microRNA-146A inibisce G protein-coupled recettore-mediata di NF-kB di mira CARD10 e COPS8 nel cancro gastrico

microRNA-146A inibisce G protein-coupled recettore-mediata di NF-kB di mira CARD10 e COPS8 nel cancro gastrico
Abstract
sfondo
cancro gastrico è la seconda causa più comune di morte per cancro nel mondo. segnali infiammatori provenienti da cellule di cancro gastrico sono importanti per il reclutamento di cellule infiammatorie e la regolamentazione delle metastasi del cancro gastrico. Diversi microRNA (miRNA) hanno dimostrato di essere coinvolto nello sviluppo e nella progressione del cancro gastrico. miRNA-146A (miR-146a) è un modulatore di segnali infiammatori, ma poco si sa circa la sua importanza nel cancro gastrico. Abbiamo voluto quindi per identificare gli obiettivi di miR-146a nel carcinoma gastrico ed esaminare i suoi ruoli biologici.
Risultati
L'espressione del miR-146a è stata valutata mediante PCR quantitativa (qPCR) ed ha trovato up-regolati nei topi knockout gastrina , un modello murino di cancro gastrico, e nel 73% degli adenocarcinomi gastrici umani indagati. L'espressione di miR-146a da parte delle cellule di cancro gastrico è stato confermato da in situ
ibridazione. Analisi globale dei cambiamenti nei livelli di mRNA dopo miR-146a trasfezione identificato due trascrizioni, caspasi reclutamento dominio contenenti la proteina 10 (CARD10) e COP9 signalosoma complesso subunità 8 (COPS8), come nuovi bersagli miR-146 bis. qPCR, Western blotting saggi e luciferasi confermato queste trascrizioni come bersagli diretti miR-146 bis. CARD10 e COPS8 hanno dimostrato di essere parte del percorso del recettore accoppiato alla proteina G (GPCR) dell'attivazione fattore nucleare-kB (NF-kB). L'acido lysophosphatidic (LPA) induce l'attivazione di NF-kB tramite
questo percorso e sovra-espressione di miR-146a inibito LPA indotta attivazione di NF-kB, ridotta espressione LPA-indotta di citochine tumore-promozione e fattori di crescita e inibito attrazione monociti .
Conclusioni
espressione miR-146a è up-regolato nella maggior parte dei tumori gastrici in cui esso si rivolge CARD10 e COPS8, inibendo l'attivazione GPCR-mediata di NF-kB, riducendo in tal modo l'espressione di NF-kB-tumore-regolato promuovere citochine e fattori di crescita. Prendendo di mira i componenti di diverse vie di NF-kB-attivanti, miR-146a è un componente chiave nella regolazione dell'attività di NF-kB.
Parole
Il cancro dello stomaco non codificante RNA citochine Sfondo
cancro gastrico è globale la seconda causa più comune di morte per cancro [1]. Lo sviluppo di cancro gastrico è influenzata dalle interazioni tra ospite, ambientali e fattori batterici. Esempi di fattori di rischio per il cancro gastrico sinergici sono polimorfismi nei geni coinvolti nella risposta infiammatoria host [2], Helicobacter pylori
(H. pylori
) fattori di virulenza [3] e le diete ricche di sale e nitrato [4] . Nonostante i recenti progressi nella diagnosi e nel trattamento del cancro gastrico precoce, il tasso di sopravvivenza a lungo termine per il cancro gastrico avanzato è basso [5]. Le principali sfide nel trattamento del carcinoma gastrico avanzato sono linfatici, peritoneali o distanti metastasi organo, che prevedono contemporaneamente prognosi sfavorevole per questi pazienti [6].
Anche se molti oncogeni e soppressori tumorali sono stati segnalati per essere coinvolti nello sviluppo di carcinomi gastrici , i meccanismi molecolari alla base delle metastasi dei carcinomi gastrici avanzati sono ancora poco conosciuti [7]. Uno degli eventi chiave nella carcinogenesi gastrica è l'infiammazione. L'infiammazione porta all'attivazione del fattore di trascrizione fattore-kB (NF-kB) nucleare, che è associato con carcinogenesi gastrica [8, 9].
MicroRNA (miRNA) sono coinvolti nello sviluppo e nella progressione del cancro gastrico [10- 13]. miRNA è una classe di endogena, non codifica, molecole di RNA a singolo filamento di app. 22 nucleotidi che mediano regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica attraverso l'accoppiamento di base con la regione 3 'non tradotta (UTR) dell'RNA bersaglio messaggero (mRNA) [14]. miRNA sono coinvolti nella regolazione della maggior parte dei processi cellulari tra cui la proliferazione cellulare, la migrazione, la differenziazione e l'apoptosi [10, 14, 15]. miRNA sono espressi in modo aberrante maggior parte dei tumori umani e, come geni codificanti proteine, miRNA può funzionare sia come soppressori tumorali o oncogeni, regolando così la carcinogenesi [10, 12]. miRNA-146A (miR-146a) è regolata da NF-kB e inibisce il recettore dell'interleuchina-1 (IL-1R) e recettore Toll-like (TLR) - attivazione indotta di NF-kB di mira recettore dell'interleuchina-1 associata chinasi 1 (IRAK1) e TNF recettore del fattore associato 6 (TRAF6) [16-18]. miR-146a stato segnalato aberrante espresso in diverse malattie infiammatorie e tumori, ma il ruolo di miR-146a nel carcinoma gastrico è ancora controverso, in quanto espressione di miR-146a è stato trovato a monte ea down-regolato qui [19-24 ]. Pertanto, abbiamo studiato l'espressione di miR-146a nel cancro gastrico e caratterizzato i suoi obiettivi e le funzioni molecolari per chiarire i risultati contraddittori.
Abbiamo scoperto che miR-146a è up-regolato in un modello murino di cancro gastrico, così come in adenocarcinoma gastrico umano e CARD10 identificato e COPS8 come nuovi bersagli diretti di miR-146a. Entrambi fanno parte del recettore accoppiato alla proteina G (GPCR) trasduzione del segnale mediata che media attivazione di NF-kB. Ciò suggerisce che miR-146a agisce soppressione del tumore inibendo GPCR mediata attivazione di NF-kB e l'espressione risultante di citochine tumore-promozione e fattori di crescita.
Risultati
espressione del miR-146a è up-regolato in un mouse modello del cancro gastrico e in umani adenocarcinomi gastrici
gastrina topi knockout (KO) sono achlorhydric e sviluppare metaplasia intestinale e adenomi gastrici nel corso del tempo [25]. Usando PCR quantitativa (qPCR) abbiamo trovato l'espressione del miR-146a app. 2 volte up-regolati nella vecchia gastrina topi KO sia con metaplasia intestinale fundica o adenoma antrale rispetto alla espressione in wild type (WT) topi (P < 0,05) (Figura 1A). Usando in situ ibridazione
miR-146a è stata rilevata nel tessuto gastrico metaplastica dai topi KO gastrina, ma non nel tessuto gastrico normale dai topi WT (Figura 2AB) (file1 aggiuntive: Figura S1). Dopo aver stabilito che miR-146a è aumentata nel nostro modello murino di cancro gastrico abbiamo esaminato l'espressione del miR-146a in appaiati adenocarcinomi gastriche umane e biopsie di controllo adiacenti e ha scoperto che era up-regolata in 27 su 37 casi (73%) ( Figura 1B). In situ ibridazione
ha dimostrato che miR-146a è stata espressa dalle cellule di adenocarcinoma gastrico umani, mentre le cellule miR-146a-positivi non sono stati rilevati nel normale mucosa gastrica (Figura 2CD) (file1 aggiuntive: Figura S1). Figura 1 aumentata espressione di miR-146a nella KO topo modello di cancro gastrico gastrina e cancro gastrico umano. (A) L'espressione relativa miR-146a nel tessuto fundica metaplastica (n = 8) e la mucosa antrale iperplastiche (n = 4) /adenomi antrali (n = 4) da gastrina knockout (KO) topi rispetto all'espressione media in corrispondenza wild-type (WT) di tessuto del mouse. * = P < 0.05. plot (B) Cascata del espressione di miR-146a in 37 adenocarcinoma gastrico umani relativi alla espressione nel tessuto normale adiacente. miR-146a è stato up-regolata in 27 su 37 tumori (73%). I livelli di espressione di miR-146a sono state determinate mediante qPCR e normalizzata a quelle del RNU44 controllo endogeno.
Figura 2 In rilevazione ibridazione in situ di espressione miR-146a nel modello di cancro gastrico gastrina KO mouse e cancro gastrico umano. (A) L'espressione di miR-146a non è stato rilevato nel WT tessuto del mouse fundica, (B) mentre le cellule (nuclei blu) miR-146a-positivi sono stati rilevati nel tessuto fundica metaplastica da topi KO gastrina. (C) Nessun segnale è stato rilevato con la sonda LNA strapazzate. (D) espressione miR-146a era assente nel tessuto gastrico umano normale, (E) ma presenti in cellule di adenocarcinoma gastrico umane (nuclei blu). (F) Controllo negativo utilizzando una sonda LNA strapazzate. mir-146 bis-positivo cellule rappresentativi sono indicati da frecce. x20 originale ingrandimento, Barra di scala = 100 micron.
Non c'era alcuna correlazione tra l'espressione di miR-146a in adenocarcinomi gastrici e pazienti 'età, il sesso e la localizzazione o la classificazione dei tumori (dati non riportati). Anche se i pazienti con elevata espressione di miR-146a sembrava avere una migliore sopravvivenza generale questo non è stato significativo. (File1 aggiuntive: Figura S2)
obiettivi miR-146 bis membri del pathway di NF-kB GPCR-mediata
Dopo aver dimostrato aumentata espressione di miR-146a nella maggior parte dei tumori gastrici, abbiamo voluto stabilire le azioni biologiche di miR-146a caratterizzando i suoi bersagli molecolari dirette a cancro gastrico umano. Abbiamo voluto fare questo da un eccesso di espressione di miR-146a in cellule di cancro gastrico e quindi identificare mRNA con l'espressione ridotta [26]. Pertanto, abbiamo esaminato l'espressione miR-146a in un pannello di linee cellulari e abbiamo trovato varia, ma sorprendentemente bassa espressione di miR-146a in linee cellulari gastrici disponibili (file1 supplementare: Figura S3), considerando il rilevato sovraespressione nei tumori <. br> La linea di cellule di cancro gastrico umano SNU638, che ha livelli trascurabili di endogena miR-146a è stato trovato adatto per miR-146 bis studi over-espressione. Dal momento che l'espressione di miR-146a è stata molto bassa nelle linee di cellule gastriche testate studi di inibizione del miR-146 bis non sono stati condotti.
In primo luogo abbiamo testato se sovra-espressione di miR-146a influenzato la crescita delle cellule SNU638 ed è risultato influenzato la crescita delle cellule ( file1 aggiuntive: Figura S4). Successivamente, sono stati esaminati i cambiamenti globali di espressione genica in cellule SNU638 seguenti sovra-espressione di miR-146a. Dopo miR-146 bis mRNA trasfezione con predetti siti bersaglio miR-146 bis 3'UTR erano significativamente down-regolato rispetto al mRNA senza siti obiettivi previsti (P ​​< 4.6e-11, due code Wilcoxon rank-sum test) (Figura 3A) . Abbiamo analizzato tutte le parole di lunghezza 5-7 per eccessiva presenza di mRNA down-regolato dopo miR-146a trasfezione e abbiamo trovato la parola più forte correlato con down-regolazione è stato il sito seme complementare a maturare le basi miR-146 bis 2-7 /8 ( Figura 3B). Le trascrizioni con previsti 3'UTR siti bersaglio miR-146 bis che erano significativamente down-regolato su di miR-146a trasfezione sono stati considerati come potenziali bersagli diretti miR-146 bis. 847 abbinato questi criteri (file1 aggiuntive: Tabella S5). I primi 10 potenziali bersagli miR-146 bis più down-regolato sono mostrati in figura 3C. Come un controllo di convalida negativo abbiamo ripetuto la procedura di trattamento SNU638 cellule con un inibitore della LNA miR-146a. Non c'era alcun significativo up-regolazione dei geni con il sito seme complementare a maturare le basi miR-146 bis (dati non riportati). Figura 3 Identificazione di bersagli miR-146 bis. (A) Pronostici miR-146 bis trascrizioni target sono significativamente down-regolato dopo miR-146a trasfezione rispetto a geni espressi che non sono prevedibili gli obiettivi di miR-146a (P < 4.6e-11, a due code Wilcoxon rank-sum test) . (B) Top 10 parole più correlati con down-regulation (correlazione Z-score sono indicati a fianco di ogni parola, tutti i 10 parole hanno una cifra stimata di FDR < 1e-6). Le lettere maiuscole evidenziano la regione miRNA seme, Watson-Crick coppie di basi (blu), mismatch (rosso). La parola più forte correlato con down-regolazione è stato il sito seme complementare per maturare miRNA basi 2-7 /8. (C) trascrizioni, avendo 6mer o 7mer siti di semi miR-146 bis nel 3'UTR, che sono più down-regolato su di miR-146a trasfezione sono mostrati. Questi sono potenziali bersagli diretti miR-146 bis. L'espressione è dato in cambio log2 volte. I 3'UTR 6 m /7 m colonne indicano il numero di 6 o 7mer siti di semi miR-146 bis del 3'UTR.
I tre maggior parte dei geni down-regolato su miR-146a sovra-espressione, IRAK1, reclutamento caspasi dominio contenenti la proteina 10 (CARD10) e COP9 costitutiva omologo photomorphogenic subunità 8 (COPS8) (Figura 3C) appartengono tutti alla vie di segnalazione che portano alla attivazione di NF-kB [27-29]. IRAK1 è un noto destinazione miR-146a coinvolti in TLR- e l'attivazione di NF-kB [16-18] IL-1R-mediata. CARD10 è coinvolta nella attivazione GPCR-mediata di NF-kB [27], mentre COPS8 è pensato per essere coinvolti in questo percorso in base al suo coinvolgimento nel recettore delle cellule T (TCR) mediata NF-kB attivazione [28]. Sorprendentemente, ma simile ai risultati di Boldin et al.
[30], espressione di TRAF6, che è stato precedentemente descritto come un obiettivo miR-146a [16, 18, 31], non si è ridotto a livello trascrizionale dopo miR-146a sovra-espressione nel nostro modello di sistema.
nel cancro gastrico, NF-kB modula la sopravvivenza delle cellule, l'immunità e l'infiammazione, e l'attivazione di NF-kB è associata a prognosi sfavorevole nel carcinoma gastrico [32, 33]. Abbiamo quindi concentrati sulla caratterizzazione di CARD10 e COPS8 come bersagli miR-146 bis diretta e il loro ruolo nella attivazione di NF-kB nel cancro gastrico. Abbiamo confermato miR-146a-mediata down-regulation di CARD10, COPS8 e IRAK1 a livello di trascrizione (Figura 4A) e anche scoperto che miR-146a livelli di CARD10, COPS8 e proteine ​​IRAK1 (Figura 4B) ridotto. Infine, il targeting diretto del miR-146a per 3'UTRs dei geni bersaglio è stata dimostrata utilizzando saggi di luciferasi (Figura 4C). In sintesi, abbiamo confermato le osservazioni precedenti che dimostrano che miR-146a si rivolge direttamente IRAK1 e abbiamo inoltre identificato due nuovi obiettivi, CARD10 e COPS8, che codifica per le proteine ​​suggerito di essere coinvolti nella attivazione di NF-kB. COPS8 è un componente del signalosoma COP9 che consiste di otto subunità (GPS1 e COPS2-8) [34]. COPS8 è l'unico subunità di mira direttamente da miR-146, ma dal momento che l'alterazione della quantità delle singole subunità ha dimostrato di influenzare la quantità di altre subunità [35, 36], abbiamo esaminato come trasfezione con miR-146a influenzato espressione di tutto componenti COP9 signalosoma. In cellule non stimolate l'espressione di COPS2 è stata ridotta (20%) (file1 aggiuntive: Figura S5). Assumiamo pertanto che gli effetti di miR-146a sul complesso COP9 derivano principalmente da una riduzione dell'espressione COPS8, anche se la destabilizzazione indiretta del complesso può essere esclusa. Figura 4 CARD10 e COPS8 sono obiettivi diretti miR-146 bis. espressione (A) mRNA dei due nuovi obiettivi miR-146 bis, CARD10 e COPS8, e IRAK1, un obiettivo miR_146a nota, è stato determinato da qPCR nelle cellule SNU638 controllori e miR-146 bis transfettate. Espressione di ogni trascritto è mostrato rispetto alla espressione in cellule di controllo transfettate. CARD10, COPS8 e l'espressione IRAK1 è stato down-regolati dopo miR-146a sovra-espressione. I dati sono mostrati come media ± S.D. di quattro repliche biologiche. * = P < 0.05, ** = P < 0,01, *** = P < 0.001. (B) miR-146a trasfezione anche ridotto i livelli di proteine ​​di CARD10, COPS8 e IRAK1 nelle cellule SNU638 miR-146a-transfettate. L'espressione di ogni proteina è mostrato rispetto alla espressione in cellule di controllo transfettate. Le bande sono state quantificate relative al beta-actina. I dati sono mostrati come media ± S.D. di quattro repliche biologiche. * = P < 0.05, ** = P < 0,01, *** = P < 0.001. (C) Verifica dei destinatari diretti e funzionali vincolante utilizzando costrutti luciferasi in possesso di WT 3'UTRs e mutati 3'UTRs (Mut) (la centrale di 4 nucleotidi sono stati sostituiti in miR-146a sito di legame) per CARD10, COPS8 e IRAK1. Costrutti contenenti sia WT o 3'UTRs mutati (Mut) a valle per il gene della luciferasi di lucciola sono stati co-trasfettate in cellule HEK293 insieme con il plasmide di controllo luciferasi Renilla e sia miR-146a o di controllo (siglo). A sinistra, l'attività luciferasi è dato relativo all'attività in cellule di controllo transfettate. miR-146a ha ridotto l'attività della luciferasi di costrutti con WT CARD10, COPS8 e IRAK1 3'UTRs. A destra, allineamenti di sequenze di miR-146a e potenziale WT e siti di destinazione Mut 3'UTR sono mostrati, basi mutati sono mostrati in rosso. I dati sono mostrati come media ± S.D. repliche spesso biologici. *** = P < 0.001. allineamenti di sequenze sono adattati da DIANALab (2009).
miR-146a inibisce GPCR-mediata attività di NF-kB di mira CARD10 e COPS8
CARD10 e COPS8 sono coinvolti nella attivazione di NF-kB [28, 29 GPCR-mediata ]. Abbiamo quindi deciso di stabilire il loro ruolo nella trasduzione del segnale nel tumore gastrico e successivamente indagare l'importanza del miR-146a per inibire questa segnalazione. A questo scopo abbiamo utilizzato l'acido lysophosphatiditc (LPA), che è un attivatore noto della via NF-kB attivazione GPCR-mediata [29], e promuove la migrazione delle cellule cancro gastrico e l'invasione [37]. LPA-stiumlation aumentato in modo significativo l'attività di NF-kB nel nostro sistema reporter luciferasi (Figura 5). siRNA atterramento di CARD10 e di espressione COPS8 significativamente inibita attivazione GPCR-mediata LPA-stimolata di NF-kB in SNU638 cellule (Figura 5). Questa inibizione era paragonabile a l'inibizione miR-146a-indotta. Al contrario, l'inibizione endogena miR-146a è stata senza effetto sulla attivazione di NF-kB. Come previsto, siRNA-mediata repressione di espressione IRAK1 non ha influenzato attivazione LPA-stimolata di NF-kB (Figura 5) come IRAK1 non è coinvolta la via GPCR-mediata. Come TRAF6 è un obiettivo miR-146a con un ruolo nella attivazione di NF-kB, l'effetto di repressione siRNA-mediata di espressione TRAF6 su LPA-stimolata l'attività di NF-kB è stata studiata. Tuttavia, l'abbattimento di TRAF6 non ha inibito LPA-stimolata l'attività di NF-kB (Figura 5). Questi risultati indicano che i due bersagli miR-146 bis recentemente identificati, CARD10 e COPS8, sono coinvolti nella attivazione GPCR-mediata di NF-kB. Pertanto, l'effetto di miR-146a over-espressione LPA-stimolata l'attività di NF-kB è stata studiata. miR-146a significativamente inibito LPA-stimolata l'attività di NF-kB in SNU638 cellule (Figura 5). Un mix di siRNA contro CARD10, COPS8, IRAK1 e TRAF6 imitato l'inibizione del miR-146a-mediata di attività di NF-kB (Figura 5). Knockdown di altri due componenti COP9 (COPS2 e COPS5) anche inibito l'attività di NF-kB LPA-stimolato, dimostrando l'importanza della presenza di tutte le subunità COP9 signalosoma per l'attivazione LPA-stimolata di NF-kB. qPCR dell'espressione dei diversi componenti esaminati confermato il colpo (Figura 5). Figura 5 bersagli miR-146 bis COPS8 e l'attivazione di NF-kB CARD10 GPCR-mediata. cellule SNU638 sono state co-trasfettate con NF-kB giornalista plasmide e il controllo della luciferasi Renilla plasmide con il controllo (siglo), siRNA o miR-146a. Le cellule sono state stimolate con LPA 25 pM e attività della luciferasi è stata misurata. l'attività luciferasi è dato relativo all'attività di controllo transfettate cellule LPA-stimolate. siRNA contro CARD10 e COPS8, miR-146a, inibitore miR-146a e un mix siRNA ridotta attività della luciferasi. siRNA contro IRAK1 e TRAF6 non ha ridotto l'attività della luciferasi. attivazione di NF-kB LPA stimolata è stata inibita anche da siRNA contro COPS2 e COPS5, dimostrando che altro perturbazione del complesso COP9 signalosoma riduce GPCR-mediata attivazione di NF-kB. SIMIX, mix di siRNA contro CARD10, COPS8, IRAK1 e TRAF6. I dati sono mostrati come media ± S.D. di sette repliche biologiche * = P <.; 0.05. L'espressione relativa di TRAF6, COPS8, IRAK1, CARD10, COPS2 e COPS5 stata misurata utilizzando qPCR. Gray-ombreggiatura indica un cambiamento significativo nella espressione, p < 0.05, n = 4.
L'espressione del miR-146a è in parte controllato da NF-kB. Abbiamo quindi testato anche come l'espressione di miR-146a è stata colpita da LPA e la stimolazione di IL-1β. Abbiamo scoperto che il trattamento LPA raddoppiato l'espressione del miR-146a e la stimolazione IL-1β dato un aumento di 4 volte in espressione miR-146a, che è paragonabile a precedenti osservazioni [16, 38] (file1 aggiuntive: Figura S6). Anche se miR-146a LNA ha aumentato l'espressione di tre dei bersagli miR-146 bis (TRAF6, IRAK1 e CARD10) (Figura 5) l'attivazione complessiva di NF-kB non è stato alterato in LPA-stimolata LNA miR-146a trattata SNU638 cellule. miR-146a riduce LPA-indotta di citochine e fattori di crescita
Nella maggior parte dei carcinomi fattori microambientali piuttosto che alterazioni genetiche sono probabilmente responsabili per l'attivazione di segnalazione NF-kB che regola diversi processi tra cui la secrezione di fattori di crescita e citochine [39, 40]. Pertanto, abbiamo studiato come miR-146a modula l'espressione di fattori di crescita NF-kB regolamentati selezionati e citochine indotta da segnali extracellulari come la LPA. LPA-stimolazione significativamente aumentata espressione di interleuchina-6, -8, 23A (IL-6, IL-8, IL-23A) e chemochine (CC motivo) ligando 5 (CCL5), fattore stimolante le colonie 1 (macrofagi) (CSF- 1) e derivato dalle piastrine fattore di crescita beta polipeptide (PDGFB) in SNU638 cellule (Figura 6). Ciò ha confermato che l'espressione di questi geni è regolata da LPA indotta attività di NF-kB. Over-espressione di miR-146a significativamente diminuita espressione di IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 e PDGFB in SNU638 cellule (Figura 6). Anche se IL-6 è un gene bersaglio di NF-kB, e anche upregulated by LPA miR-146a sovraespressione non ha ridotto IL-6 espressione nelle nostre condizioni (Figura 6). Tuttavia, LPA induzione di IL-6 espressione non solo è mediata da NF-kB, ma anche attraverso altri percorsi (MAPK /ERK, PI3K /Akt, e P38) [41], che possono contribuire alle differenze. Nelle cellule SNU638 il livello basale di IL-6 è superiore a IL-8, che può influenzare il turnover dell'mRNA. Questo potrebbe essere una delle ragioni che miR-146a ha meno effetto sulla LPA-stimolata IL-6 espressione di IL-8 espressione, che è stato anche visto in altri sistemi cellulari [42]. Figura 6 miR-146a inibisce l'espressione di citochine LPA-indotta. 25 mM LPA è stato utilizzato per indurre l'espressione di citochine da cellule di carcinoma SNU638 gastriche umane. LPA significativamente aumentata espressione di IL-6, IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 e PDGFB, che è stata misurata utilizzando qPCR e mostrato rispetto al livello di espressione in cellule di controllo non trattate. Questa risposta è ridotta in cellule miR-146 bis transfettate. I dati sono mostrati come media ± S.D., n = 4, * = P < 0.05, ns = non significativo.
MiR-146a sovra-espressione in SNU638 cellule riduce il reclutamento dei monociti
in carcinomi monociti possono essere reclutati da esempio CCL5 e CSF-1 espressa dalle cellule tumorali e questo tumore infiltrazione di monociti contribuisce alla risposta infiammatoria di promozione dei tumori nel cancro [39, 40]. Dopo aver dimostrato che miR-146a ridotta espressione LPA-indotta di citochine, abbiamo esaminato come miR-146a sovra-espressione influenzato il reclutamento dei monociti. Abbiamo trovato che LPA-trattamento delle cellule SNU638 aumentata migrazione di monociti verso terreno condizionato dalle cellule SNU638 (Figura 7 e file1 aggiuntive: Figura S7), considerando trasfezione con miR-146a in parte abrogata questa risposta (Figura 7), dimostrando ancora che miR -146a inibisce le risposte biologiche di attivazione GPCR-mediata di NF-kB, quali, il reclutamento dei monociti. Figura 7 miR-146a riduce la migrazione dei monociti. la migrazione dei monociti contro mezzo condizionato dalle cellule SNU638 controllori o miR-146 bis transfettate che sono stati lasciati non trattati o stimolati con 25 mM LPA è stato seguito oltre 8 ore. La migrazione delle cellule è mostrato relativa alla migrazione di cellule di controllo non trattate. la migrazione dei monociti contro media dalle cellule SNU638 LPA-stimolate è stata aumentata rispetto alla migrazione contro media da cellule non trattate, mentre la migrazione dei monociti contro media da miR-146a-transfettate, cellule LPA-stimolate è ridotto rispetto alla media dal controllo-trasfettate, LPA-stimolato cellule. I dati sono mostrati come media ± S.D. di quattro repliche biologiche. ** = P < 0.01, ns = non significativo
. Discussione
fattori microambientali sono importanti per l'attivazione di NF-kB nei tumori infiammazione-driven come il cancro gastrico e questa attivazione di NF-kB può fornire le cellule tumorali con vantaggi, che contribuiscono alla tumorgenic processi [32, 43]. Modulazione di segnalazione NF-kB-attivazione è quindi importante per controllare lo sviluppo del tumore infiammazione mediata. Qui, dimostriamo che miR-146a è un regolatore negativo centrale di attivazione di NF-kB in quanto inibisce diverse vie di NF-kB-attivanti.
Espressione del miR-146a è stato trovato up-regolati in app. 2/3 degli adenocarcinomi gastrici umani nonché nella gastrina KO modello murino di cancro gastrico. Allo stesso modo, l'espressione di miR-146a è stato trovato aumentata nel collo dell'utero, della mammella, del pancreas e cancro alla tiroide [11, 44-46]. In precedenza, l'espressione di miR-146a è stato trovato a monte ea down-regolato in cancro gastrico [21-24]. Questi risultati contrastanti potrebbero riflettere differenze nei tumori e il loro microambiente con conseguente diversi gradi di attività di NF-kB, che controlla l'espressione di miR-146a [16]. Sorprendentemente, abbiamo trovato i bassi livelli di miR-146a in linee cellulari di cancro gastrico umano. Ciò potrebbe indicare che l'aumento dei livelli di miR-146 bis visto in tumori sono scorrevano da fattori microambientali ad esempio cellule che circondano le cellule tumorali.
Per esaminare gli effetti di aumento dei livelli di miR-146 bis nel carcinoma gastrico che abbiamo identificato due nuovi obiettivi miR-146 bis, CARD10 e COPS8, e hanno studiato il ruolo di questi obiettivi. Abbiamo scoperto che miR-146a inibito GPCR-mediata attivazione di NF-kB di mira direttamente ed espressione di CARD10 e COPS8 down-regolazione. CARD10 è noto per essere richiesto per l'attivazione GPCR indotta di NF-kB [27, 29], mentre COPS8 è una subunità di COP9 signalosoma che controlla NF-kB attivazione [28, 47]. Abbiamo dimostrato che CARD10 è coinvolta nella attivazione GPCR-mediata di NF-kB, e fornito nuove prove che COPS8 è coinvolto in questo percorso pure. miR-146a sovra-espressione anche portato alla ridotta espressione di COPS2, un'altra subunità del signalosoma COP9. Assumiamo che questo è un effetto indiretto, poiché non vi è alcuna miR-146a sito di legame in COPS2 3'UTR ed è stato dimostrato cambiamenti nell'espressione di una subunità di influenzare quello dell'altra [35, 36]. E 'quindi possibile che il miR-146a in una certa misura può agire, non solo mira COPS8 ma destabilizzare il signalosoma COP9.
Segnalazione aberrante attraverso GPCR è stato collegato alla crescita del tumore e la sopravvivenza cellulare, e GPCR NF-kB-attivanti sono stati dimostrato di contribuire ad una vasta gamma di tumori (rivisto da Dörsam & Gutkind [48]). GPCR possono attivare NF-kB tramite
il complesso CARD10 /Bcl10 /MALT1 dopo ligandi, come LPA, enothelin-1, angiotensina II (Ang II) e chemochine (motivo CXC) ligando 12 (CXCL12) (Figura 8) vincolante [ ,,,0],29, 49]. Nel nostro studio abbiamo usato LPA al modello di attivazione GPCR-mediata di NF-kB. LPA-indotta porta GPCR segnalazione alla progressione del tumore [49]. Quindi, l'inibizione del miR-146a-mediata GPCR-segnalazione potrebbe avere tumore sopprimere effetti. Figura 8 bersagli miR-146 bis molteplici vie di attivazione di NF-kB. Illustrazione schematica delle vie di NF-kB-attivanti. miR-146a è stato precedentemente dimostrato di indirizzare IRAK1 e TRAF6 e in questo studio dimostriamo che miR-146a obiettivi CARD10 e COPS8. bersagli miR-146 bis sono contrassegnati da cerchi rossi.
Oltre alla attivazione di NF-kB GPCR-mediata, NF-kB può essere attivata tramite
tumore necrosi fattore recettore (TNFR), IL-1R, TLR, recettore TCR e B cellule (BCR) [50] (Figura 8). In precedenza, miR-146a ha dimostrato di inibire l'attivazione di NF-kB tramite
questi recettori per l'espressione down-regolazione di TRAF6 e IRAK1 [16, 18, 30, 31]. miR-146a obiettivi IRAK1 in cellule di cancro gastrico, ma non TRAF6. Anche se, noi qui dimostriamo che miR-146a si rivolge attivazione GPCR-mediata di NF-kB, oltre alla attivazione via
TNFR, IL-1R, TLR, TCR e BCR, prendendo di mira CARD10 e COPS8 (Figura 8). Così, miR-146a si rivolge a più componenti di NF-kB-attivazione di percorsi in cellule di cancro gastrico. Questo non è stato mostrato per la NF-kB prima, ma è stato visto in precedenza nella crescita trasformante fattore-β (TGF-β) percorso, dove entrambi miR-21 e l'obiettivo del cluster miR-17-92 diversi mRNA codificante per proteine ​​nel percorso di TGF-β [51, 52]. Prendendo di mira più componenti di diversa NF-kB-attivazione Percorsi di miR-146a media un controllo robusto e complesso di attività di NF-kB. Diversi altri miRNA possono anche regolare la NF-kB-segnalazione, ma solo obiettivi miR-146 bis diversi geni in diverse vie di NF-kB-attivanti, suggerendo miR-146a come un modulatore chiave di attivazione di NF-kB.
NF-kB regola espressione di citochine e fattori di crescita coinvolti in diversi aspetti della progressione tumorale [43]. Dato che miR-146a diminuisce l'attività di NF-kB, è possibile che miR-146a agisce soppressione tumorale riducendo espressione di tali citochine e fattori di crescita. Infatti, abbiamo scoperto che miR-146a sovra-espressione espressione di diverse citochine e fattori di crescita, con un ruolo nello sviluppo del cancro conosciuta ridotto; IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 e PDGFB. Questi geni possono aumentare la proliferazione cellulare, l'adesione cellulare e l'angiogenesi [53-55], contribuire a linfoangiogenesi tumore [56], si attivano i fibroblasti [57], reclutare monociti ai tumori [39, 40] e indurre i macrofagi associati al tumore (TAMs) a secernere mediatori tumorali di promozione [58] (figura 9). Figura 9 processi biologici in cellule di cancro gastrico inibito da miR-146a. pannello di sinistra, miR-146a si rivolge direttamente IRAK1, CARD10 e COPS8 in SNU638 cellule. Questo porta alla inibizione della NF-kB e di conseguenza per l'espressione delle citochine repressa NF-kB-regolati e fattori di crescita. L'espressione di miR-146a è regolata anche da NF-kB [16]. Pannello destro, miR-146a diminuisce espressione di CCL5, CSF-1, IL-8, PDGF e IL-23A, che sono coinvolti nella migrazione dei monociti e la differenziazione, la proliferazione, l'angiogenesi, linfoangiogenesi e fibroblasti e la crescita dei macrofagi rilascio fattore. Così, miR-146a potrebbe agire come un soppressore del tumore, riducendo gli effetti del cancro-promozione di attività di NF-kB.
Citochine chemiotattici rilasciate dalle cellule tumorali possono reclutare monociti a siti tumorali [39, 59]. Questi monociti possono promuovere la progressione del tumore [60]. CCL5 e CSF-1 sono esempi di citochine monociti-reclutamento rilasciati dalle cellule tumorali [39, 40]. Come previsto, i monociti migrati meno contro mezzo condizionato dalle cellule SNU638 LPA-stimolati over-esprimono miR-146a rispetto alle cellule di controllo LPA-stimolati. Figura S2. Figura S3. Figura S4. Figura S5. Figura S6. 0.05. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

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• metastasi intraneurale di carcinoma gastrico porta a nervo sciatico palsy