microRNA-146a inhibe G acoplado a la proteína de activación mediada por el receptor de NF-kappa B por la orientación CARD10 y COPS8 en el cáncer gástrico

microARN-146a inhibe G activación mediada por el receptor acoplado a la proteína de NF-kB por la orientación CARD10 y COPS8 en el cáncer gástrico
Resumen Antecedentes

El cáncer gástrico es la segunda causa más común de muerte por cáncer en el mundo. señales inflamatorias procedentes de células de cáncer gástrico son importantes para el reclutamiento de células y la regulación de la metástasis del cáncer gástrico inflamatorias. Varios microRNAs (miARN) se han demostrado estar involucrados en el desarrollo y progresión del cáncer gástrico. miRNA-146a (miR-146a) es un modulador de señales inflamatorias, pero poco se sabe acerca de su importancia en el cáncer gástrico. Por lo tanto, queríamos identificar los objetivos de miR-146a en el cáncer gástrico y examinar sus funciones biológicas.
Resultados
La expresión de miR-146a se evaluó mediante PCR cuantitativa (qPCR) y encontraron hasta reguladas en los ratones knockout gastrina , un modelo de ratón de cáncer gástrico, y en 73% de los adenocarcinomas gástricos humanos investigados. La expresión de miR-146a por células de cáncer gástrico fue confirmada por hibridación in situ
. Análisis global de los cambios en los niveles de mRNA después de la transfección de miR-146a identificó dos transcripciones, proteínas de reclutamiento de caspasas dominio que contienen 10 (CARD10) y la COP9 signalosome complejo subunidad 8 (COPS8), como nuevos objetivos de miR-146a. qPCR, y ensayos de transferencia Western confirmó luciferasa estas transcripciones como objetivos directos de miR-146a. CARD10 y COPS8 mostraron ser parte de la vía del receptor acoplado a proteína G (GPCR) de la activación del factor nuclear-kappaB (NF-kappaB). ácido lisofosfatídico (LPA) induce la activación de NF-kappaB vía
esta vía y la sobre expresión de miR-146a inhibe la activación de NF-kappaB inducida por LPA, reducción de la expresión inducida por LPA de citoquinas promotores de tumores y factores de crecimiento e inhibió la atracción de monocitos .
Conclusiones
expresión de miR-146a es regulada en la mayoría de los cánceres gástricos cuando tenga por objeto CARD10 y COPS8, la inhibición de la activación mediada por GPCR de NF-kappaB, lo que reduce la expresión de NF-kappaB regulados por el tumor- la promoción de citocinas y factores de crecimiento. Al dirigirse a los componentes de varias vías de NF-kappaB-activantes, miR-146a es un componente clave en la regulación de la actividad de NF-kappaB.
Palabras clave
cáncer de estómago para no codificantes de ARN Antecedentes Las citoquinas
cáncer gástrico es Globalmente la segunda causa más común de muerte relacionada con el cáncer [1]. Desarrollo de cáncer gástrico se ve influida por las interacciones entre el huésped, los factores ambientales y bacterianas. Ejemplos de factores de riesgo sinérgicos para el cáncer gástrico son polimorfismos en genes implicados en la respuesta inflamatoria del huésped [2], Helicobacter pylori
(H. pylori
) factores de virulencia [3] y las dietas ricas en sal y nitrato de [4] . A pesar de los recientes avances en la detección y tratamiento del cáncer gástrico temprano, la tasa de supervivencia a largo plazo para el cáncer gástrico avanzado es baja [5]. Los principales retos en el tratamiento del cáncer gástrico avanzado son una metástasis linfáticas, peritoneal o distantes, que predicen de forma simultánea un mal resultado para estos pacientes [6].
Aunque se han reportado muchos oncogenes y supresores de tumor de estar involucrados en el desarrollo de los carcinomas gástricos , los mecanismos moleculares de la metástasis de carcinomas gástricos avanzados subyacentes son todavía poco conocidos [7]. Uno de los eventos clave en la carcinogénesis gástrica es la inflamación. La inflamación conduce a la activación del factor de transcripción factor kappaB (NF-kB) nuclear, que está asociado con la carcinogénesis gástrica [8, 9]. MicroRNAs
(miARN) están involucrados en el desarrollo y progresión del cáncer gástrico [10- 13]. miARN es una clase de endógeno, no codificante, moléculas de ARN de una sola hebra de aplicación. 22 nucleótidos que median la regulación post-transcripcional de la expresión génica a través de apareamiento de bases con la región no traducida 3 '(UTR) del ARN mensajero objetivo (mARN) [14]. miRNAs están involucrados en la regulación de la mayoría de los procesos celulares incluyendo la proliferación celular, la migración, la diferenciación y la apoptosis [10, 14, 15]. miRNAs se expresan de forma aberrante en la mayoría de los cánceres humanos y, al igual que los genes codificadores de proteínas, miRNAs puede funcionar como supresores de tumores u oncogenes, con lo que regula la carcinogénesis [10, 12]. miRNA-146a (miR-146a) está regulada por NF-kappa B e inhibe la interleucina-1 receptor (IL-1R) y Toll-like receptor (TLR) - inducida por la activación de NF-kB por la orientación de interleucina-1 quinasa asociada al receptor 1 (IRAK1) y TNF receptor asociado factor de 6 (TRAF6) [16-18]. miR-146a se ha informado de forma aberrante expresado en varias enfermedades inflamatorias y cáncer, pero el papel de miR-146a en el cáncer gástrico sigue siendo controvertido, ya que la expresión de miR-146a se ha encontrado tanto hacia arriba y hacia abajo-regulada aquí [19-24 ]. Por lo tanto, se determinó la expresión de miR-146a en el cáncer gástrico y caracterizaron sus objetivos y funciones moleculares para aclarar los resultados contradictorios.
Encontramos que el miR-146a es regulada hasta en un modelo de ratón de cáncer gástrico, así como en adenocarcinomas gástricos humanos y CARD10 identificado y COPS8 como nuevas dianas directas de miR-146a. Ambos son parte de la transducción de la señal mediada por receptor acoplado a proteína G (GPCR) que media la activación de NF-kB. Esto sugiere que el miR-146a actúa supresor de tumores mediante la inhibición de GPCR mediada por la activación de NF-kB y la expresión resultante de citoquinas promotores de tumores y factores de crecimiento.
Resultados
expresión de miR-146a es regulada hasta en un ratón modelo de cáncer gástrico y en los adenocarcinomas gástricos humanos
gastrina ratones knockout (KO) son aclorhidria y desarrollar metaplasia intestinal y adenomas gástricos en el tiempo [25]. El uso de PCR cuantitativa (qPCR) encontramos la expresión de miR-146a aplicación. 2 veces hasta reguladas en la gastrina de edad ratones KO, ya sea con metaplasia intestinal fúndica o adenoma antro en comparación con la expresión de tipo salvaje (WT) ratones (P < 0,05) (Figura 1A). Usando in situ
hibridación miR-146a se detectó en tejido gástrico metaplásico de los ratones KO de gastrina, pero no en el tejido gástrico normal a partir de los ratones WT (Figura 2AB) (file1 adicional: Figura S1). Habiendo establecido que el miR-146a se incrementa en nuestro modelo de ratón de cáncer gástrico Se examinó la expresión de miR-146a en los adenocarcinomas gástricos humanos pareadas y biopsias de control adyacentes y se encontró que era hasta reguladas en 27 de 37 casos (73%) ( Figura 1B). En situ
hibridación mostró que miR-146a fue expresada por las células de adenocarcinoma gástrico humano, mientras que las células miR-146a-positivas no se detectaron en la mucosa gástrica normal (Figura 2CD) (archivo1 adicional: Figura S1). Figura 1 aumento de la expresión de miR-146a en el modelo de gastrina cáncer gástrico ratón KO y el cáncer gástrico humano. (A) La expresión relativa de miR-146a en el tejido del fundus metaplásico (n = 8) y la mucosa del antro hiperplásico (n = 4) /adenomas antrales ratones (n = 4) de nocaut gastrina (KO) en comparación con el promedio de expresión en juego de tipo salvaje (WT) tejido de ratón. * = P < 0.05. plot (B) de la cascada de la expresión de miR-146a en 37 adenocarcinomas gástricos humanos en relación con la expresión en el tejido normal adyacente. miR-146a es regulada hasta en 27 de 37 tumores (73%). Los niveles de expresión de miR-146a se determinaron mediante qPCR y normalizado a los de la RNU44 control endógeno.
La figura 2 en la detección de la hibridación in situ de la expresión de miR-146a en el modelo de cáncer gástrico gastrina KO ratón y cáncer gástrico humano. (A) La expresión de miR-146a no se detectó en tejido de ratón WT fúndica, (B), mientras que no se detectaron células (núcleos azules) miR-146a-positivo en el tejido del fundus metaplásico de ratones KO de gastrina. Se detectó (C) No hay señal con la sonda LNA revueltos. (D) la expresión de miR-146a estaba ausente en el tejido gástrico humano normal, (E), pero presente en células de adenocarcinoma gástrico humano (núcleos azules). (F) control negativo utilizando una sonda de LNA revueltos. células representativas de miR-146a-positivas se indican con flechas. Original x20 aumentos, barra de escala = 100 micras.
No hubo correlación entre la expresión de miR-146a en los adenocarcinomas gástricos y pacientes 'la edad, el sexo y la localización o la clasificación de los tumores (datos no mostrados). Aunque los pacientes con alta expresión de miR-146a parecía tener una mejor supervivencia global no fue significativa. (Archivo1 adicional: Figura S2): perfil objetivos de miR-146a miembros de la vía de activación de NF-B mediada por GPCR
Habiendo demostrado aumento de la expresión de miR-146a en la mayoría de los cánceres gástricos, queríamos establecer las acciones biológicas de miR-146a mediante la caracterización de sus dianas moleculares directos en el cáncer gástrico humano. Quisimos hacer esto mediante la sobre-expresión de miR-146a en células de cáncer gástrico y luego la identificación de los ARNm con una expresión reducida [26]. Por lo tanto, hemos examinado la expresión de miR-146a en un panel de líneas celulares y encontramos variadas, pero sorprendentemente baja expresión de miR-146a en las líneas de células gástricas disponibles (archivo1 adicional: Figura S3), teniendo en cuenta el detectado un exceso de expresión en los tumores <. br> La línea celular de cáncer gástrico humano SNU638, que tiene niveles despreciables de miR-146a endógena se encontró adecuado para miR-146a expresión de estudios. Dado que la expresión de miR-146a fue muy baja en las líneas celulares ensayadas gástrica no se realizaron estudios de inhibición de miR-146a.
Primero probamos si la sobreexpresión de miR-146a afectado el crecimiento de las células SNU638 y encontró el crecimiento celular no afectado ( fichero1 adicional: Figura S4). Posteriormente, se examinaron los cambios globales en la expresión génica en células SNU638 siguientes sobreexpresión de miR-146a. Después de ARNm de transfección de miR-146a con miR-146a sitios objetivo previsto 3'UTR fueron significativamente las reguladas en comparación con los ARNm sin sitios objetivos previsto (P < 4.6e-11, de dos colas prueba de suma de rangos de Wilcoxon) (Figura 3A) . Se analizaron todas las palabras de longitud 5-7 de sobre-representación en los ARNm reguladas por después de la transfección miR-146a y encontramos la palabra más fuerte correlaciona con la regulación negativa fue el sitio de la semilla complementaria a madurar bases de miR-146a 2-7 /8 ( Figura 3B). Transcripciones con predichos 3'UTR miR-146a sitios diana que fueron significativamente las reguladas tras la transfección de miR-146a se consideraron como posibles objetivos directos de miR-146a. 847 alcanzaran estos criterios (fichero1 adicional: Tabla S5). Los 10 objetivos de miR-146a potenciales reguladas por los más principales se muestran en la Figura 3C. Como control negativo de validación se repitió el procedimiento de tratamiento de SNU638 células con un inhibidor de LNA miR-146a. No hubo importantes sobre regulación de los genes con el sitio de semilla complementaria a madurar bases de miR-146a (datos no mostrados). Figura 3 Identificación de los objetivos de miR-146a. (A) pronosticó miR-146a objetivo transcripciones son significativamente baja regulado después de la transfección de miR-146a en comparación con los genes expresados ​​que no se predicen los objetivos de miR-146a (P < 4.6e-11, prueba de Wilcoxon suma de rangos de dos colas) . (B) 10 palabras Top más correlacionados con baja regulación (correlación puntuaciones Z se indican a la izquierda de cada palabra, todas las 10 palabras tienen un FDR estimado < 1e-6). Las letras mayúsculas ponen de relieve la región miARN semillas, Watson-Crick pares de bases (azul), los desajustes (rojo). La palabra más fuerte correlacionado con baja regulación fue el sitio de semilla complementaria a madurar miARN bases de 2-7 /8. se muestran (C) Las transcripciones, que tiene 6mer o sitios de semillas de miR-146a 7mer en el 3'UTR, que son más abajo reguladas tras la transfección de miR-146a. Estas son las posibles dianas directas de miR-146a. La expresión se da en cambio log 2 veces. Los 3'UTR 6 m /7 m columnas indican los números de 6 ó 7mer sitios de semillas de miR-146a en el 3'UTR. México La mayoría de los tres genes regulados sobre el miR-146a sobre-expresión, IRAK1, reclutamiento de caspasas dominio que contienen proteínas 10 (CARD10) y la COP9 constitutiva homólogo photomorphogenic subunidad 8 (COPS8) (Figura 3C) todos pertenecen a las vías que conducen a la activación de NF-kB [27-29] señalización. IRAK1 es un objetivo de miR-146a conocido involucrado en TLR y la activación de NF-kB [16-18] IL-1R-mediada. CARD10 está implicado en la activación mediada por GPCR de NF-kappa B [27], mientras que COPS8 se cree que participan en esta ruta en función de su implicación en los receptores de células T (TCR) mediada por la activación de NF-kappa B [28]. Sorprendentemente, pero similar a los hallazgos de Boldin y col.
[30], expresión de TRAF6, que ha sido previamente descrito como un objetivo de miR-146a [16, 18, 31], no se redujo a nivel transcripcional después miR-146a sobre-expresión en nuestro modelo de sistema.
en el cáncer gástrico, NF-kB modula la supervivencia celular, la inmunidad y la inflamación, y la activación de NF-kappa B se asocia con un peor pronóstico en el cáncer gástrico [32, 33]. Por lo tanto, nos hemos centrado en la caracterización de CARD10 y COPS8 como objetivos directos de miR-146a y su papel en la activación de NF-kB en el cáncer gástrico. Se confirmó mediada por miR-146a baja regulación de CARD10, COPS8 y IRAK1 en el nivel de transcripción (Figura 4A) y también encontró que el miR-146a niveles de CARD10, COPS8 y proteínas IRAK1 (Figura 4B) reduce. Por último, la orientación directa de miR-146a a 3'UTRs de los genes diana se demostró usando ensayos de luciferasa (Figura 4C). En resumen, se confirmaron las observaciones anteriores que muestran que el miR-146a se dirige directamente a IRAK1 y, además, hemos identificado dos nuevos objetivos, CARD10 y COPS8, que codifica para proteínas sugerido que participan en la activación de NF-kB. COPS8 es un componente de la signalosome COP9 que consta de ocho subunidades (GPS1 y COPS2-8) [34]. COPS8 es la única subunidad dirigida directamente por el miR-146, pero ya que la alteración en la cantidad de las subunidades individuales se ha demostrado que afectan a la cantidad de otras subunidades [35, 36], se examinó cómo la transfección con miR-146a expresión de todos los afectados componentes COP9 signalosome. En las células no estimuladas la expresión de COPS2 se redujo (20%) (archivo1 adicional: Figura S5). Por lo tanto, suponemos que los efectos de miR-146a en el complejo COP9 se genera principalmente por una reducción en la expresión COPS8, aunque indirecta desestabilización del complejo no se puede descartar. Figura 4 CARD10 y COPS8 son blancos directos de miR-146a. la expresión (A) del ARNm de los dos nuevos objetivos de miR-146a, CARD10 y COPS8, y IRAK1, un objetivo miR_146a conocido, se determinó mediante PCR cuantitativa en células SNU638 Control- y miR-146a-transfectadas. La expresión de cada transcripción se muestra en relación con la expresión en células de control transfectadas. CARD10, COPS8 y expresión IRAK1 se redujo reguladas siguiente miR-146a sobre-expresión. Los datos se muestran como media ± S.D. de cuatro réplicas biológicas. * = P < 0,05, ** = P < 0,01, *** = P < 0.001. transfección (B) miR-146a también redujo los niveles de proteína de CARD10, COPS8 y IRAK1 en las células transfectadas SNU638-miR-146a. La expresión de cada proteína se muestra con relación a la expresión en células de control transfectadas. Las bandas se cuantificaron en relación con ß-actina. Los datos se muestran como media ± S.D. de cuatro réplicas biológicas. * = P < 0,05, ** = P < 0,01, *** = P < 0.001. (C) La verificación de blanco directo y funcional de unión utilizando construcciones de luciferasa que sostienen WT 3'UTRs y 3'UTRs mutados (Mut) (4 nucleótidos del centro fueron sustituidos en el sitio de unión de miR-146a) para CARD10, COPS8 y IRAK1. Las construcciones que contienen ya sea mutados 3'UTRs (Mut) aguas abajo con el gen de luciferasa de luciérnaga WT o se co-transfectaron en células HEK293 junto con plásmido de control de luciferasa de Renilla y, o bien miR-146a o el control (siglo). A la izquierda, la actividad de luciferasa se da en relación a la actividad en las células control transfectadas. miR-146a redujo la actividad de luciferasa de las construcciones con WT CARD10, COPS8 y IRAK1 3'UTRs. Derecha, se muestran los alineamientos de secuencias de miR-146a y WT potencial y sitios objetivo Mut 3'UTR, bases mutadas se muestran en rojo. Los datos se muestran como media ± S.D. repeticiones menudo biológicos. *** = P < 0.001. Los alineamientos de secuencias se han adaptado de DIANALab (2009).
miR-146a inhibe la actividad de NF-kB mediada por GPCR por la orientación CARD10 y COPS8
CARD10 y COPS8 están implicados en la activación de NF-kappa B [28, 29 mediada por GPCR ]. Por lo tanto, hemos querido establecer su papel en la transducción de señales en el cáncer gástrico y posteriormente investigar la importancia de miR-146a para inhibir esta señalización. Para este fin se utilizó ácido lysophosphatiditc (LPA), que es un activador conocido de la vía-B-activación de NF mediada por GPCR [29], y promueve la migración celular de cáncer gástrico y la invasión [37]. LPA-stiumlation aumentó significativamente la actividad de NF-KB en nuestro sistema indicador de luciferasa (Figura 5). siRNA desmontables de CARD10 y expresión COPS8 inhibieron significativamente la activación mediada por GPCR estimulada por LPA de NF-kappa B en células SNU638 (Figura 5). Esta inhibición era comparable a la inhibición miR-146a-inducida. Por el contrario, la inhibición endógena de miR-146a no tuvo efecto sobre la activación de NF-kB. Como se predijo, siRNA mediada por la represión de la expresión IRAK1 no afectó a la activación estimulada por LPA de NF-kappa B (Figura 5), ​​como IRAK1 no está implicada la ruta de GPCR mediada. Como TRAF6 es un objetivo miR-146a con un papel en la activación de NF-KB, se investigó el efecto de la represión siRNA mediada por la expresión de TRAF6 en la actividad de NF-kappa B estimulada por LPA. Sin embargo, desmontables de TRAF6 no inhibió la actividad estimulada por LPA NF-B (Figura 5). Estos resultados indican que los dos objetivos de miR-146a recientemente identificados, CARD10 y COPS8, están involucrados en la activación mediada por GPCR de NF-kB. Por lo tanto, se estudió el efecto de miR-146a sobre-expresión de la actividad de NF-kB estimulada por LPA. miR-146a, inhibió la actividad de NF-kB estimulado por el LPA en células SNU638 (Figura 5). Una mezcla de siRNAs contra CARD10, COPS8, IRAK1 y TRAF6 imitaba la inhibición mediada por el miR-146a de la actividad de NF-kB (Figura 5). Desmontables de otros dos componentes de la COP9 (COPS2 y COPS5) también inhibió la actividad de NF-KB-LPA estimulado, lo que demuestra la importancia de la presencia de todas las subunidades COP9 signalosome para la activación estimulada por LPA de NF-kB. qPCR de la expresión de los diferentes componentes examinados confirmó la caída (Figura 5). Figura 5 objetivos de miR-146a COPS8 y la activación de NF-kappa B mediada por GPCR CARD10. SNU638 células fueron co-transfectadas con NF-B plásmido reportero y el plásmido de control de luciferasa de Renilla junto con el control (Siglo), siARN o miR-146a. Las células se estimularon con LPA se midió 25 M y la actividad de luciferasa. La actividad de luciferasa se da en relación a la actividad en el control transfectado células estimuladas con LPA. siRNA contra CARD10 y COPS8, miR-146a, inhibidor de miR-146a y una actividad luciferasa mezcla siRNA reducida. siRNA contra IRAK1 y TRAF6 no redujo la actividad de luciferasa. estimulado por el LPA activación de NF-kB también se inhibió de siRNA contra COPS2 y COPS5, lo que demuestra que otra perturbación del complejo COP9 signalosome reduce la activación de NF-kappa B mediada por GPCR. SIMIX, mezcla de siRNAs contra CARD10, COPS8, IRAK1 y TRAF6. Los datos se muestran como la media ± S.D. de siete réplicas biológicas * = P. < 0.05. La expresión relativa de TRAF6, COPS8, IRAK1, CARD10, COPS2 y COPS5 se midió utilizando qPCR. Gray-shading indica un cambio significativo en la expresión, p < 0,05, n = 4.
La expresión de miR-146a es en parte controlado por NF-kB. por lo tanto, también a prueba de cómo la expresión de miR-146a se vio afectada por LPA y la estimulación de IL-1β. Se encontró que el tratamiento de LPA se duplicó la expresión de miR-146a y la estimulación de IL-1β dio un aumento de 4 veces en la expresión de miR-146a, que es comparable a las observaciones anteriores [16, 38] (archivo1 adicional: Figura S6). Aunque LNA miR-146a aumentó la expresión de tres de los objetivos de miR-146a (TRAF6, IRAK1 y CARD10) (Figura 5) la activación general de NF-kappa B no fue alterado en estimulada por LPA LNA miR-146a tratada SNU638 células. miR-146a reduce LPA inducida de citocinas y factores de crecimiento
En la mayoría de los carcinomas de factores microambientales en lugar de alteraciones genéticas son probablemente responsables de la activación de NF-kB de señalización que regula varios procesos, incluyendo la secreción de factores de crecimiento y citoquinas [39, 40]. Por lo tanto, se investigó el modo de miR-146a modula la expresión de factores de crecimiento seleccionados regulados por NF-kB y citoquinas inducidas por señales extracelulares, tales como LPA. LPA-estimulación aumentó significativamente la expresión de la interleucina-6, -8, 23A (IL-6, IL-8, IL-23A) y quimiocina (motivo CC) ligando 5 (CCL5), factor estimulante de colonias 1 (macrófago) (CSF- 1) y crecimiento derivado de plaquetas factor de polipéptido beta (PDGFB) en SNU638 células (Figura 6). Esto confirmó que la expresión de estos genes está regulada por la actividad de NF-kB inducida por LPA. La sobreexpresión de miR-146a disminuyó significativamente la expresión de IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 y el FCDP en SNU638 células (Figura 6). A pesar de que la IL-6 es un gen diana de NF-kappa B, y también upregulated de LPA miR-146a sobre-expresión no redujo IL-6 expresión en nuestras condiciones (Figura 6). Sin embargo, LPA inducción de IL-6 expresión no sólo está mediada por NF-kappa B, pero también a través de otras vías (MAPK /ERK, PI3K /Akt y p38) [41], que pueden contribuir a las diferencias. En las células SNU638 el nivel basal de IL-6 es mayor que IL-8, lo que puede afectar a la rotación de mRNA. Este podría ser parte de la razón de que miR-146a tiene menos efecto sobre estimulada por LPA expresión de IL-6 que en la IL-8 expresión, que también ha sido observada en otros sistemas celulares [42]. Figura 6 miR-146a inhibe la expresión de citoquinas inducida por LPA. 25 M LPA se utiliza para inducir la expresión de citoquinas a partir de células de carcinoma gástrico humano SNU638. LPA mejorado significativamente la expresión de IL-6, IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 y PDGFB, que se midió usando qPCR y se muestra en relación con el nivel de expresión en las células de control no tratadas. Esta respuesta se reduce en las células de miR-146a-transfectadas. Los datos se muestran como media ± S.D., n = 4, * = P < 0,05, ns = no significativo.
MiR-146a sobre-expresión en células SNU638 reduce el reclutamiento de monocitos
En los carcinomas monocitos pueden ser reclutados por ejemplo, CCL5 y CSF-1 expresada por las células tumorales y esta infiltración tumoral de los monocitos contribuyen a la respuesta inflamatoria promotor de tumores en el cáncer [39, 40]. Después de haber demostrado que el miR-146a reduce la expresión inducida por el LPA de citocinas, se examinó cómo miR-146a sobre-expresión afectada reclutamiento de monocitos. Se encontró que el LPA-tratamiento de las células SNU638 aumento de la migración de monocitos hacia el medio acondicionado de las células SNU638 (Figura 7 y file1 adicional: Figura S7), mientras que la transfección con miR-146a en parte abrogó esta respuesta (Figura 7), demostrando de nuevo que el miR -146a inhibe las respuestas biológicas de la activación mediada por GPCR de NF-kB, tales como, el reclutamiento de monocitos. Figura 7 miR-146a reduce la migración de monocitos. la migración de monocitos contra el medio condicionado de células transfectadas SNU638 o de control de miR-146a-que se dejaron sin tratar o se estimularon con 25 M LPA fue seguido de más de 8 horas. La migración de las células se muestra relativa a la migración de las células de control no tratadas. la migración de monocitos contra medio a partir de células SNU638 estimuladas con LPA se aumentó en comparación con la migración contra medio de las células no tratadas, mientras que la migración de monocitos contra medio de miR-146a-transfectadas, las células LPA-estimulado se redujo en comparación con el medio de control de transfección, LPA estimula- Células. Los datos se muestran como media ± S.D. de cuatro réplicas biológicas. ** = P < 0,01, ns = no significativo.
Discusión
factores microambientales son importantes para la activación de NF-kappa B en los cánceres de inflamación impulsado como el cáncer gástrico y esta activación de NF-kappa B puede proporcionar células de cáncer con ventajas, que contribuyen a la tumorgenic procesos [32, 43]. La modulación de la señalización de NF-kappa B-activación tanto, es importante para controlar el desarrollo de tumores mediada por inflamación. Aquí, mostramos que el miR-146a es un regulador negativo de la activación central de NF-B, ya que inhibe varias vías de NF-KB-activantes.
Expresión de miR-146a se ha encontrado hasta reguladas en la aplicación. 2/3 de los adenocarcinomas gástricos humanos, así como en la gastrina KO modelo de ratón de cáncer gástrico. Del mismo modo, la expresión de miR-146a se ha encontrado aumentado en cuello uterino, de mama, de páncreas y cáncer de tiroides [11, 44-46]. Anteriormente, la expresión de miR-146a se ha encontrado tanto hacia arriba y hacia abajo-regulada en el cáncer gástrico [21-24]. Estos resultados contradictorios pueden reflejar diferencias en los tumores y su microambiente que resulta en diferentes grados de actividades NF-? B, que controla la expresión de miR-146a [16]. Sorprendentemente, hemos encontrado niveles bajos de miR-146a en líneas celulares de cáncer gástrico humano. Esto podría indicar que el aumento de los niveles de miR-146a observados en los tumores se corrían por factores microambientales por ejemplo, las células que rodean a las células tumorales.
a examinar los efectos del aumento de los niveles de miR-146a en el cáncer gástrico que hemos identificado dos nuevos objetivos de miR-146a, CARD10 y COPS8, y se investigaron las funciones de estos objetivos. Encontramos que el miR-146a inhibió la activación de NF-kappa B mediada por GPCR por la orientación directa y la regulación negativa de la expresión de CARD10 y COPS8. CARD10 se sabe que es necesaria para la activación inducida por GPCR de NF-kappa B [27, 29], mientras que COPS8 es una subunidad de signalosome COP9 que controla la activación de NF-kappa B [28, 47]. Demostramos que CARD10 está implicado en la activación mediada por GPCR de NF-kB, y proporcionado nuevas pruebas de que COPS8 está implicado en esta vía también. miR-146a sobreexpresión también condujo a la reducción de expresión de COPS2, otra subunidad de la COP9 signalosome. Suponemos que esto es un efecto indirecto, ya que no hay sitio de unión de miR-146a en COPS2 3'UTR y los cambios en la expresión de una subunidad se ha demostrado que afectan a la de los otros [35, 36]. Por tanto, es posible que miR-146a, en cierta medida puede actuar no sólo la orientación COPS8 pero desestabilizar el signalosome COP9.
Señalización aberrante a través de GPCRs se ha relacionado con el crecimiento del tumor y la supervivencia celular, y GPCRs NF-kappa B-activadoras han sido demostrado que contribuyen a una amplia gama de tipos de cáncer (revisado por Dörsam & Gutkind [48]). GPCRs pueden activar NF-kappa B a través de
el complejo CARD10 /BCL10 /MALT1 después de ligandos tales como LPA, de endotelina-1, angiotensina II (Ang II) y quimiocinas (CXC motivo) ligando 12 (CXCL12) (Figura 8) de unión a [ ,,,0],29, 49]. En nuestro estudio hemos utilizado LPA para modelar la activación mediada por GPCR de NF-kB. LPA inducida por GPCR cables de señalización a la progresión del tumor [49]. Por lo tanto, la inhibición mediada por el miR-146a de GPCR señalización podría tener efectos supresores de tumores. Figura 8 objetivos de miR-146a múltiples vías de activación de NF-kB. Ilustración esquemática de las vías de NF-KB-activantes. miR-146a previamente se ha demostrado que el objetivo IRAK1 y TRAF6 y en este estudio se muestra que el miR-146a se dirige CARD10 y COPS8. objetivos de miR-146a están marcados con círculos rojos.
Además de la activación de NF-kappa B mediada por GPCR, NF-kappa B puede ser activado a través de
receptor de factor de necrosis tumoral-(TNFR), IL-1R, TLR, receptor de células TCR y B (BCR) [50] (Figura 8). Anteriormente, miR-146a se ha demostrado que inhiben la activación de NF-kappa B a través de
estos receptores por la expresión de regulación hacia abajo de TRAF6 y IRAK1 [16, 18, 30, 31]. miR-146a se dirige IRAK1 en células de cáncer gástrico, pero no TRAF6. Aunque, aquí mostramos que miR-146a se dirige a la activación de GPCR mediada por NF-kappa B, además de la activación a través de
TNFR, IL-1R, TLR, TCR y BCR, por la orientación CARD10 y COPS8 (Figura 8). Por lo tanto, el miR-146a se orienta a varios componentes de las vías en las células de cáncer gástrico NF-B-activación. Esto no se ha demostrado para la ruta de NF-kB antes, pero previamente se ha visto en el factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) vía, donde tanto el miR-21 y el objetivo del clúster miR-17-92 varios ARNm que codifica proteínas en la vía de TGF-β [51, 52]. Al dirigirse a varios componentes de diferente NF-B-activación de las vías de miR-146a media un control robusto y complejo de la actividad de NF-kB. Varios otros miRNAs pueden regular también NF-KB-señalización, pero sólo los objetivos de miR-146a varios genes en diferentes vías de NF-KB-activadores, lo que sugiere miR-146a como un modulador clave de la activación de NF-kB.
NF-kB regula la expresión de citoquinas y factores de crecimiento implicados en varios aspectos de la progresión del tumor [43]. Dado que miR-146a disminuye la actividad de NF-kappa B, es posible que el miR-146a actúa supresores de tumores mediante la reducción de la expresión de tales citoquinas y factores de crecimiento. De hecho, encontramos que miR-146a sobre-expresión expresión de varias citoquinas y factores de crecimiento con un papel conocido en el desarrollo del cáncer reducido; IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 y PDGFB. Estos genes pueden aumentar la proliferación celular, la adhesión celular y la angiogénesis [53-55], contribuir a la LI del tumor [56], se activan los fibroblastos [57], reclutan monocitos a los tumores [39, 40] e inducir macrófagos asociados a tumores (TAM) a secretar mediadores promotores de tumores [58] (Figura 9). Figura 9 procesos biológicos en células de cáncer gástrico inhibidas por el miR-146a. Panel izquierdo, miR-146a se dirige directamente a IRAK1, CARD10 y COPS8 en SNU638 células. Esto conduce a la inhibición de la activación de NF-KB y por lo tanto a la expresión reprimida de citocinas reguladas por NF-kB y factores de crecimiento. La expresión de miR-146a también está regulada por NF-kB [16]. Panel derecho, miR-146a disminuye la expresión de CCL5, CSF-1, IL-8, PDGF y la IL-23A, que están implicados en la migración de monocitos y la diferenciación, proliferación, angiogénesis, linfangiogénesis y la liberación del factor de fibroblastos y el crecimiento de macrófagos. Por lo tanto, miR-146a podría actuar como un supresor de tumores mediante la reducción de los efectos promotores del cáncer de la actividad de NF-kB.
Citoquinas quimiotácticas liberadas por las células tumorales puede reclutar monocitos a sitios tumorales [39, 59]. Estos monocitos pueden promover la progresión del tumor [60]. CCL5 y CSF-1 son ejemplos de citoquinas monocitos reclutar liberadas por las células tumorales [39, 40]. Como era de esperar, los monocitos migran menos contra el medio condicionado de células estimuladas con SNU638 LPA sobre-expresión de miR-146a en comparación con las células control estimuladas con LPA. Figura S2. Figura S3. Figura S4. Figura S5. Figura S6. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

• sobreexpresión simultánea de la mutación de p53 en suero relacionadas con Helicobacter pylori infection
• metástasis de carcinoma gástrico intraneural conduce a nervio ciático palsy