microRNA-146a inibe G activação acoplado a proteína mediada pelo receptor de NF-kB, visando CARD10 e COPS8 em gástrica cancer

microRNA-146a inibe G activação acoplado a proteína mediada pelo receptor de NF-kB, visando CARD10 e COPS8 no câncer gástrico
Abstract
Fundo
o câncer gástrico é a segunda causa mais comum de morte por câncer no mundo. sinais inflamatórios provenientes de células de câncer gástrico são importantes para o recrutamento de células inflamatórias e de regulação da metástase do câncer gástrico. Vários microARNs (miARN) foram mostrados para ser envolvido no desenvolvimento e progressão do cancro gástrico. miRNA-146a (miR-146a) é um modulador de sinais inflamatórios, mas pouco se sabe sobre a sua importância no câncer gástrico. Por isso, queríamos identificar alvos de miR-146a no câncer gástrico e examinar seus papéis biológicos.
Resultados
A expressão de miR-146a foi avaliada por PCR quantitativa (qPCR) e encontrou-regulada nos camundongos knockout gastrina , um modelo do rato do cancro gástrico, e em 73% dos adenocarcinomas gástricos humanos investigados. Expressão de miR-146a por células de cancro gástrico foi confirmada por hibridação in situ
. análise global das alterações nos níveis de mRNA após a transfecção miR-146a identificou duas transcrições, recrutamento caspase proteína contendo o domínio 10 (CARD10) e COP9 signalosome complexo subunidade 8 (COPS8), como novos alvos miR-146a. qPCR, ensaios de mancha e luciferase ocidentais confirmaram estas transcrições como alvos diretos miR-146a. CARD10 COPS8 e mostraram-se parte da via de receptor acoplado a proteína G (GPCR) de activação de factor nuclear-kappaB (NF-kappaB). ácido lisofosfatídico (LPA) induz a activação de NF-kappaB
através desta via e a sobre-expressão de miR-146a inibida induzida pelo LPA da activação de NF-kappaB, reduzida expressão induzida pelo LPA de citocinas promotoras de tumores e factores de crescimento e inibido atracção de monócitos .
Conclusões
expressão de miR-146a é sobre-regulada na maioria dos cancros gástricos, onde ele atinge CARD10 e COPS8, inibição da activação mediada por GPCR de NF-kappaB, reduzindo, assim, a expressão de NF-kappaB-tumor-regulada promover citocinas e factores de crescimento. Ao direcionar componentes de várias vias NF-kappaB-activação, miR-146a é um componente chave na regulação da atividade de NF-kappaB.
Palavras-chave
do cancro de estômago não-codificante fundo RNA citocinas
câncer gástrico é globalmente a segunda causa mais comum de morte relacionada ao câncer [1]. Desenvolvimento de câncer gástrico é influenciada por interações entre hospedeiro, fatores ambientais e bacterianas. Exemplos de fatores de risco para o câncer gástrico sinérgicos são polimorfismos em genes envolvidos na resposta inflamatória do hospedeiro [2], Helicobacter pylori
(H. pylori
) fatores de virulência [3] e as dietas ricas em sal e nitrato [4] . Apesar dos recentes progressos na detecção e tratamento do câncer gástrico precoce, a taxa de sobrevivência a longo prazo para o cancro gástrico avançado é baixa [5]. Os principais desafios para o tratamento do cancro gástrico avançado são metástases de órgãos linfáticos, peritoneal ou distantes, que prevêem, simultaneamente mau resultado para esses pacientes [6].
Embora muitos oncogenes e supressores de tumor foram relatados para ser envolvido no desenvolvimento de carcinomas gástricos , os mecanismos moleculares subjacentes metástases de carcinomas gástricos avançados ainda são pouco compreendidas [7]. Um dos eventos-chave na carcinogênese gástrica é a inflamação. Inflamação conduz à activação do factor de transcrição nuclear factor kappaB (NF-kB), que está associada com carcinogénese gástrica [8, 9].
MicroARNs (miARN) estão envolvidas no desenvolvimento e progressão do cancro gástrico [10- 13]. miRNA é uma classe de endógeno, não codificante, as moléculas de RNA de fita simples de aplicação. 22 nucleótidos que medeiam a regulação pós-transcricional da expressão génica através de emparelhamento de bases com a região 3 'não traduzida (UTR) do ARN alvo mensageiro (ARNm) [14]. miARNs estão envolvidos na regulação da maioria dos processos celulares, incluindo a proliferação celular, a migração, a diferenciação e a apoptose [10, 14, 15]. miARNs são expressas de forma aberrante na maioria dos cancros humanos e, como os genes que codificam proteínas, miARN pode funcionar como supressores de tumores ou oncogenes, regulando assim a carcinogénese [10, 12]. miARN-146a (miR-146a) é regulada por NF-kB e inibe o receptor da interleucina-1 (IL-1R) e Toll-like receptor (TLR) - activação induzida de NF-kB por direccionamento interleucina-1 de cinase associada ao receptor um (IRAK1) e receptor de TNF associado factor de 6 (TRAF6) [16-18]. miR-146a foi reportado expressas de forma aberrante em diversas doenças inflamatórias e cancros, mas o papel do miR-146a no cancro gástrico é ainda controversa, como a expressão de miR-146a foi encontrado tanto para cima e para baixo-regulado aqui [19-24 ]. Por isso, foi investigada a expressão de miR-146a no cancro gástrico e caracterizados os seus objectivos e funções moleculares para clarificar os resultados contraditórios.
Descobrimos que o miR-146a é regulado para cima num modelo de ratinho de cancro gástrico, bem como em adenocarcinomas gástricos humanos e CARD10 identificados e COPS8 como novos alvos diretos de miR-146a. Ambos fazem parte da transdução de sinal mediada por receptores acoplados a proteína G (GPCR) que medeiam a activação de NF-kB. Isto sugere que o miR-146a actua supressores de tumores por inibição da activação mediada por GPCR de NF-kB e a expressão resultante de citocinas promotoras de tumores e factores de crescimento. Os resultados

expressão de miR-146a é regulado para cima num murganho modelo de câncer gástrico e em adenocarcinomas gástricos humanos
gastrina knockout camundongos (KO) são achlorhydric e desenvolver metaplasia intestinal e adenomas gástricas ao longo do tempo [25]. Usando PCR quantitativo (qPCR) encontramos a expressão de app miR-146a. 2 vezes sobre-regulada em idade gastrina ratinhos KO com qualquer metaplasia intestinal fúndica ou adenoma antral em comparação com a expressão no tipo selvagem (WT) murganhos (P < 0,05) (Figura 1A). Usando hibridação in situ
miR-146a foi detectada em tecido gástrico metaplásico dos ratinhos KO gastrina, mas não no tecido normal a partir de gástrica os ratinhos WT (Figura 2AB) (FILE1 adicionais: Figura S1). Tendo estabelecido que miR-146a é aumentada em nosso modelo de rato com câncer gástrico examinamos expressão de miR-146a em adenocarcinomas gástricos humanos emparelhados e biópsias de controle adjacentes e descobriu que ele foi regulada em 27 dos 37 casos (73%) ( A Figura 1B). In situ
hibridação mostraram que o miR-146a foi expressa pelas células de adenocarcinoma gástrico humano, enquanto as células de miR-146a-positivos não foram detectados na mucosa gástrica normal (Figura 2CD) (arq1 adicionais: Figura S1). Figura 1 O aumento da expressão de miR-146a no ratinho KO modelo de cancro gástrico e cancro gástrico gastrina humana. (A) A expressão relativa de miR-146a no tecido fúndica metaplásico (n = 8) e da mucosa antral hiperplásico (n = 4) /adenomas antrais (n = 4) a partir de nocaute gastrina (KO) em comparação com a expressão média em correspondência tipo selvagem (WT) do tecido mouse. * = P < 0,05. parcela (B) Cascata da expressão de miR-146a em 37 adenocarcinomas gástricos humanos em relação à expressão no tecido normal adjacente. miR-146a foi regulado para cima em 27 dos 37 tumores (73%). Os níveis de expressão de miR-146a foram determinados por qPCR e normalizadas para as de controle do RNU44 endógena.
Figura 2 Na detecção de hibridação in situ da expressão de miR-146a no modelo de cancro gástrico gastrina KO rato e cancro gástrico humano. (A) Expressão de miR-146a não foi detectada em tecidos de rato WT fúndica, (B), enquanto as células (núcleos azuis) miR-146a-positivas foram detectadas no tecido fúndica metaplásico de gastrina ratinhos KO. (C) Nenhum sinal foi detectado com a sonda LNA mexidos. (D) Expressão de miR-146a estava ausente no tecido gástrico humano normal, (E), mas presentes em células de adenocarcinoma gástrico humano (núcleos azuis). (F) controlo negativo utilizando uma sonda LNA mexidos. células representativos miR-146 A-positivos estão indicados por setas. x20 Original ampliação, Barra de escala = 100 mm.
Não houve correlação entre a expressão de miR-146a em adenocarcinomas gástricos e pacientes 'idade, sexo e localização ou classificação dos tumores (dados não mostrados). Embora os pacientes com alta expressão de miR-146a parecia ter uma melhor sobrevida global não foi significativa. (File1 adicionais: Figura S2)
alvos miR-146a membros da via de ativação de NF-kB GPCR mediada
Tendo demonstrado aumento da expressão de miR-146a na maioria dos cancros gástricos, queríamos estabelecer as acções biológicas de miR-146a por caracterizar seus alvos moleculares diretos no cancro gástrico humano. Nós queríamos fazer isso por sobre-expressão de miR-146a em células cancerosas gástricas e, em seguida, identificar mRNAs com expressão reduzida [26]. Portanto, examinámos a expressão de miR-146a num painel de linhas celulares e encontrou expressão variada, mas surpreendentemente baixo de miR-146a nas linhas de células gástricas disponíveis (arq1 adicionais: Figura S3), considerando o detectado sobre-expressão em tumores <. br> A linha gástrica humana célula cancerosa SNU638, que tem níveis negligenciável de endógena miR-146a foi encontrado adequado para miR-146a sobre-expressão estudos. Uma vez que a expressão de miR-146a foi muito baixo nas linhas celulares testadas gástrica não foram conduzidos estudos de inibição de miR-146a.
O primeiro testado se a sobre-expressão de miR-146a afectou o crescimento das células SNU638 e encontrou o crescimento celular afectada ( file1 adicionais: Figura S4). Subsequentemente, foram examinadas as alterações globais na expressão de genes em células SNU638 seguintes sobre-expressão de miR-146a. Depois de miR-146a mRNAs de transfecção com locais-alvo miR-146a 3'UTR previstos foram significativamente regulada para baixo em comparação com mRNAs sem sites de metas previstas (P < 4.6e-11, de duas caudas Wilcoxon teste de soma classificação) (Figura 3A) . Foram analisadas todas as palavras de comprimento 5-7 para sobre-representação em mRNAs regulada para baixo após a transfecção miR-146a e encontrou a palavra mais forte correlação com a regulação negativa foi o local de sementes complementar para amadurecer bases miR-146a 2-7 /8 ( A Figura 3B). Transcrições com sites de destino previstos 3'UTR miR-146a que foram significativamente regulada mediante transfecção miR-146a foram considerados como potenciais alvos diretos miR-146a. 847 combinado desses critérios (FILE1 adicional: Tabela S5). Os 10 melhores alvos de miR-146a potenciais mais regulada para baixo são mostrados na Figura 3C. Como um controle de validação negativa que repetiu o procedimento de tratamento SNU638 células com um inibidor da LNA miR-146a. Não houve significativa sobre-regulação de genes com o local complementar à semente madura bases de miR-146a (dados não mostrados). Figura 3 Identificação de alvos de miR-146a. (A) Previsto miR-146a transcritos alvo são significativamente regulada para baixo após a transfecção miR-146a, em comparação com os genes expressos que não estão previstos alvos de miR-146a (P < 4.6e-11, bicaudal teste de Wilcoxon rank-sum) . (B) As 10 palavras mais correlacionada com a regulação negativa (de correlação Z-scores são indicados à esquerda de cada palavra, todas as 10 palavras têm um FDR estimada < 1e-6). letras maiúsculas destacar região miRNA semente, Watson-Crick pares de bases (azul), descasamentos (vermelho). A palavra mais forte correlação com a regulação negativa foi o local de sementes complementar para amadurecer bases miRNA 2-7 /8. (C) Das transcrições, tendo 6mer ou 7mer locais de sementes miR-146a no 3'UTR, que são mais regulada mediante transfecção miR-146a são mostrados. Estes são potenciais alvos directos miR-146a. Expressão é dada na mudança log2 dobra. Os 3'UTR 6 m /7 m colunas indicam o número de 6 ou 7mer locais de sementes miR-146a no 3'UTR.
Os três a maioria dos genes regulados negativamente sobre miR-146a sobre-expressão, IRAK1, recrutamento caspase proteína contendo o domínio 10 (CARD10) e COP9 constitutiva homólogo fotomorfogênicas subunidade 8 (COPS8) (Figura 3C) pertencem todos as vias de sinalização que conduzem à activação de NF-kB [27-29]. IRAK1 é um alvo de miR-146a conhecidos envolvidos em TLR- e activação de NF-kB [16-18] IL-1R-mediada. CARD10 está envolvido na activação de GPCR-mediada de NF-kB [27], enquanto COPS8 é pensado para ser envolvido neste percurso com base no seu envolvimento no receptor de células T (TCR) mediada por activação de NF-kB [28]. Surpreendentemente, mas semelhante às descobertas de Boldin et al.
[30], expressão de TRAF6, o qual foi previamente descrito como um alvo de miR-146a [16, 18, 31], não foi reduzida ao nível da transcrição, depois miR-146a sobre-expressão em nosso modelo de sistema. Online em câncer gástrico, NF-kB modula a sobrevivência da célula, a imunidade e inflamação e ativação de NF-kB está associada com mau prognóstico no câncer gástrico [32, 33]. Nós, portanto, focada em caracterizando CARD10 e COPS8 como alvos miR-146a direta e seus papéis na ativação de NF-kB no câncer gástrico. Confirmou-se o miR-146a mediada por sub-regulação de CARD10, COPS8 e IRAK1 no nível transcrito (Figura 4A) e também descobriram que o miR-146a níveis reduzidos de CARD10, COPS8 e proteína IRAK1 (Figura 4B). Finalmente, direccionamento directo de miR-146a para 3'UTRs dos genes alvo foi demonstrada utilizando ensaios de luciferase (Figura 4C). Em resumo, nós confirmou as observações anteriores que mostram que miR-146a atinge diretamente IRAK1 e além disso, identificados dois novos alvos, CARD10 e COPS8, que codifica para proteínas sugeridas para ser envolvido na activação de NF-kB. COPS8 é um componente do signalosome COP9 que consiste de oito subunidades (GPS1 e COPS2-8) [34]. COPS8 é a única subunidade alvo diretamente pelo miR-146, mas desde que a alteração no valor das subunidades individuais foi mostrado para afetar a quantidade de outras subunidades [35, 36], examinamos como transfecção com miR-146a afetados expressão de tudo componentes COP9 signalosome. Em células não estimuladas a expressão de COPS2 foi reduzido (20%) (arq1 adicionais: Figura S5). Nós portanto supor que os efeitos de miR-146a no complexo COP9 resultam principalmente de uma redução na expressão COPS8, embora desestabilização indirecta do complexo não pode ser excluída. Figura 4 CARD10 e COPS8 são alvos directos miR-146a. expressão (A) de ARNm dos dois novos alvos de miR-146a, e CARD10 COPS8, e IRAK1, um alvo miR_146a conhecido, foi determinada por qPCR em SNU638 células controlo ou de miR-146 A-transfectadas. A expressão de cada transcrito é mostrado em relação com a expressão em células transf ectadas com o controlo. CARD10, COPS8 e expressão IRAK1 foi regulada para baixo seguinte miR-146a sobre-expressão. Os dados são apresentados como média ± S.D. de quatro réplicas biológicas. * = P < 0,05, ** = P < 0,01, *** = P < 0,001. (B) o miR-146a transfecção também reduziu os níveis de proteína de CARD10, COPS8 e IRAK1 em células SNU638 miR-146a-transfectadas. A expressão de cada proteína é mostrado em relação com a expressão em células transf ectadas com o controlo. Bandas foram quantificados em relação a p-actina. Os dados são apresentados como média ± S.D. de quatro réplicas biológicas. * = P < 0,05, ** = P < 0,01, *** = P < 0,001. (C) Verificação de alvo direto e funcional de ligação usando construções de luciferase segurando WT 3'UTRs e mutantes 3'UTRs (Mut) (a 4 nucleótidos centrais foram substituídos no sítio de ligação de miR-146a) para CARD10, COPS8 e IRAK1. Construtos contendo ou mutadas (Mut) 3'UTRs a jusante do gene da luciferase do pirilampo ou WT foram co-transfectados em células HEK293 em conjunto com o plasmídeo de controlo de Renilla luciferase e quer o miR-146a ou controlo (século). À esquerda, a actividade da luciferase é dada em relação à actividade em células transfectadas de controle. miR-146a redução da atividade luciferase de construções com WT CARD10, COPS8 e IRAK1 3'UTRs. Certo, alinhamentos de sequência de miR-146a e potencial de WT e sites de destino Mut 3'UTR são mostrados, bases mutadas são mostrados em vermelho. Os dados são apresentados como média ± S.D. réplicas biológicas frequentemente. *** = P < 0,001. Os alinhamentos de sequências são adaptados a partir DIANALab (2009).
miR-146a inibe GPCR mediada atividade NF-kB, visando CARD10 e COPS8
CARD10 e COPS8 estão envolvidos na activação de NF-kB [28, 29 GPCR mediada ]. Por conseguinte, desejado para estabelecer o seu papel na transdução de sinal em cancro gástrico e subsequentemente investigar a importância de miR-146a para inibir a esta sinalização. Para este propósito utilizou-se ácido lysophosphatiditc (LPA), que é um activador conhecido da via de NF-kB-activação de GPCR mediada [29], e promove a migração de células de cancro gástrico e invasão [37]. LPA-stiumlation aumentou significativamente a actividade de NF-kB em nosso sistema repórter luciferase (Figura 5). siRNA knockdown de CARD10 e expressão COPS8 inibiu significativamente a activação mediada por GPCR LPA-estimulada de NF-kB em SNU638 células (Figura 5). Esta inibição foi comparável à inibição de miR-induzido-146a. Em contraste, a inibição endógena de miR-146a foi sem efeito na activação do NF-kB. Como previsto, siRNA mediada por repressão da expressão IRAK1 não afectou activação de LPA-estimulada de NF-kB (Figura 5) como IRAK1 não está envolvida a via mediada por GPCR. Como TRAF6 é um alvo de miR-146a com um papel na activação do NF-kB, foi investigado o efeito de repressão mediada por siARN da expressão TRAF6 em LPA-estimulou a actividade de NF-kB. No entanto, knockdown de TRAF6 não inibiu a LPA-estimulou a actividade de NF-kB (Figura 5). Estes resultados indicam que os dois alvos de miR-146a recentemente identificados, e CARD10 COPS8, estão envolvidos na activação de GPCR-mediada de NF-kB. Portanto, foi estudado o efeito de miR-146a sobre-expressão de LPA-estimulou a actividade de NF-kB. miR-146a inibe significativamente LPA-estimulou a actividade de NF-kB em SNU638 células (Figura 5). Uma mistura de ARNsi contra CARD10, COPS8, IRAK1 e TRAF6 imitou a inibição de miR-146a-mediada de actividade de NF-kB (Figura 5). Knockdown de dois outros componentes (COP9 COPS2 e COPS5) também inibiram a actividade de NF-kB LPA-estimulada, demonstrando a importância da presença de todas as subunidades COP9 signalosome para a activação de LPA-estimulada de NF-kB. qPCR da expressão dos diferentes componentes examinados confirmou o knockdown (Figura 5). Figura 5 alvos de miR-146a e COPS8 CARD10 GPCR mediada por activação de NF-kB. SNU638 células foram co-transfectadas com NF-kB plasmídeo repórter e o plasmídeo de luciferase de Renilla controlo junto com o controle (século), siRNA ou miR-146a. As células foram estimuladas com LPA 25 ^ M e a actividade da luciferase foi medida. A actividade de luciferase é dada em relação à actividade em células de controlo transfectadas LPA-estimuladas. siRNA contra CARD10 e COPS8, miR-146a, inibidor de miR-146a e uma atividade de luciferase mistura siRNA reduzida. siRNA contra IRAK1 e TRAF6 não reduziu a actividade da luciferase. LPA-estimulada da activação de NF-kB foi também inibida por ARNsi contra COPS2 e COPS5, demonstrando que a outra perturbação do complexo COP9 signalosome reduz GPCR mediada por activação de NF-kB. siMix, mistura de siRNAs contra CARD10, COPS8, IRAK1 e TRAF6. Os dados são apresentados como a média ± S.D. de sete repetições biológicas * = P <.; 0,05. A expressão relativa de TRAF6, COPS8, IRAK1, CARD10, COPS2 e COPS5 foi medida utilizando qPCR. Cinzento-sombreamento indica uma mudança significativa na expressão, p < 0,05, n = 4.
A expressão de miR-146a é em parte controlada pela NF-kB. Estamos, portanto, também testaram como a expressão de miR-146a foi afetada pela LPA e estimulação IL-1β. Descobrimos que o tratamento com o LPA duplicou a expressão de miR-146a e estimulação de IL-1β deu um aumento de 4 vezes na expressão de miR-146a, que é comparável às observações anteriores [16, 38] (arq1 adicionais: Figura S6). Embora o miR-146a LNA aumentou a expressão de três dos alvos de miR-146a (TRAF6, IRAK1 e CARD10) (Figura 5) a activação global de NF-kB não foi alterada em LPA-estimuladas LNA miR-146a tratada SNU638 células. miR-146a reduz induzida pelo LPA de citocinas e factores de crescimento
Na maioria dos carcinomas factores micro-ambientais, em vez de alterações genéticas são, provavelmente, responsável pela activação do NF-kB de sinalização que regula vários processos, incluindo a secreção de factores de crescimento e citoquinas [39, 40]. Por conseguinte, foram investigados como miR-146a modula a expressão de factores de crescimento de NF-kB-regulados seleccionados e citocinas induzidas por sinais extracelulares tais como LPA. LPA-estimulação aumentou significativamente a expressão de interleucina-6, -8, 23A (IL-6, IL-8, IL-23A) e quimioquina (motivo CC) ligando 5 (CCL5), factor estimulador de colónias 1 (macrófagos) (CSF- 1) e derivado de plaquetas de crescimento polipeptídeo factor beta (PDGFB) em SNU638 células (Figura 6). Isto confirmou que a expressão destes genes é regulada por actividade induzida pelo LPA de NF-kB. A sobre-expressão de miR-146a diminuíram significativamente a expressão de IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 e PDGFB em SNU638 células (Figura 6). Mesmo que a IL-6 é um gene alvo de NF-kB, e também sobre-regulada por LPA miR-146a sobre-expressão não reduziu a expressão de IL-6 sob as nossas condições (Figura 6). No entanto, a indução de LPA da IL-6 de expressão não só é mediado por NF-kB, mas também através de outras vias de MAPK (/ERK, PI3K /Akt e p38) [41], os quais podem contribuir para as diferenças. Em células SNU638 o nível basal de IL-6 é mais elevada do que a IL-8, o que pode afectar o volume ARNm. Isto poderia ser parte da razão que o miR-146a tem menos efeito sobre LPA-estimulada a expressão de IL-6 do que na produção de IL-8 de expressão, que também foi observado em outros sistemas celulares [42]. Figura 6 miR-146a inibe a expressão de citocinas induzida pelo LPA. 25 uM de LPA foi utilizado para induzir a expressão de citocinas a partir de células de carcinoma gástrico humano SNU638. LPA expressão significativamente aumentada de IL-6, IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 e PDGFB, que foi medida utilizando qPCR e mostrado em relação ao nível de expressão em células de controlo não tratadas. Esta resposta é reduzido em células transfectadas com o miR-146a. Os dados são apresentados como média ± D.P., n = 4, * = P < 0,05, ns = não significativo.
MiR-146a sobre-expressão em SNU638 células reduz o recrutamento de monócitos Online em carcinomas monócitos pode ser recrutado por exemplo CCL5 e CSF-1 expressa por células de tumor e do tumor esta infiltração de monócitos contribui para a resposta inflamatória indutor de tumores em cancro da [39, 40]. Tendo demonstrado que o miR-146a reduzida expressão induzida pelo LPA de citocinas, examinamos como miR-146a sobre-expressão afetada recrutamento de monócitos. Verificou-se que LPA-tratamento de células SNU638 aumento da migração de monócitos no sentido de meio condicionado das células SNU638 (Figura 7 e FILE1 adicionais: Figura S7), ao passo que a transfecção com o miR-146a, em parte, ab-rogado esta resposta (Figura 7), demonstrando novamente que o miR -146a inibe as respostas biológicas da activação do GPCR-mediada de NF-kB, tais como, o recrutamento de monócitos. Figura 7 miR-146a diminui a migração de monócitos. migração de monócitos contra o meio condicionado a partir de células SNU638 de controle ou miR-transf-146a que foram deixados sem tratamento ou estimuladas com 25 mM LPA foi seguido por 8 horas. A migração de células é representada em relação à migração de células de controlo não tratadas. migração de monócitos contra o meio de células SNU638 LPA-estimuladas aumentou comparativamente com a migração contra a média de células não tratadas, enquanto a migração de monócitos contra a média de miR-146a-transfectadas, células LPA-estimulados foi diminuída em comparação com meio de transf-controle, LPA-estimulada células. Os dados são apresentados como média ± S.D. de quatro réplicas biológicas. ** = P < 0,01, NS = não significativo.
Discussão
factores micro-ambientais são importantes para a activação do NF-kB em cancros impulsionado-inflamação, tais como o cancro gástrico e esta activação de NF-kB pode fornecer células cancerosas com vantagens, que contribuem para o tumorgenic processos [32, 43]. A modulação de sinalização de NF-kB de activação é, por conseguinte, importante para controlar o desenvolvimento do tumor mediadas por inflamação. Aqui, mostramos que o miR-146a é um regulador negativo central da activação de NF-kB, uma vez que inibe várias vias de NF-kB-activação.
Expressão de miR-146a foi encontrado sobre-regulada em app. 2/3 dos adenocarcinomas gástricos humanos, bem como no modelo de ratinho KO gastrina do cancro gástrico. Da mesma forma, a expressão de miR-146a foi encontrado aumento no colo do útero, mama, pâncreas e cancro da tiróide [11, 44-46]. Anteriormente, a expressão de miR-146a foi encontrado, tanto para cima e para baixo-regulado em cancro gástrico [21-24]. Estes resultados conflitantes podem reflectir diferenças em tumores e o seu microambiente resultando em diferentes graus de actividades de NF-kB, que controla a expressão de miR-146a [16]. Surpreendentemente, descobrimos baixos níveis de miR-146a em linhas celulares de cancro gástrico humano. Isto pode indicar que o aumento dos níveis de miR-146a observados em tumores são evoluiu por factores micro-ambientais e.g. células que cercam as células tumorais.
Para examinar os efeitos do aumento dos níveis de miR-146a no câncer gástrico foram identificados dois novos alvos miR-146a, CARD10 e COPS8 e investigaram os papéis destes alvos. Descobrimos que miR-146a inibida GPCR mediada por activação de NF-kB diretamente pela segmentação e para baixo-regulação da expressão de CARD10 e COPS8. CARD10 é conhecido por ser necessária para a activação induzida por GPCR de NF-kB [27, 29], enquanto COPS8 é uma subunidade de signalosome COP9 que controla a activação de NF-kB [28, 47]. Mostrámos que CARD10 está envolvido na activação de GPCR-mediada de NF-kB, e fornecida novas evidências de que COPS8 está envolvido nesta via, bem. miR-146a sobre-expressão também levou à redução da expressão de COPS2, uma outra subunidade do signalosome COP9. Assume-se que este é um efeito indirecto, uma vez que não existe sítio de ligação de miR-146a em COPS2 3'UTR e alterações na expressão de uma subunidade tem sido demonstrado que afectam o da outra [35, 36]. É, portanto, possível que o miR-146a, em certa medida, pode actuar não só segmentação COPS8 mas desestabilizar o signalosome COP9.
Sinalização aberrante através de GPCRs tem sido associada ao crescimento de tumores e sobrevivência celular, e os GPCRs NF-kB-activação ter sido mostrado contribuir para uma ampla gama de cancros (revisto por Dorsam & Gutkind [48]). GPCRs pode activar o NF-kB através de
o complexo CARD10 /BCL10 /MALT1 depois de ligandos, tais como LPA, enothelin-1, angiotensina II (Ang II) e quimioquina (motivo CXC) ligando 12 (CXCL12) (Figura 8) de ligação [ ,,,0],29, 49]. Em nosso estudo utilizamos LPA para modelar a ativação GPCR mediada de NF-kB. LPA induzida por ligações de sinalização de GPCR para a progressão do tumor [49]. Assim, a inibição de miR-146a mediada por GPCR-sinalização poderia ter efeitos supressores de tumor. Figura 8 metas de miR-146a múltiplas vias de ativação NF-kB. Ilustração esquemática de vias de NF-kB-activação. miR-146a tem sido mostrado previamente para segmentar IRAK1 e TRAF6 e neste estudo mostram que o miR-146a tem como alvo CARD10 e COPS8. alvos de miR-146a estão marcados com círculos vermelhos.
Além GPCR mediada por activação do NF-kB, NF-kB pode ser activado através de
receptor de factor de necrose tumoral (TNFR), IL-1R, de TLR, receptor de células TCR e B (BCR) [50] (Figura 8). Anteriormente, o miR-146a foi mostrado para inibir a activação do NF-kB via
estes receptores por expressão-regulação para baixo de TRAF6 e IRAK1 [16, 18, 30, 31]. miR-146a atinge IRAK1 em células cancerosas gástricas, mas não TRAF6. Embora, aqui mostram que o miR-146a tem como alvo a activação mediada por GPCR de NF-kB, para além da activação através
TNFR, IL-1R, de TLR, TCR e BCR, por direccionamento e CARD10 COPS8 (Figura 8). Assim, o miR-146a tem como alvo vários componentes das vias em células de cancro gástrico NF-kB-activação. Isto não tem sido demonstrado para a via de NF-kB antes, mas foi previamente visto no fator de crescimento transformador-β (TGF-β) via, em que tanto o miR-21 e o agrupamento de miR-alvo 17-92 vários mRNAs que codifica para proteínas na via de TGF-β [51, 52]. Ao direcionar vários componentes de diferentes NF-kB ativação de caminhos-miR-146a medeia um controle robusto e complexo da atividade de NF-kB. Vários outros miARNs também pode regular NF-kB-a sinalização, mas apenas alvos de miR-146a diferentes genes em diferentes vias de NF-kB-activação, sugerindo que o miR-146a como um modulador chave da activação do NF-kB.
NF-kB regula expressão de citocinas e factores de crescimento implicados em vários aspectos da progressão do tumor [43]. Dado que o miR-146a diminui a actividade de NF-kB, é possível que o miR-146a actua supressor de tumor, reduzindo a expressão de tais citocinas e factores de crescimento. Com efeito, verificou-se que o miR-146a sobre-expressão de expressão de diversas citocinas e factores de crescimento com um papel conhecido no desenvolvimento do cancro reduzida; IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 e PDGFB. Estes genes podem aumentar a proliferação celular, adesão celular e angiogênese [53-55], contribuem para lymphangiogenesis tumor [56], ative fibroblastos [57], recrutar monócitos a tumores [39, 40] e induzir macrófagos associados a tumores (TAMs) para secretam mediadores promotores de tumor [58] (Figura 9). Figura 9 Os processos biológicos em células gástricas cancerosas inibidas pela miR-146a. O painel esquerdo, miR-146a atinge diretamente IRAK1, CARD10 e COPS8 em SNU638 células. Isto leva à inibição da activação do NF-kB e, consequentemente, a expressão reprimida de citocinas NF-kB-regulados e factores de crescimento. Expressão de miR-146a é também regulada por NF-kB [16]. Painel da direita, o miR-146a diminui a expressão de CCL5, CSF-1, IL-8, PDGF e a IL-23A, que estão envolvidos na migração de monócitos e a diferenciação, a proliferação, a angiogénese, linfangiogénese e de fibroblastos e o crescimento de macrófagos factor de libertação. Assim, miR-146a pode agir como um supressor de tumor, reduzindo efeitos de promoção de câncer de actividade de NF-kB.
Citocinas Quimiotáticos liberadas pelas células tumorais pode recrutar monócitos para sites tumor [39, 59]. Estes monócitos pode promover a progressão tumoral [60]. CCL5 e CSF-1 são exemplos de citocinas-recrutamento de monócitos liberadas pelas células tumorais [39, 40]. Como esperado, os monócitos menos migraram contra o meio condicionado a partir de células estimuladas com LPA SNU638 que sobre-expressam o miR-146a, em comparação com células de controlo estimuladas com LPA-. Figura S2. Figura S3. Figura S4. Figura S5. Figura S6. 0,05. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

• superexpressão simultânea de mutação p53 soro relacionada com a infecção por Helicobacter pylori
• metástase intraneural de carcinoma gástrico leva à paralisia do nervo ciático