microRNA-146a bremst G FAQ-kräftegen receptor-mediated Aktivatioun vun NF-κB vun CARD10 an COPS8 zu gastric cancer

microRNA-146a gezielt bremst G FAQ-kräftegen receptor-mediated Aktivatioun vun NF-κB vun CARD10 an COPS8 zu gastric Kriibs gezielt
Wat VerfÜgung Background VerfÜgung Gastric Kriibs ass déi zweet Équipe gemeinsam Ursaach vum Kriibs-Zesummenhang Doud vun der Welt. Demagogesch Signaler aus gastric Kriibs Zellen zoustänneg sinn wichteg fir zousätzlech demagogesch Zellen a Regulatioun vun Metastasen vun gastric Kriibs. Puer microRNAs (miRNA) goufen an Entwécklung an Werdegang vun gastric Kriibs Équipe gewise gin. miRNA-146a (Mir-146a) ass eng modulator vun demagogesch Signaler, mä kleng ass iwwer hir Wichtegkeet vun gastric Kriibs bekannt. Mir wollten dofir Ziler vum Mir-146a zu gastric Kriibs ze identifizéieren a seng biologesch Rollen ënnersicht. VerfÜgung Resultater VerfÜgung Den Ausdrock vun Mir-146a war déi grouss Hinnen alleguer (qPCR) évaluéiert a fonnt an der gastrin Knockout Mais up-reglementéiert , eng Maus Modell vun gastric Kriibs, an zu 73% vun propagéieren Mënsch gastric adenocarcinomas. Ausdrock vun Mir-146a vun gastric Kriibs Zellen war vun VerfÜgung hybridization zu situ confirméiert. Global Analyse vun Ännerungen an mRNA Niveauen no Mir-146a transfection identifizéiert zwee gët, caspase Rekrutement Domain-haltege FAQ 10 (CARD10) an COP9 signalosome komplex subunit 8 (COPS8), den neien Mir-146a Ziler. qPCR, Western blotting an luciferase assays bestätegt dës gët als direkten Mir-146a Ziler. CARD10 an COPS8 goufen dës Deel vun der G FAQ-kräftegen receptor (GPCR) Passerelle vun nuklearem Faktor-kappaB (NF-kappaB) Aktivéierung gin. Lysophosphatidic Seier (LPA) induces NF-kappaB Aktivéierung via VerfÜgung dës Passerelle an iwwer-Ausdrock vun Mir-146a inhibited-LPA entschlof NF-kappaB Aktivéierung reduzéiert-LPA entschlof Ausdrock vun entholl-Spur cytokines a Wuesstem Facteuren an inhibited monocyte Attraktioun VerfÜgung. Konklusiounen VerfÜgung Mir-146a Ausdrock an-reglementéiert enger Majoritéit vun gastric Cancers ass wou et CARD10 an COPS8 Ziler, GPCR-mediated Aktivatioun vun NF-kappaB inhibiting, also reduzéieren Ausdrock vun NF-kappaB-reegelen tumor- cytokines a Wuesstem Faktoren Spur. Duerch gezielt Komponente vun e puer NF-kappaB-activating Weeër, ass Mir-146a e Schlësselelement vun der Regulatioun vun NF-kappaB Aktivitéit. VerfÜgung Schlësselwieder VerfÜgung Mo. Kriibs Non-coding RNS Cytokines Background VerfÜgung weltwäit gastric Kriibs ass déi zweet Équipe gemeinsam Ursaach vum Kriibs-Zesummenhang Doud [1]. Entwécklung vun gastric Kriibs ass vun Interaktiounen tëschent Provider, Ëmwelt- a bakteriell Facteuren beaflosst. Beispiller vun synergistic Risiko Facteure fir gastric Kriibs sinn schiefgang zu Genen vun de Provider demagogesch Äntwert Équipe [2], Helicobacter pylori VerfÜgung (H. pylori VerfÜgung) virulence Faktoren [3] a Bierger räich vun Salz an Nitratveruerdnung [4] . Trotz rezent Fortschrëtter an erkennen a Behandlung vun fréi gastric Kriibs, déi langfristeg Iwwerliewe Tarif fir fortgeschratt gastric Kriibs ass héich [5]. Déi Haapterausfuerderungen am Traitement vun fortgeschratt gastric Kriibs sinn lymphatic, peritoneal oder wäiter Uergel Investitiounen, déi gläichzäiteg aarmséileg Resultat fir dës Patiente soe [6]. VerfÜgung Obwuel vill oncogenes an entholl suppressors gemellt goufen an Entwécklung vun gastric carcinomas Équipe ze ginn , de molekulare Mechanismen Metastasen vun fortgeschratt gastric carcinomas Basisdaten sinn nach ganz wéineg verstan [7]. Eent vun de wichtegsten Evenementer am gastric carcinogenesis ass inflammation. Inflammation féiert zu Aktivatioun vun der Transkriptiouns Faktor nuklear Faktor-kappaB (NF-κB), déi mat gastric carcinogenesis assoziéiert ass [8, 9]. VerfÜgung microRNAs (miRNA) an d'Entwécklung an Werdegang vun gastric Kriibs betraff sinn [10- 13]. miRNA ass eng Klass vun endogenous, Net-coding, Single-gekëmmert RNS Molekülle vun der App. 22 nucleotides datt Post-transcriptional Regulatioun vun der Gentherapie Ausdrock duerch huel Accord mat den 3 "untranslated Regioun (UTR) vun Zil- Messenger RNS (mRNA) [14] Mediate. miRNAs sinn zu Regulatioun vun de meeschte bewosst Prozesser dorënner Zell Prolifératioun, Migratioun, dat a apoptosis Équipe [10, 14, 15]. miRNAs sinn aberrantly am meeschte Mënsch Cancers an, wéi FAQ-coding Gene ausgedréckt, kann miRNAs Funktioun als entweder entholl suppressors oder oncogenes, doduerch Regulatioun carcinogenesis [10, 12]. miRNA-146a (Mir-146a) ass vun NF-κB reglementéiert an bremst interleukin-1 receptor (IL-1R) an Péage-wëll receptor (TLR) - entschlof Aktivatioun vun NF-κB vun gezielt interleukin-1 receptor-verbonne kinase 1 (IRAK1) an TNF receptor verbonne Faktor 6 (TRAF6) [16-18]. Mir-146a gouf an e puer demagogesch Krankheeten an Cancers gemellt aberrantly ausgedréckt, mä d'Roll vum Mir-146a zu gastric Kriibs ass nach kontrovers, wéi Ausdrock vu Mir-146a huet souwuel Bastelen a verwandelt-reegelen hei fonnt goufen [19-24 ]. Dofir, mir den Ausdrock vun Mir-146a zu gastric Kriibs propagéieren an zeechent hiren Ziler a molekulare Funktiounen déi widderspréchlech Conclusiounen ze klären. VerfÜgung fonnt Mir datt Mir-146a zu enger Maus Modell vun gastric Kriibs up-reglementéiert ass sou gutt wéi an Mënsch gastric adenocarcinomas an identifizéiert CARD10 an COPS8 als direkter Ziler vum Mir-146a. Béid sinn Deel vun de G FAQ-kräftegen receptor (GPCR) -mediated Signal transduction datt Aktivatioun vun NF-κB mediates. Dëst deit drophin, datt Mir-146a entholl suppressing Akte vum GPCR-mediated Aktivatioun vun NF-κB inhibiting an déi doraus resultéierend Ausdrock vun entholl-Spur cytokines a Wuesstem Facteuren. VerfÜgung Resultater VerfÜgung Mir-146a Ausdrock ass vun enger Maus an-reglementéiert Modell vun gastric Kriibs an am mënschleche gastric adenocarcinomas VerfÜgung Gastrin Knockout (KO) Mais sinn achlorhydric an intestinal metaplasia an gastric adenomas iwwer Zäit [25] entwéckelen. Benotzt grouss Hinnen alleguer (qPCR) fonnt mir den Ausdrock vun Mir-146a App. 2-fantastesch mat entweder fundic intestinal metaplasia oder antral adenoma an al gastrin KO Mais up-reegelen Verglach zu den Ausdrock vun wëll Typ (virstellen) Mais (P &Si besteet; 0,05) (Dorënner 1A). Mat Hëllef vun situ VerfÜgung hybridization Mir-146a war zu metaplastic gastric Otemschwieregkeeten aus der gastrin KO Mais, mä net zu normal gastric Otemschwieregkeeten aus der virstellen Mais (Dorënner 2AB) (: Dorënner S1 Weider file1) fonnt. Nodeems etabléiert, datt Mir-146a zu eiser Maus Modell vun gastric Kriibs fräi ass mir iwwerpréift Ausdrock vu Mir-146a zu vläit Mënsch gastric adenocarcinomas an bascht Kontroll biopsies a fonnt, datt et weider-reglementéiert 27 aus 37 Fäll gouf (73%) ( Figur 1B). An situ VerfÜgung hybridization gewisen, datt Mir-146a vun der mënschlecher gastric adenocarcinoma Zellen ausgedréckt huet, iwwerdeems Mir-146a-positiv Zellen am normal gastric mucosa net fonnt goufen (Dorënner 2CD) (Zousätzleche file1: Dorënner S1). Figur 1 erhéicht Ausdrock vu Mir-146a an der gastrin KO Maus gastric Kriibs Modell a mënschlech gastric Kriibs. (A) D'famill Ausdrock vu Mir-146a zu metaplastic fundic Otemschwieregkeeten (n = 8) an hyperplastic antral mucosa (n = 4) /antral adenomas (n = 4) aus gastrin Knockout (KO) Mais am Verglach mat der Moyenne Ausdrock am Aklang Wëllschwäin Typ (virstellen) Maus Otemschwieregkeeten. * = P &Si besteet; 0,05. (B) Waasserfall Komplott vun den Ausdrock vun Mir-146a zu 37 Mënsch gastric adenocarcinomas relativ zu den Ausdrock vun bascht normal Otemschwieregkeeten. Mir-146a war vun 27 aus 37 erhéijen up-reegelen (73%). Den Ausdrock Niveau vun Mir-146a sech duerch qPCR an normalized un deenen vun der endogenous Kontroll RNU44 alles. VerfÜgung 2 Dorënner An situ hybridization erkennen Mir-146a Ausdrock am gastrin KO Maus gastric Kriibs Modell a mënschlech gastric Kriibs. (A) Expression vum Mir-146a war net zu virstellen fundic Maus Otemschwieregkeeten fonnt, (B) iwwerdeems Mir-146a-positiv Zellen (blo Käre) waren an der metaplastic fundic Otemschwieregkeeten aus gastrin KO Mais fonnt. (C) war Nee Signal mat der Jacquerie LNA Studiebäihëllefe fonnt. (D) Mir-146a Ausdrock war am normale Mënsch gastric Otemschwieregkeeten veréiert, (E) mee präsent an mënschlechen gastric adenocarcinoma Zellen (blo Käre). (F) Negativ Kontroll eng Jacquerie LNA Studiebäihëllefe benotzt. Vertrieder Mir-146a-positiv Zellen sinn duerch Feiler uginn. Original Vergréisserung x20, Skala Bar = 100 μm. VerfÜgung keng Korrelatioun tëscht Mir-146a Ausdrock vun gastric adenocarcinomas an Patienten Alter, Geschlecht a Lokalisatioun oder Klassifikatioun vun erhéijen (Donnéeën net gewisen) Et war. Obwuel Patienten mat héije Ausdrock Mir-146a war eng besser allgemeng Iwwerliewe ze hun war dat net relevant. (Zousätzleche file1: Dorënner S2) VerfÜgung Mir-146a Ziler Membere vun der GPCR-mediated NF-κB Aktivéierung Passerelle VerfÜgung bewisen hunn fräi Meenungsäusserung vum mir-146a zu der Majoritéit vun gastric Cancers, wollte mer vun characterizing hiren direkten molekulare Ziler am mënschleche gastric Kriibs der biologescher Aktiounen vum mir-146a ze etabléieren. Mir wollten dat ze maachen, déi méi-ausdrécken Mir-146a zu gastric Kriibs Zellen an dann mRNAs mat reduzéierter Ausdrock Erkenntnesser [26]. Dofir, iwwerpréift mir Mir-146a Ausdrock vun engem Rot vu Zell Linnen an fonnt ofwiesslungsräich, awer verwonnerlech niddereg Ausdrock vu Mir-146a vun der sinn gastric Zell Linnen (Zousätzleche file1: Dorënner S3), déi zu erhéijen nogewise iwwer-Ausdrock que <. br> De Mënsch gastric Kriibs Zell Linn SNU638, wat fir Mir-146a iwwer-Ausdrock Studien neglectable Niveau vun endogenous Mir-146a huet war gutt fonnt. Zanter Mir-146a Ausdrock vun der getest gastric Zell Linnen Niddereg war Studien Mir-146a inhibition net gehaal huet. VerfÜgung Mir éischte wann iwwer-Ausdrock vun Mir-146a getest de Wuesstem vun der SNU638 Zelle betraff a Zell Wuesstem onberéiert fonnt ( Weider file1: Dorënner S4). Duerno, goufen global Ännerungen am Gentherapie Ausdrock vun SNU638 Zellen folgenden iwwer-Ausdrock vun Mir-146a iwwerpréift. No Mir-146a transfection mRNAs mat virausgesot 3'UTR Mir-146a Zil- Siten mein erof-reegelen Verglach zu mRNAs ouni virausgesot Ziler Siten (P &Si besteet; 4.6e-11, zwee-tailed Wilcoxon Geleeënheet-Zomm Test) (Dorënner 3A) . Mir analyséiert all Wierder vun Längt 5-7 fir iwwer-Representatioun zu verwandelt-reegelen mRNAs der Mir-146a transfection an hunn d'Wuert mat verwandelt-Regulatioun soll stäerkst war de Som Site ergänzen Mir-146a Base fir eeler 2-7 /8 ( Figur 3B). Gët mat virausgesot 3'UTR Mir-146a Zil- Siten déi vill verwandelt-reegelen op Mir-146a transfection huet sech als potentiell direkt Ziler Mir-146a erauskoum. 847 dëse Kritèren (: Table S5 Weider file1) iwwereneestëmmen. D'Top 10 am Ugrëff-reegelen Potential Mir-146a Ziler sinn an Dorënner 3C gewisen. Als negativ Confirmatioun Kontroll widderhuele mer d'Prozedur SNU638 Zellen mat engem Mir-146a LNA inhibitor bestéet. Et war kee groussen up-Regulatioun vun Genen mat de Som Site ergänzen Mir-146a Base fir eeler (Donnéeën net gewisen). Figur 3 Umeldung vun Mir-146a Ziler. (A) virausgesot Mir-146a Zil- gët sinn däitlech erof-reegelen der Mir-146a transfection Verglach zu ausgedréckt Genen datt net virausgesot ginn Ziler vum Mir-146a (P &Si besteet; 4.6e-11, Wilcoxon Geleeënheet-Zomm Test-zwee tailed) . (B) Top 10 Wierder déi soll mat verwandelt-Regulatioun (Korrelatioun Z-Fändelen zu lénks vun all Wuert ugi sinn, all 10 Wierder hunn eng geschate FDR &Si besteet; 1e-6). Capital Bréiwer Highlight der miRNA Som Regioun, Watson-Crick huel-Puer (blo), mismatches (rout). D'Wuert stäerkst mat verwandelt-Regulatioun soll war Som Site ergänzen miRNA Base fir eeler 2-7 /8. (C) gët, dien 6mer oder 7mer Mir-146a Som Siten an der 3'UTR, datt déi meescht verwandelt-regulariséiert sinn op Mir-146a transfection sinn gewisen. Dës sinn potentiell direkt Mir-146a Ziler. Ausdrock ass zu log2 fantastesch änneren entscheet. D'3'UTR 6 m /7 m Sailen weg Zuelen vun 6- oder 7mer Mir-146a Som Siten am 3'UTR. VerfÜgung den dräi stäerkste verwandelt-reegelen Genen op Mir-146a iwwer-Ausdrock, IRAK1, caspase Rekrutement Domaine public-haltege FAQ 10 (CARD10) an COP9 konstitutiven photomorphogenic homolog subunit 8 (COPS8) (Dorënner 3C) all gehéieren sécher Weeër Spëtzekandidat fir NF-κB Aktivéierung [27-29]. IRAK1 ass eng bekannt Mir-146a Zil- Équipe an TLR- an IL-1R-mediated Aktivatioun vun NF-κB [16-18]. CARD10 ass zu GPCR-mediated Aktivatioun vun NF-κB [27] Équipe, iwwerdeems COPS8 geduecht ass an dëser op hiren Engagement am T Zell receptor (kennen) baséiert Passerelle Équipe gin -mediated NF-κB Aktivéierung [28]. Verwonnerlech, mä ähnlech zu de Conclusiounen vun Boldin et al. VerfÜgung [30], Ausdrock vun TRAF6, déi virdrun als Mir-146a Zil- [16, 18, 31] beschriwwe ginn ass, war net um transcriptional Niveau reduzéiert der mir-146a iwwer-Ausdrock vun eise Modell System. VerfÜgung an gastric Kriibs, NF-κB modulates Zell Iwwerliewe, excellence an inflammation, an NF-κB Aktivéierung ass mat aarmséileg Resultat vun gastric Kriibs verbonne [32, 33]. Mir sech also op characterizing CARD10 an COPS8 als direkten Mir-146a Ziler an hir Rollen am NF-κB Aktivatioun vun gastric Kriibs. Mir bestätegt Mir-146a-mediated verwandelt-Regulatioun vun CARD10, COPS8 an IRAK1 um ët Niveau (Dorënner 4A) an hunn och dass Mir-146a reduzéiert Niveau vun CARD10, COPS8 an IRAK1 FAQ (Dorënner 4B). Endlech, war direkt Reklamme vu Mir-146a zu 3'UTRs vun der Zil- Genen benotzt luciferase assays (Dorënner 4C) bewisen. Am Resumé, bestätegt mir virdrun Observatioune weisen, datt Mir-146a IRAK1 direkt Ziler a mir och zwee nei Ziler identifizéiert, CARD10 an COPS8, déi Coden fir Proteinen proposéiert fir an NF-κB Aktivéierung Équipe ginn. COPS8 ass eng Komponent vun der COP9 signalosome déi vun aacht subunits (GPS1 an COPS2-8) besteet [34]. COPS8 ass déi eenzeg subunit direkt vum Mir-146 cibléiert, mee zanter Verfall vun de Montant vun den eenzelne subunits ass de Montant vun anere subunits ze beaflossen dës [35, 36], iwwerpréift mir wéi transfection mat Mir-146a betraff Ausdrock vun all COP9 signalosome Voleten. An unstimulated Zellen war den Ausdrock vun COPS2 reduzéiert (20%) (Zousätzleche file1: Dorënner S5). Mir iwwerhuelen also datt d'Auswierkunge vum Mir-146a op der COP9 komplex haaptsächlech aus enger Reduktioun vun COPS8 Ausdrock Resultat, obwuel indirekt Déstabiliséierung vum Komplex net eraus flitt kann. Figur 4 CARD10 an COPS8 sinn direkt Mir-146a Ziler. (A) mRNA Ausdrock vun den zwee neie Mir-146a Ziler, CARD10 an COPS8, an IRAK1, e bekannte miR_146a Zil, war zu control- an Mir-146a-transfected vun qPCR sech SNU638 Zellen. Ausdrock vun all ët ass zu Kontroll-transfected Zellen relativ zu den Ausdrock gewisen. CARD10, COPS8 an IRAK1 Ausdrock war verwandelt-reegelen folgenden Mir-146a iwwer-Ausdrock. Date sinn als mengen ± S.D. dës vu véier biologescher gefaart. * = P &Si besteet; 0,05, ** = P &Si besteet; 0,01, *** = P &Si besteet; 0,001. (B) Mir-146a transfection reduzéiert och d'FAQ Niveau vun CARD10, COPS8 an IRAK1 zu Mir-146a-transfected SNU638 Zellen. Den Ausdrock vun all FAQ ass d'Expressioun an Kontroll-transfected Zellen famill gewisen. Bands goufen zum laachen famill ze β-actin. Date sinn als mengen ± S.D. dës vu véier biologescher gefaart. * = P &Si besteet; 0,05, ** = P &Si besteet; 0,01, *** = P &Si besteet; 0,001. (C) Préifen vun direkter a funktionell Zil- luciferase gesond verbindlech mat mengn virstellen 3'UTRs an mutated (Mut) 3'UTRs (d'Mëtt 4 Nukleotid waren an Mir-146a bindend Site ersat) fir CARD10, COPS8 an IRAK1. Gesond entweder virstellen oder mutated (Mut) 3'UTRs matgeholl fir d'Liichtkäfer luciferase Gentherapie sech Co-transfected an HEK293 Zellen zesumme mat Renilla luciferase Kontroll plasmid an entweder Mir-146a oder Kontroll (siGlo) mat. Lénks, ass luciferase Aktivitéit famill ze Aktivitéit zu Kontroll-transfected Zellen entscheet. Mir-146a reduzéiert luciferase Aktivitéit vun gesond mat virstellen CARD10, COPS8 an IRAK1 3'UTRs. Richteg, Haaptrei Alignementer vum Mir-146a a Potential virstellen an Mut 3'UTR Zil- Emplacementer gewisen, mutated Base sinn am rout gewisen. Date sinn als mengen ± S.D. dës oft biologescher gefaart. *** = P &Si besteet; 0,001. Haaptrei Alignementer sinn aus DIANALab ugepasst (2009). VerfÜgung Mir-146a bremst GPCR-mediated NF-κB Aktivitéit vun gezielt CARD10 an COPS8 VerfÜgung CARD10 an COPS8 sinn zu Équipe GPCR-mediated Aktivatioun vun NF-κB [28, 29 ]. Mir wollten dofir hir Rollen am Signal transduction zu gastric Kriibs ze etabléieren an dono d'Wichtegkeet vum Mir-146a ermëttelen dat sécher fir inhibiting. Fir dësen Zweck benotzt mir lysophosphatiditc Seier (LPA) wat engem bekannt activator vun der GPCR-mediated NF-κB-Aktivéierung Passerelle ass [29], an gastric Kriibs Zell Wanderung an Invasioun ënnerstëtzt [37]. LPA-stiumlation geklomme NF-κB Aktivitéit an eiser luciferase reporter System (Dorënner 5). siRNA knockdown vun CARD10 an COPS8 Ausdrock inhibited vill LPA-stimuléiert GPCR-mediated Aktivatioun vun NF-κB zu SNU638 Zellen (Dorënner 5). Dëst inhibition war vergläichbar mat der Raumstatioun-146a-entschlof inhibition. Am Géigesaz, war inhibiting endogenous Mir-146a ouni Effekt op NF-κB Aktivéierung. Wéi virausgesot, siRNA-mediated Repressioun vun IRAK1 Ausdrock net gemaach Afloss LPA-stimuléiert Aktivatioun vun NF-κB (Dorënner 5) als IRAK1 net de GPCR-mediated Passerelle Équipe ass. Als TRAF6 engem Mir-146a Zil- mat enger Roll an NF-κB Aktivéierung ass, war den Effet vun siRNA-mediated Repressioun vun TRAF6 Ausdrock op LPA-stimuléiert NF-κB Aktivitéit ze propagéieren. Allerdéngs, knockdown vun TRAF6 hutt inhibit net LPA-stimuléiert NF-κB Aktivitéit (Dorënner 5). Dës Resultater weisen, datt déi zwee nei identifizéiert Mir-146a Ziler, CARD10 an COPS8, sinn zu GPCR-mediated Aktivatioun vun NF-κB Équipe. Dofir, war den Effet vun der Raumstatioun-146a iwwer-Ausdrock op LPA-stimuléiert NF-κB Aktivitéit studéiert. Mir-146a inhibited vill LPA-stimuléiert NF-κB Aktivitéit zu SNU638 Zellen (Dorënner 5). Eng Mëschung vun siRNAs géint CARD10, COPS8, IRAK1 an TRAF6 MrGo de Bord-146a-mediated inhibition vun NF-κB Aktivitéit (Dorënner 5). Knockdown vun zwee aner COP9 Komponente (COPS2 an COPS5) inhibited och der LPA-stimuléiert NF-κB Aktivitéit, d'Wichtegkeet vun Präsenz vun all signalosome COP9 Musiktherapie- subunits fir LPA-stimuléiert Aktivatioun vun NF-κB. qPCR vun den Ausdrock vun de verschiddenen Deeler iwwerpréift bestätegt d'knockdown (Dorënner 5). Figur 5 Mir-146a Ziler COPS8 an CARD10 GPCR-mediated NF-κB Aktivéierung. SNU638 Zellen sech Co-transfected mat NF-κB reporter plasmid an Renilla luciferase Kontroll plasmid zesumme mat Kontroll (siGlo), siRNA oder Mir-146a. Zellen sech mat 25 μM LPA an luciferase Aktivitéit stimuléiert war gemooss. Luciferase Aktivitéit ass relativ zu Aktivitéit entscheet an Kontroll transfected LPA-stimuléiert Zellen. siRNA géint CARD10 an COPS8, Mir-146a, Mir-146a inhibitor an enger siRNA Mëschung reduzéiert luciferase Aktivitéit. siRNA géint IRAK1 an TRAF6 hutt reduzéieren net luciferase Aktivitéit. LPA-stimuléiert NF-κB Aktivéierung war och vun siRNA géint COPS2 an COPS5 inhibited Musiktherapie- déi aner perturbation vun der COP9 signalosome komplex GPCR-mediated NF-κB Aktivéierung verklengert. siMix, Mix vun siRNAs géint CARD10, COPS8, IRAK1 an TRAF6. Date sinn wéi déi heeschen ± S.D. dës vu siwen biologescher gefaart * = P &Si besteet. 0,05. Der relativer Ausdrock vun TRAF6, COPS8, IRAK1, CARD10, COPS2 an COPS5 war mat qPCR gemooss. Gray-shading beweist eng wichteg Ännerung vun der Meenungsäusserung, p &Si besteet; 0,05, n = 4. VerfÜgung Den Ausdrock vun Mir-146a zu Deel ass vun NF-κB kontrolléiert haten. Mir ginn also och wéi den Ausdrock vun Mir-146a vun LPA an IL-1β Stimulatioun betraff war. Mir hu fonnt, datt LPA Behandlung dem Wëllen vun Mir-146a an IL-1β Stimulatioun huet e 4-fantastesch Zouhuele Mir-146a Ausdrock verduebelt, déi virdrun Observatioune vergläichbar ass [16, 38] (Zousätzleche file1: Dorënner S6). Obwuel Mir-146a LNA den Ausdrock vun dräi vun der Raumstatioun-146a Ziler (TRAF6, IRAK1 an CARD10) (Dorënner 5) de globale Aktivatioun vun NF-κB fräi net SNU638 Zellen zu LPA-stimuléiert Mir-146a LNA behandelt verännert gouf.
mir-146a verklengert LPA-entschlof Ausdrock vun cytokines a Wuesstem Faktoren VerfÜgung Am meeschte carcinomas microenvironmental Facteure wéi genetesch hire Restaurant wahrscheinlech responsabel sinn fir activating NF-κB sécher, datt verschidde Prozesser dorënner secretion vum Wuesstem Facteuren an cytokines [39 reguléieren, 40]. Dofir, ze propagéieren mir wéi Mir-146a vun extracelluar Signaler wéi LPA entschlof Ausdrock vun ausgewielt NF-κB-reegelen Wuesstem Facteuren an cytokines modulates. LPA-Stimulatioun vill Ausdrock vun interleukin-6 fräi, -8, 23A (IL-6, IL-8, IL-23A) a chemokine (CC Motif) ligand 5 (CCL5), Kolonie Spannend Faktor 1 (macrophage) (CSF- 1) a platelet-ofgeleet Wuesstem Faktor Beta polypeptide (PDGFB) zu SNU638 Zellen (Dorënner 6). Dat confirméiert datt Ausdrock vun dësen Genen vun LPA-entschlof NF-κB Aktivitéit reglementéiert ass. Iwwer-Ausdrock vun Mir-146a ofgeholl vill Ausdrock vun IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 an PDGFB zu SNU638 Zellen (Dorënner 6). Obschonn IL-6 ass eng Zilscheif Gentherapie vun NF-κB, an och vun LPA Mir-146a iwwer-Ausdrock upregulated rauszesichen IL-6 Ausdrock ënner eis Konditiounen (Dorënner 6) reduzéieren. Allerdéngs, LPA Aféierungs- vun IL-6 Ausdrock ass net nëmmen duerch NF-κB mediated mä och iwwer aner Weeër (MAPK /Erk, PI3K /Akt, an p38) [41], déi fir d'Differenzen bäidroen kënnen. An SNU638 Zellen ass d'basal Niveau vun IL-6 héich wéi IL-8, déi de mRNA Ëmsaz Afloss kann. Dat kéint en Deel vun de Grënn sinn, datt Mir-146a manner Effet op LPA-stimuléiert IL-6 Ausdrock wéi op IL-8 Ausdrock huet, deen och schonn an anere bewosst Systemer [42] gesinn huet. Figur 6 Mir-146a bremst LPA-entschlof cytokine Ausdrock. 25 μM LPA war vun Ufank un cytokine Ausdrock vu mënschlechen gastric carcinoma SNU638 Zellen induce. LPA bedeitend verstäerkt Ausdrock vun IL-6, IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 an PDGFB, déi gemooss gouf benotzt qPCR a relativ zu den Ausdrock Niveau an onbehandelt Kontroll Zellen gewisen. Dës Äntwert ass an Mir-146a-transfected Zellen reduzéiert. Date sinn als mengen ± S.D. gewisen, n = 4, * = P &Si besteet; 0,05, NS = Net bedeitendst. VerfÜgung Mir-146a iwwer-Ausdrock vun SNU638 Zellen verklengert monocytes Recrutement vun monocytes VerfÜgung An carcinomas kann duerch e.g. rekrutéiert ginn CCL5 an CSF-1 ausgedréckt vun entholl Zellen an dësen entholl einfach vun monocytes dréit zu der entholl-Spur demagogesch Äntwert vun de Kriibs [39, 40]. Nodeems hien dat Mir-146a LPA-entschlof Ausdrock vun cytokines reduzéiert, iwwerpréift mir wéi Mir-146a iwwer-Ausdrock Recrutement vun monocytes betraff. Mir hu fonnt, datt LPA-Behandlung vun SNU638 Zellen fräi monocyte Migratioun Richtung bedingt mëttelfristeg aus der SNU638 Zellen (Dorënner 7 an Weider file1: Dorënner S7), wobäi transfection mat Mir-146a zu Deel dës Äntwert abrogated (Dorënner 7), nees Musiktherapie- datt mir -146a bremst der biologescher Äntwerte vun GPCR-mediated Aktivatioun vun NF-κB wéi, Recrutement vun monocytes. Figur 7 Mir-146a verklengert monocyte Migratioun. Monocyte Migratioun géint bedingt mëttelfristeg aus control- oder Mir-146a-transfected SNU638 Zellen datt onbehandelt sech lénks oder stimuléiert mat 25 μM LPA war iwwer 8 Stonnen duerno. Migratioun vun Zellen ass relativ zu Migratioun vun onbehandelt Kontroll Zellen gewisen. Monocyte Migratioun géint mëttelfristeg aus LPA-stimuléiert SNU638 Zellen fräi war am Verglach zu Migratioun géint mëttelfristeg aus onbehandelt Zellen, iwwerdeems monocyte Migratioun géint mëttelfristeg aus Mir-146a-transfected, LPA-stimuléiert Zellen sech aus Kontroll-transfected Verglach zu mëttelfristeg ofgeholl, LPA-stimuléiert Zellen. Date sinn als mengen ± S.D. dës vu véier biologescher gefaart. ** = P &Si besteet; 0.01, NS = Net bedeitendst. VerfÜgung Diskussioun VerfÜgung Microenvironmental Facteure si wichteg fir NF-κB Aktivatioun vun inflammation-Undriff Cancers wéi gastric Kriibs an dëser NF-κB Aktivatioun kann Kriibs Zellen mat Virdeeler, déi zu der tumorgenic droen déi Prozesser [32, 43]. Modulation vun NF-κB-activating sécher ass also wichteg fir inflammation-mediated entholl Entwécklung Kontrollfunktioun. Hei, mir weisen, datt Mir-146a eng zentral negativ regulator vun NF-κB Aktivéierung ass wéi et e puer NF-κB-activating Weeër bremst. VerfÜgung Mir-146a Ausdrock war bis-reglementéiert App fonnt. 2/3 vun de Mënscherechter souwéi an der gastrin KO Maus Modell vun gastric Kriibs gastric adenocarcinomas. Den Zerfall, Ausdrock vum Mir-146a fonnt gouf zu cervical, Broscht, pancreatic an Schild Kriibs fräi [11, 44-46]. Virdrun, Ausdrock vum Mir-146a huet souwuel Bastelen a verwandelt-reglementéiert gastric Kriibs fonnt ginn [21-24]. Dës contraire Resultater kënnen spigelen Differenzen an erhéijen an hir microenvironment geplatzt verschiddene Grad vun NF-κB Aktivitéiten, déi Mir-146a Ausdrock Kontrollen [16]. Verwonnerlech, fonnt mir nidderegen Niveau vum Mir-146a zu Mënsch gastric Kriibs Zell Linnen. Dëst konnt hin, datt d'fräi Mir-146a Niveauen am erhéijen gesinn duerch microenvironmental Faktoren coursed sinn e.g. Zellen der entholl Zellen Ëmfeld. VerfÜgung Fir d'Auswierkunge vun fräi Mir-146a Niveauen am gastric Kriibs mir nei Mir-146a Ziler, CARD10 an COPS8 identifizéiert zwee iwwerpréifen, an der Roll vun dësen Ziler ze propagéieren. Mir hu fonnt, datt Mir-146a GPCR-mediated duerch direkt gezielt an Ugrëff-Regulatioun Ausdrock vun CARD10 an COPS8 NF-κB Aktivéierung inhibited. CARD10 ass bekannt fir GPCR-entschlof Aktivatioun vun NF-κB [27, 29] néideg ginn, iwwerdeems COPS8 ass eng subunit vun COP9 signalosome datt NF-κB Aktivéierung Kontrollen [28, 47]. Mir weisen datt CARD10 zu GPCR-mediated Aktivatioun vun NF-κB Équipe ass, a gëtt nei Beweiser datt COPS8 och zu dësem Passerelle Équipe ass. Mir-146a iwwer-Ausdrock och zu reduzéiert Ausdrock vun COPS2, aner subunit vun der COP9 signalosome gefouert. Mir huelen un, datt dëst eng indirekt Effekt, well et am COPS2 3'UTR a Ännerungen an der Ausdrock vun enger subunit gouf dës ze beaflossen, datt vun deenen aneren [35, 36] kee Mir-146a bindend Site ass. Et ass also méiglech, dass Mir-146a gewëssermoossen Akt kann déi net nëmmen COPS8 gezielt mee de COP9 signalosome destabilizing. VerfÜgung Aberrant sécher duerch GPCRs huet ze entholl Zell Wuesstem an Iwwerliewe, an NF-κB-activating GPCRs gewiescht verbonne ginn dës Distanz zu engem Netzwierk vu Cancers ze cotiséieren (vun Dorsam &gekuckt; Gutkind [48]). GPCRs kënnt via VerfÜgung der CARD10 /BCL10 /MALT1 komplex der bindend ligands wéi LPA, enothelin-1, angiotensin II (Ang II) an chemokine (CXC Motif) ligand 12 (CXCL12) (Dorënner 8) NF-κB aktivéieren [ ,,,0],29, 49]. An eiser Etude benotzt mir LPA GPCR-mediated Aktivatioun vun NF-κB zu Modell. GPCR-sécher féiert zu entholl Werdegang LPA-entschlof [49]. Sou, Mir-146a-mediated inhibition vun GPCR-sécher konnt entholl suppressing Effekter hunn. Figur 8 Mir-146a Ziler Multiple NF-κB Aktivéierung Weeër. Sënn Illustratioun vun NF-κB-activating Weeër. Mir-146a gouf schonn dës IRAK1 an TRAF6 an an dëser Etude op Zil- mer weisen datt Mir-146a CARD10 an COPS8 Ziler. Mir-146a Ziler mat roude Kreesser markéiert ginn. VerfÜgung Nieft GPCR-mediated NF-κB Aktivéierung NF-κB kënnt via VerfÜgung entholl-necrosis-Faktor receptor (TNFR), IL-1R, TLR ageschalt ginn, E misst an B Zell receptor (BCR) [50] (Dorënner 8). Virdrun, gouf Mir-146a dës NF-κB Aktivéierung via VerfÜgung dës kenne vun verwandelt-Regulatioun Ausdrock vun TRAF6 an IRAK1 [16, 18, 30, 31] zu inhibit. Mir-146a Ziler IRAK1 zu gastric Kriibs Zellen, mä net TRAF6. Obwuel, weisen mir hei dat Mir-146a GPCR-mediated Aktivatioun vun NF-κB, zousätzlech zu der Aktivatioun via VerfÜgung TNFR Ziler, IL-1R, TLR, misst an BCR, vun gezielt CARD10 an COPS8 (Dorënner 8). Sou, Ziler Mir-146a Multiple Komponente vun Weeër an gastric Kriibs Zellen NF-κB-activating. Dëst ass fir d'NF-κB Passerelle dës virun net, mä gouf fir an der transforméiert Wuesstem Faktor-β (TGF-β) Passerelle, wou souwuel Mir-21 an d'Mir-17-92 Stärekoup Zil- puer mRNAs coding virdrun gesinn Proteinen am TGF-β Passerelle [51, 52]. Multiple Komponente vu verschiddene NF-κB-activating Weeër Mir-146a mediates engem sécherlech a komplex Kontroll vun NF-κB Aktivitéit vun gezielt. Puer aner miRNAs kann och NF-κB-sécher, regléieren awer nëmmen Mir-146a Ziler puer Genen vun verschiddenen NF-κB-activating Weeër, proposéiert Mir-146a als Schlëssel modulator vun NF-κB Aktivéierung. VerfÜgung NF-κB reguléieren Ausdrock vun e puer Aspekter vun entholl Werdegang Équipe cytokines a Wuesstem Faktoren [43]. Tatsaach, datt Mir-146a NF-κB Aktivitéit Verloschter, ass et méiglech, datt Mir-146a entholl suppressing Akte vum Ausdrock vun esou cytokines a Wuesstem Faktoren reduzéieren. Iwwerhaapt hunn mir dat Mir-146a iwwer-Ausdrock reduzéiert Ausdrock vu verschiddene cytokines a Wuesstem Facteure mat engem bekannte Roll an Kriibs Entwécklung; IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 an PDGFB. Dës Genen kann Erhéijung Zell Prolifératioun, Zell Haftung an angiogenesis [53-55], bäi ze entholl lymphangiogenesis [56], aktivéieren Här iwert mech selwer [57], monocytes ze erhéijen do- [39, 40] an induce entholl-verbonne macrophages (TAMs) ze secrete entholl-Spur mediators [58] (Dorënner 9). Figur 9 biologesch Prozesser an gastric Kriibs Zellen inhibited vum Mir-146a. Lénks erschéngt, Mir-146a Ziler direkt IRAK1, CARD10 an COPS8 zu SNU638 Zellen. Dëst féiert zu inhibition vun NF-κB Aktivéierung an doduercher ze repressed Ausdrock vun NF-κB-reegelen cytokines a Wuesstem Facteuren. Ausdrock vun Mir-146a ass och vun NF-κB [16] gereegelt. Recht erschéngt, Mir-146a Verloschter Ausdrock vun CCL5, CSF-1, IL-8, PDGF an IL-23A, déi zu monocyte Migratioun an dat, Prolifératioun, angiogenesis, lymphangiogenesis an fibroblast an macrophage Wuesstem Faktor release Équipe ginn. Sou, kéint Mir-146a als entholl suppressor Akt vun Kriibs-Spur Auswierkunge vun NF-κB Aktivitéit reduzéieren. VerfÜgung Chemotactic vun entholl Zellen Verëffentlechung cytokines kann monocytes ze entholl Siten [39, 59] rekrutéieren. Dës monocytes kann entholl Werdegang [60] förderen. CCL5 an CSF-1 si Beispiller vun monocyte-zousätzlech cytokines vun entholl Zellen Verëffentlechung [39, 40]. Wéi erwaart, migrated monocytes manner géint bedingt mëttelfristeg aus LPA-stimuléiert SNU638 Zellen iwwer-ausdrécken Mir-146a Verglach zu LPA-stimuléiert Kontroll Zellen. Figur S2. Figur S3. Figur S4. Figur S5. Figur S6. 0,05. All Auteuren liesen an guttgeheescht der Finale mëttelalterlech Handschrëft. VerfÜgung

• Concurrent overexpression vun mat Helicobacter pylori Zesummenhang p53 stattfannen serum infection
• Intraneural Metastasen vun gastric carcinoma féiert zu sciatic Nerve Athetos