer réduit; IL-8, IL-23A, CCL5, le CSF-1 et PDGFB. Ces gènes peuvent augmenter la prolifération cellulaire, l'adhésion cellulaire et l'angiogénèse [53-55], de contribuer à la lymphangiogenèse tumorale [56], activent les fibroblastes [57], le recrutement des monocytes aux tumeurs [39, 40] et induire des macrophages associés aux tumeurs (TAM) à sécréter des médiateurs favorisant les tumeurs [58] (figure 9). Figure 9 Les processus biologiques dans les cellules de cancer gastrique inhibées par miR-146a. Le panneau de gauche, miR-146a cible directement IRAK1, CARD10 et COPS8 dans SNU638 cellules. Ceci conduit à une inhibition de l'activation de NF-kB et par conséquent l'expression des cytokines refoulées NF-kB régulés et facteurs de croissance. L'expression de miR-146a est également réglementé par NF-kB [16]. Panneau de droite, miR-146a diminue l'expression de CCL5, CSF-1, l'IL-8, PDGF et IL-23A, qui sont impliqués dans la migration des monocytes et la différenciation, la prolifération, l'angiogenèse, la lymphangiogenèse et fibroblaste et la croissance du macrophage facteur libération. Ainsi, miR-146a pourrait agir comme un suppresseur de tumeur en réduisant les effets favorisant le cancer de l'activité de NF-kB. Le plus des cytokines chimiotactiques libérés par les cellules tumorales peuvent recruter des monocytes vers des sites tumoraux [39, 59]. Ces monocytes peuvent favoriser la progression tumorale [60]. CCL5 et le CSF-1 sont des exemples de cytokines monocytes recrutant libérés par les cellules tumorales [39, 40]. Comme prévu, les monocytes ont migré moins contre un milieu conditionné à partir de cellules SNU638 LPA stimulées surexpression de miR-146a par rapport aux cellules de contrôle LPA stimulées. La figure S2. La figure S3. Figure S4. La figure S5. Figure S6. 0,05. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

• surexpression concomitante de p53 sérique mutation liée à l'infection à Helicobacter pylori
• métastases intraneurale du carcinome gastrique conduit à une paralysie du nerf sciatique