microRNA-146a zavira G-proteinom sklopljen receptorsko posredovane aktivacije NF-κB z usmerjanjem CARD10 in COPS8 pri raku želodca

microRNA-146a zavira G-protein povezan receptorsko posredovane aktivacije NF-κB z usmerjanjem CARD10 in COPS8 na raka želodca
Abstract
Ozadje
Rak želodca je drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka pri svet. Vnetnih signalov, ki izvirajo iz želodca rakave celice so pomembne za zaposlovanje vnetnih celic in ureditev metastaz raka želodca. Več microRNAs (Mirna), so pokazale, da se vključijo v razvoj in napredovanje raka želodca. miRNA-146a (miR-146a) je modulator vnetnih signalov, vendar je malo znanega o njenem pomenu za rakom želodca. Zato smo želeli opredeliti cilje pokoj-146A pri raku želodca in preučiti svoje biološke vloge.
Rezultati
izražanja pokoj-146A je bila ocenjena s kvantitativno PCR (qPCR) in ugotovili, up-urejena v gastrin izločilnih miših so , model miši raka želodca, in pri 73% preiskanih želodcu adenokarcinomov človeka. Izražanje pokoj-146A s želodčnih rakavih celic, so potrdili na kraju samem
hibridizacije. Globalna analiza sprememb v mRNA po miR-146A transfekciji opredelil dva prepise, kaspaze zaposlovanje, ki vsebujejo domene protein 10 (CARD10) in COP9 signalosome kompleks podenote 8 (COPS8), saj se novi miR-146A ciljev. qPCR, Western blot in luciferazne testi so potrdili te prepise kot neposrednih ciljev miR-146A. CARD10 in COPS8 je pokazalo, da se del G-protein pripojen receptor (GPCR) pot aktivacije jedrske faktor kappaB (NF-kappaB). Lizofosfatidinsko kislino (LPA) inducira aktivacije NF-kappaB preko
tej poti in prekomerno ekspresijo miR-146A inhibiran LPA-inducirano aktivacije NF-kappaB, zmanjšano LPA-inducirano ekspresijo tumor spodbujanje citokinov in rastnih faktorjev ter zaviral monocit privlačnost .
sklepe
miR-146a izraz up-urejena v večini želodčnega raka, kjer je usmerjena CARD10 in COPS8, zaviranje-GPCR povzročeno aktivacijo NF-kappaB, s čimer se zmanjša ekspresijo NF-kappaB regulirano tumor- citokine, ki spodbujajo in rastne faktorje. Z usmerjanjem komponent več NF-kappaB-aktiviranje poti, miR-146a je ključni element pri urejanju NF-kappaB dejavnosti.
Ključne besede
rak želodca Non-kodiranje RNA Citokini Ozadje
rak globalno želodca je drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka [1]. Razvoj raka želodca vplivajo interakcije med gostiteljem, okolja in bakterijskih dejavnikov. Primeri sinergijske dejavnikov tveganja za raka želodca so polimorfizmi v genih, ki so vključeni v vnetnega odziva gostiteljici [2], Helicobacter pylori
(H. pylori
) virulence dejavniki [3] in prehrana bogata s soljo in nitrata [4] . Kljub nedavnemu napredku pri odkrivanju in zdravljenju zgodnjega raka želodca, dolgoročno preživetje zaradi napredovalega raka želodca je nizka [5]. Glavni izzivi za zdravljenje napredovalega raka želodca so limfne, peritonealno ali oddaljenih metastaz organov, ki hkrati napovedujejo slabe rezultate pri teh bolnikih [6].
Čeprav so poročali številni onkogeni in tumor valov, da sodelujejo pri razvoju želodčne karcinomov se molekularni mehanizmi povezane metastaze naprednih želodčnih karcinomov še vedno slabo razumemo [7]. Eden od ključnih dogodkov v želodcu rakotvornost je vnetje. Vnetje povzroči aktivacijo transkripcije faktorja jedrskega faktorjev kappaB (NF-κB), ki je povezana z želodca karcinogenezo [8, 9].
MicroRNAs (miRNA) so vključeni v razvoj in napredovanje raka želodca [10- 13]. miRNA je razred endogenega, nekodiran, enojno vijačnico RNA molekul aplikacije. 22 nukleotidov, ki posredujejo pri post-transkripcijski regulacije izražanja genov z osnovno seznanjanje z neprevedene regije 3 '(UTR) ciljnega RNA (mRNA) [14]. miRNAs sodelujejo pri regulaciji večini celičnih procesov, vključno celične proliferacije, migracije, diferenciacijo in apoptozo [10, 14, 15]. miRNAs so odklonsko izražene v večini človeških raka in podobno kodirajo proteine ​​genov, lahko miRNAs delujejo bodisi kot tumorskih razbijal ali onkogeni, tako uravnava rakotvornost [10, 12]. miRNA-146a (miR-146a) ureja NF-κB in zavira interlevkin-1 receptor (IL-1R) in receptorja, podobnega Toll (TLR) - inducirano aktivacije NF-κB z usmerjanjem interlevkin-1-receptorja povezano kinazo 1 (IRAK1) in TNF receptor povezan faktor 6 (TRAF6) [16-18]. miR-146a so poročali odklonsko zapisana v različnih vnetnih bolezni in raka, vendar je vloga pokoj-146A na raka želodca, je še vedno sporen, kot izraz pokoj-146A je bila najdena tudi navzgor in navzdol regulirano tukaj [19-24 ]. Zato smo raziskovali izražanje pokoj-146A pri raku želodca in značilno svoje cilje in molekularnih funkcij, naj pojasni nasprotujoče si ugotovitve.
Ugotovili smo, da je miR-146a up-urejena v mišjem modelu raka želodca kot tudi v človeške želodčne adenokarcinomov in so opisane CARD10 in COPS8 kot nove neposredne tarče pokoj-146A. Oba sta del G-protein pripojen receptor (GPCR) pogojenega signalov na ki ne mediira aktiviranje NF-κB. To kaže, da miR-146a deluje tumorja zatirati z zaviranjem GPCR posredovane aktivacije NF-κB in posledično izražanje tumor spodbujanje citokinov in rastnih faktorjev.
Rezultati
miR-146A izražanja je reguliran v miško model raka želodca in človeške želodčne adenokarcinome
gastrin Knockout (KO) miših so achlorhydric in razvoj intestinalno metaplazijo in želodčne adenome časom [25]. S kvantitativno PCR (qPCR) smo ugotovili izražanje miR-146A aplikacijo. 2-krat navzgor regulirano v staro gastrin KO miši bodisi fundic intestinalno metaplazijo ali antralnih adenomom v primerjavi z ekspresijo v divjega tipa (WT) miši (P < 0,05) (slika 1A). Uporaba situ
hibridizacije pokoj-146A je bila odkrita v metaplastic želodčnega tkiva iz gastrina KO miši, ne pa tudi v normalnem želodčnega tkiva iz WT miši (slika 2ab) (Dodatni datoteka1: Slika S1). Ob ugotovitvi, da je miR-146a v našem mišjem modelu raka želodca poveča smo preučili izražanje pokoj-146A v parnih človeške želodčne adenokarcinome in sosednjih kontrolnih biopsije in ugotovila, da je up-urejena v 27 od 37 primerov (73%) ( slika 1B). In situ
hibridizacija je pokazala, da je bila miR-146a izraziti s človeškimi adenokarcinomom želodca celic, medtem ko miR-146a-pozitivne celice niso bili odkriti v normalnem želodčne sluznice (slika 2CD) (Dodatni datoteka1: Slika S1). Slika 1 Povečano izražanje pokoj-146A v gastrin KO miške modelu raka želodca in raka človeškega želodca. (A) Relativna izraz miR-146a v metaplastic fundic tkivu (n = 8) in hiperplastični antralnih sluznice (n = 4) /antralnih adenomov (n = 4) iz gastrin knockout (KO) miših v primerjavi s povprečno izražanja v ujemanju divjega tipa (WT) tkivo miš. * = P < 0,05. (B) slap graf izražanja miR-146a v 37 človeške želodčne adenokarcinomov glede na ekspresijo v sosednjem normalnem tkivu. miR-146a je up-urejena v 27 od 37 tumorjev (73%). Stopnje izraženosti za miR-146A smo določili z qPCR in normalizirana tistim endogenega kontrolnega RNU44 s.
Slika 2 situ odkrivanje hibridizacije z miR-146A izražanja v gastrin KO miške želodčni modelu raka in raka človeške želodčne. (A) Izražanje pokoj-146A ni bila odkrita v WT tkiva fundic miške, (B), medtem ko miR-146a-pozitivne celice (modra jedra) so bile odkrite v metaplastic fundic tkiva iz gastrina KO miši. (C) Ni signala je bila odkrita z umešana sondo LNA. (D) miR-146a izraz bil odsoten v normalne človeške želodčne tkiva, (E), vendar prisotna v človeških adenokarcinomom želodca celic (modre jedra). (F) Negativna kontrola z uporabo kodiranih sondo LNA. Reprezentativni MIR-146A-pozitivne celice so označene s puščicami. Original povečava x20, Lestvica bar = 100 um.
Ni bilo korelacije med miR-146A izražanja v želodčnih adenokarcinomov bolnikov starost, spol in lokalizacija ali razvrstitev tumorjev (podatki niso prikazani). Čeprav se je zdelo, bolniki z visokim miR-146A izražanja, da imajo boljšo skupno preživetje to ni bilo pomembno. (Dodatni datoteka1: Slika S2)
miR-146A ciljne vrednosti člane GPCR posredovano NF-κB aktivacijske poti
Po dokazali povečano izražanje pokoj-146A v večini želodca raka, smo želeli ugotoviti bioloških učinkov mir-146A, ki ga označujejo njene neposredne molekularne cilje človeškega raka želodca. Želeli smo, da to storijo s prekomerno izražajo MIR-146A pri želodčnih rakave celice in nato ugotavljanje mRNK z zmanjšano izražanje [26]. Zato smo pregledali miR-146A izraz v senatu celičnih linij in ugotovila, raznolik, vendar je presenetljivo nizko izražanje pokoj-146A na voljo želodčnih celičnih linij (Dodatni datoteki1: Slika S3), glede na zaznano prekomerno ekspresijo v tumorjih <. br> človeško želodčni rak celične linije SNU638, ki ima zanemarljivi ravni endogenega miR-146A je bilo ugotovljeno, primerna za miR-146A študijah prekomerno ekspresijo. Ker je bil miR-146a izraz zelo nizka v testiranih želodca celičnih linij študije inhibicije miR-146A niso bile izvedene.
Najprej smo testirali, če prekomerno izražanje pokoj-146A vplival na rast v SNU638 celic in ugotovil, rast celic nespremenjena ( dodatna datoteka1: Slika S4). Pozneje so bili pregledani globalne spremembe v izražanju genov v SNU638 celicah naslednje prekomerno izražanje pokoj-146A. Po miR-146A transfekcijskih mRNA s predvidenimi 3'UTR miR-146A ciljnih območij so bili občutno navzdol urejena v primerjavi z mRNA brez predvidenih tarč mest (P < 4.6e-11, dvo-tailed Wilcoxonov rang test vsote) (slika 3A) . Analizirali smo vse besede dolžine 5-7 za več zastopanost v navzdol urejeno mRNA po miR-146A transfekciji in našel besedo najmočnejši korelaciji z zmanjšanjem števila bil na mestu semena dopolnilno zrel miR-146A podlag 2-7 /8 ( slika 3B). Indeks je s predvidenimi 3'UTR miR-146A ciljnih strani, ki so bile močno navzdol urejen z miR-146A transfekciji šteli za morebitne neposredne cilje miR-146A. 847 ustreza tem kriterijem (Dodatni datoteka1: Tabela S5). Top 10 najbolj navzdol regulirane potencialne tarče miR-146A so prikazani na sliki 3C. Kot negativno kontrolo validacije smo ponovili postopek zdravljenju SNU638 celice z zaviralcem LNA miR-146A. Ni bilo pomembno up-regulacije genov s pomočjo spletne strani semen dopolnilno zrel miR-146A baz (podatki niso prikazani). Slika 3 Identifikacija ciljev miR-146A. (A) Predvidene miR-146A ciljne prepisi so občutno navzdol urejeno po miR-146A transfekciji primerjavi z izraženih genov, ki niso predvidene cilje pokoj-146A (P < 4.6e-11, dvo-tailed Wilcoxonovim testom rang-sum) . (B) Top 10 besed najbolj povezana z zmanjšanjem števila (korelacija Z-rezultati so prikazane na levi strani vsake besede, vseh 10 besede imajo ocenjeno FDR < 1e-6). Velike tiskane črke označite semena regijo Mirna, Watson-Crick baznih parov (modra), neusklajenosti (rdeč). Beseda najmočnejši povezana z zmanjšanjem števila je bil na mestu seme dopolnjuje zrel Mirne osnov 2-7 /8. (C) Indeks, ki 6mer ali 7mer semenski strani miR-146A v 3'UTR, ki so najbolj navzdol urejen z miR-146A transfekciji so prikazani. To so potencialne neposredne tarče miR-146A. Izražanje je podan v spremembo log2 krat. 3'UTR 6 m /7 m stolpci kažejo številke 6- ali 7mer miR-146A semen mest v 3'UTR.
Treh najbolj navzdol reguliranih genov na pokoj-146A preveč izražanja, IRAK1, kaspaze zaposlovanje vsebujejo domene protein 10 (CARD10) in COP9 konstitutivni photomorphogenic homolog podenote 8 (COPS8) (slika 3C) vsi pripadajo signalnih poti, ki vodijo do aktivacije NF-κB [27-29]. IRAK1 je znano miR-146a ciljno vključeni v TLR- in IL-1R posredovane aktivacije NF-κB [16-18]. CARD10 sodeluje pri GPCR-posredovane aktivacije NF-κB [27], medtem ko je COPS8 mislil, da sodeluje pri tej poti, ki temelji na njegovi vpletenosti v T-celični receptor (TCR) pogojenega aktivacije NF-κB [28]. Presenetljivo, toda podobnih ugotovitev Boldin et al.
[30], izraz TRAF6, ki je bil predhodno opisan kot tarčo za miR-146A [16, 18, 31], ni bila zmanjšana na transkripcijske ravni po miR-146a prekomerno ekspresijo v našem modelu sistema.
in raka želodca, NF-κB uravnava celično preživetje, imunost in vnetje, in aktivacije NF-κB je povezana s slabim izidom pri raku želodca [32, 33]. Zato smo se osredotočili na karakterizacijo CARD10 in COPS8 kot cilj direktno miR-146A in njihove vloge v aktivacije NF-κB raka želodca. Potrdili smo miR-146a-posredovano navzdol ureditev CARD10, COPS8 in IRAK1 na ravni prepisa (slika 4a), in prav tako ugotovila, da miR-146a zniža raven CARD10, COPS8 in IRAK1 beljakovin (slika 4B). Nazadnje je bila neposredno ciljanje miR-146A na 3'UTRs ciljnih genov dokazana z uporabo luciferazne teste (slika 4c). Če povzamemo, smo potrdili prejšnje ugotovitve kažejo, da miR-146a neposredno namenjen IRAK1, poleg tega pa smo identificirali dve nove cilje, CARD10 in COPS8, ki kodira beljakovine predlagal, da se vključijo v aktivacijo NF-κB. COPS8 je sestavni del COP9 signalosome ki je sestavljena iz osmih podenot (GPS1 in COPS2-8) [34]. COPS8 je edina podenota z miR-146 usmerjena neposredno, temveč od sprememb v višini posameznih podenot je bilo dokazano, da vplivajo na količino drugih podenot [35, 36], smo pregledali, kako transfekciji z miR-146A vplivalo ekspresijo vse COP9 signalosome komponente. V nestimuliranih celicah je izraz COPS2 zmanjšana (20%) (dodatna datoteka1: Slika S5). Zato predvidevamo, da so učinki pokoj-146A na COP9 kompleksa v glavnem posledica zmanjšanja COPS8 izražanja, čeprav posredno destabilizacijo kompleksa ni mogoče izključiti. Slika 4 CARD10 in COPS8 neposredni cilji miR-146A. (A) mRNA Izražanje dveh novih miR-146A cilje, CARD10 in COPS8 in IRAK1, znano tarčo miR_146a, je bila določena z qPCR v nadzorne in miR-146A-transfektirana SNU638 celic. Izraz vsakega prepisa je prikazana glede na ekspresijo v kontrolno transfektirana celic. CARD10, COPS8 in IRAK1 izraz je navzdol urejeno naslednje MIR-146A preveč izražanja. Podatki so prikazani kot povprečje ± S.D. štirih bioloških ponovitev. * = P < 0,05, ** = P < 0,01, *** = P < 0,001. (B) miR-146a transfekciji tudi zniža raven beljakovin za CARD10, COPS8 in IRAK1 v miR-146a-transfekciji SNU638 celic. Izraz vsakega proteina je prikazana glede na ekspresijo v kontrolno transfektirana celic. Trakovi so količinsko glede na P-aktina. Podatki so prikazani kot povprečje ± S.D. štirih bioloških ponovitev. * = P < 0,05, ** = P < 0,01, *** = P < 0,001. (C) Preverjanje neposredno in funkcionalno cilj zavezujoč uporabo luciferazno konstrukte, ki imajo WT 3'UTRs in mutiral (Mut) 3'UTRs za CARD10, COPS8 in IRAK1 (so osrednji 4 nukleotidov v miR-146A vezivnega mesta zamenja). Konstrukti, ki vsebujejo bodisi WT ali mutiral (Mut) 3'UTRs nadaljnjim za Firefly gena luciferaze so co-transfektirali v HEK293 celice skupaj z Renilla nadzorni luciferaza plazmida in bodisi miR-146A ali nadzor (Siglo). Levo, luciferaza dejavnost je podana glede na dejavnosti v kontrolno transfekcije celic. miR-146a zmanjša luciferazno aktivnost konstruktov z WT CARD10, COPS8 in IRAK1 3'UTRs. Desno so prikazani zaporedje trase Mir-146A in potencialno WT in Mut 3'UTR ciljnih območij, mutirane baze so prikazane v rdeči barvi. Podatki so prikazani kot povprečje ± S.D. Pogosto biološke ponovitve. *** = P < 0,001. Zaporedje trase so prilagojene DIANALab (2009).
MIR-146A zavira GPCR posredovano aktivnost NF-κB z usmerjanjem CARD10 in COPS8
CARD10 in COPS8 so vpleteni v GPCR posredovane aktivacije NF-κB [28, 29 ]. Zato smo želeli ugotoviti njihove vloge v prenos signalov pri raku želodca in nato raziskati pomen pokoj-146A pri zaviranju to signalizacijo. Za ta namen smo uporabili lysophosphatiditc kisline (LPA), ki je znan aktivator GPCR-posredovanega NF-κB-aktivacijske poti [29], ter spodbuja migracijo želodčni rak celic in invazijo [37]. LPA-stiumlation znatno povečal NF-κB aktivnost v našem luciferazno reporterskega sistema (slika 5). siRNA rasklapanje za CARD10 in COPS8 izraz bistveno zaviral LPA-stimuliran-GPCR povzročeno aktivacijo NF-κB v SNU638 celic (slika 5). To zaviranje je bila primerljiva z inhibicijo miR-146A-inducirane. V nasprotju s tem pa je bila inhibiranje endogeni miR-146a, brez vpliva na aktivacije NF-κB. Kot je napovedal, siRNA posredovano zatiranja IRAK1 izražanja ni vplivala LPA-stimuliran aktivacije NF-κB (slika 5), ​​kot je IRAK1 ni vključevala-GPCR posreduje pot. Kot je TRAF6 cilj povečanja miR-146a z vlogo v aktivacije NF-κB, so raziskovali učinek-siRNA posredovana zatiranju TRAF6 izražanja na LPA stimulirane aktivnosti NF-κB. Vendar rasklapanje od TRAF6 ni zaviral LPA-stimuliran NF-κB aktivnost (slika 5). Ti rezultati kažejo, da sta dve na novo opredeljeni cilji miR-146A, CARD10 in COPS8, vključene v GPCR-posredovane aktivacije NF-κB. Zato so preučevali učinek pokoj-146A preveč izražanja na LPA stimulirane aktivnosti NF-κB. miR-146a močno zaviral LPA-stimuliran aktivnost NF-κB v SNU638 celic (slika 5). Mešanica siRNAs proti CARD10, COPS8, IRAK1 in TRAF6 oponašal MIR-146a-dosežene inhibicije z NF-κB dejavnosti (Slika 5). Rasklapanje dveh drugih komponent COP9 (COPS2 in COPS5) ovira tudi LPA-stimuliran aktivnost NF-κB, kar kaže na pomembnost prisotnosti vseh COP9 signalosome podenot za LPA stimulirane aktivacije NF-κB. qPCR izraza različnih komponent preučenih potrdili rasklapanje (slika 5). Slika 5 miR-146A cilji COPS8 in CARD10 GPCR-posredovane aktivacije NF-κB. SNU638 celice so co-transfekciji s NF-κB novinar plazmida in Renilla nadzorni luciferaza plazmida, skupaj z nadzorom (Siglo), siRNA ali miR-146A. Celice smo stimulirali z smo izmerili 25 uM LPA in luciferazno aktivnost. Luciferazno aktivnost je podana glede na dejavnost nadzora transfektirane LPA-stimulirane celice. siRNA proti CARD10 in COPS8, MIR-146A, inhibitor miR-146A in siRNA mix zmanjšane luciferazne dejavnostjo. siRNA proti IRAK1 in TRAF6 ni zmanjšal luciferazno aktivnost. LPA-stimulirane aktivacije NF-κB je zaviral tudi siRNA proti COPS2 in COPS5, ki dokazuje, da druge motnje COP9 signalosome kompleksa zmanjšuje GPCR posredovane aktivacije NF-κB. siMix zmešamo z siRNAs proti CARD10, COPS8, IRAK1 in TRAF6. Podatki so prikazani kot povprečje ± SD sedem bioloških ponovitev * = P <., 0,05. Relativna izraz TRAF6, COPS8, IRAK1, CARD10, COPS2 in COPS5 so merili s qPCR. Gray-senčenje kaže znatno spremembo izražanja, p < 0,05, n = 4.
izražanje pokoj-146A je delno NF-κB nadzorovano. Zato smo tudi testirali, kako je izraz miR-146A vpliva LPA in stimulacijo IL-1β. Ugotovili smo, da je zdravljenje LPA podvojila izražanje pokoj-146A in stimulacijo IL-1β dal 4-kratno povečanje miR-146A izražanja, ki je primerljiva s prejšnjimi pripomb [16, 38] (Dodatni datoteka1: Slika S6). Čeprav miR-146a LNA poveča ekspresijo treh ciljev MIR-146A (TRAF6, IRAK1 in CARD10) (slika 5) celotno aktiviranje NF-κB ni spremenil v LPA stimulirane miR-146A LNA zdraviti SNU638 celice.
miR-146a zmanjšuje LPA-inducirano izražanje citokinov in rastnih faktorjev
V večini karcinomov microenvironmental dejavniki, ne pa genetske spremembe so verjetno odgovorne za aktiviranje NF-κB signalizacijo, ki ureja več procesov, vključno izločanje rastnih faktorjev in citokinov [39, 40]. Zato smo raziskovali, kako miR-146a modulira izražanje izbranih NF-κB reguliranih rastnimi faktorji in citokini, ki jih zunajcelično signali, kot so LPA induciranih. LPA-stimulacija bistveno povečala ekspresijo interlevkin-6 -8, 23A (IL-6, IL-8, IL-23A) in kemokinov (CC motiv) ligand 5 (CCL5), kolonijo stimulirajoči faktor 1 (makrofagov) (CSF- 1) in trombocitni rastni faktor beta polipeptid (PDGFB) v SNU638 celic (slika 6). To potrjuje, da je izražanje teh genov ureja LPA sprožene aktivnosti NF-κB. Prekomerno ekspresijo miR-146A znatno zmanjšal ekspresijo IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 in PDGFB v SNU638 celic (slika 6). Čeprav je IL-6 je cilj gen NF-κB in tudi navzgor regulirana z LPA miR-146A prekomerno ekspresijo ni zmanjšalo IL-6 ekspresijo pod našimi pogoji (slika 6). Vendar pa je LPA indukcijo IL-6 izražanja ne poteka le NF-κB temveč tudi preko drugih poteh (MAPK /ERK, PI3K /Akt, in p38) [41], ki lahko prispevajo k razlikam. V SNU638 celicah bazalni nivo IL-6 je večja od IL-8, ki lahko vplivajo na promet mRNA. To je lahko del razloga, da ima miR-146a manjši učinek na LPA stimulirane IL-6 izražanja kot na IL-8 izražanja, ki je videl tudi v drugih celičnih sistemih [42]. Slika 6 miR-146a zavira LPA inducirane izražanje citokinov. 25 uM LPA bila uporabljena za induciranje citokinske ekspresijo iz človeške želodčne karcinom SNU638 celic. LPA znatno povečana ekspresija IL-6, IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 in PDGFB, ki je izmerjeno z uporabo qPCR in je prikazan glede na nivo ekspresije v nezdravljenih kontrolnih celicah. Ta odziv se zmanjša v miR-146A-transfekcije celic. Podatki so prikazani kot povprečje ± SD, n = 4, * = P < 0.05, ns = neznačilno.
MIR-146A prekomerno ekspresijo v SNU638 celicah zmanjšuje zaposlovanje monocitov
V karcinomov monociti lahko zaposlijo npr CCL5 in CSF-1, ki ga tumorske celice izrazijo in to tumorja infiltracijo monocitov prispeva k tumorjem pospeševanje vnetnega odziva pri raku [39, 40]. Ker je dokazano, da miR-146a zmanjša LPA-inducirane ekspresije citokinov, smo pregledali, kako miR-146a prekomerno ekspresijo prizadela zaposlovanje monocitov. Ugotovili smo, da LPA-zdravljenje SNU638 celic povečala monocitov migracija na kondicioniranega medija iz SNU638 celic (Slika 7 in dodatna datoteka1: Slika S7), medtem ko transfekciji s pokoj-146A delno razveljavilo ta odgovor (slika 7), še enkrat dokazuje, da miR -146a zavira biološke odzive GPCR-posredovane aktivacije NF-κB kot, zaposlovanje monocitov. Slika 7 miR-146a zmanjšuje monocit migracije. Monocit migracije proti pripravljenih sredstva od samo nadzorne ali miR-146A-transfekcije SNU638 celice, ki so ostale neobdelane ali stimuliranih z 25 iM LPA je sledilo več kot 8 ur. Migracija celic je prikazana glede na migracijo nezdravljene kontrolne celice. Monocit migracije proti mediju od LPA-stimuliranih SNU638 celic je bilo v primerjavi z migracijo proti sredstvu od neobdelanih celic povečala, medtem ko monocit migracije proti mediju od pokoj-146A-transfekcije je LPA-spodbudi celice zmanjšala v primerjavi z letom mediju iz nadzorne transfekcije, LPA-spodbudila celice. Podatki so prikazani kot povprečje ± S.D. štirih bioloških ponovitev. ** = P < 0,01, ns = neznačilno.
Razprava
Microenvironmental dejavnikov, ki so pomembni za aktivacijo NF-κB v-vnetje posledica raka, kot so rak želodca in s tem aktivacije NF-κB lahko zagotovi rakave celice s prednostmi, ki prispevajo k tumorgenic procesov [32, 43]. Modulacija NF-κB-aktivacijsko signalizacijo Zato je pomembno za nadzorovanje razvoja tumorja, vnetje posredovano. Tukaj bomo pokazali, da je miR-146a osrednji negativni regulator aktivacije NF-κB saj zavira več NF-κB-aktiviranje poti.
MiR-146A izraz je bilo ugotovljeno up-urejena v aplikaciji. 2/3 želodca adenokarcinomov človeka kot tudi v gastrin KO mišjem modelu raka želodca. Podobno izraz miR-146A je bila ugotovljena v materničnega vratu, prsi, trebušne slinavke in raka ščitnice [11, 44-46] povečana. Prej je bil izraz pokoj-146A najti tako navzgor in navzdol ureja rakom želodca [21-24]. Ti nasprotujoči si rezultati lahko posledica razlik v tumorjih in njihovo mikrookolje, ki izhajajo iz različnih stopnjah aktivnosti NF-κB, ki nadzoruje miR-146A izraz [16]. Presenetljivo je, da smo ugotovili nizke nivoje miR-146a v človeške želodčne raka celičnih linij. To lahko kaže, da so povišane ravni miR-146A videli v tumorjih coursed s microenvironmental dejavnikov, npr Celice, ki obdajajo tumorske celice.
Da bi preučili učinke povečane ravni miR-146A na raka želodca smo ugotovljenih dva nova miR-146A cilje, CARD10 in COPS8 in preiskujejo vloge teh ciljev. Ugotovili smo, da miR-146a zaviral GPCR posredovane aktivacije NF-κB neposredno ciljanje in dol uravnava izražanje CARD10 in COPS8. CARD10 je znano, da je potrebno za GPCR povzročene aktivacije NF-κB [27, 29], medtem ko COPS8 je podenote COP9 signalosome, ki nadzira NF-κB aktivacijo [28, 47]. Pokazali smo, da je CARD10 vključen v GPCR-posredovane aktivacije NF-κB, in pod pogojem, nove dokaze, da je COPS8 sodeluje pri tej poti, kot tudi. miR-146a prekomerno ekspresijo pripeljalo tudi do zmanjšane ekspresije COPS2, druge podenote COP9 signalosome. Domnevamo, da je to posreden učinek, ker ni miR-146a vezavno mesto v COPS2 3'UTR in spremembe pri izražanju ene podenote Pokazalo se je, da vplivajo da druge [35, 36]. Zato je mogoče, da miR-146a do neke mere delujejo tako, da ne samo ciljanje COPS8 ampak destabilizacijo COP9 signalosome.
Odklonskega signalizacijo preko GPCRs je bila povezana z rastjo tumorskih celic in preživetje, in NF-κB-aktiviranje GPCRs so bili pokazale, da prispevajo k široko paleto raka (s Dorsam &preučiti; Gutkind [48]). GPCRs lahko aktivirajo NF-κB preko
CARD10 /BCL10 /MALT1 kompleks po vezavi ligandov kot LPA, enothelin-1, angiotenzina II (Ang II) in kemokinov (CXC motiv) ligand 12 (CXCL12) (Slika 8) [ ,,,0],29, 49]. V naši raziskavi smo uporabili LPA modelirati GPCR posredovane aktivacije NF-κB. LPA-inducirano-GPCR signalizacija vodi do napredovanja tumorja [49]. Tako bi miR-146a posredovano zaviranje GPCR-signalizacije imajo tumorske zatiranja učinke. Slika 8 miR-146A cilji več NF-κB aktivacijski poteh. Shematski prikaz NF-κB-aktivacije poti. miR-146a je že dokazano, da ciljno IRAK1 in TRAF6 in v tej študiji smo pokazali, da miR-146a namenjen CARD10 in COPS8. Cilji miR-146A so označena z rdečimi krogi.
Poleg GPCR-posredovane aktivacije NF-κB, lahko NF-κB aktivira preko
tumor nekroze faktor receptor (TNFR), IL-1R, TLR, TCR in B celični receptor (BCR) [50] (slika 8). Prej je bilo miR-146a je prikazano, da inhibira aktiviranje NF-κB preko
teh receptorjev z navzdol regulacijo ekspresije TRAF6 in IRAK1 [16, 18, 30, 31]. miR-146a usmerjena IRAK1 v želodčnih rakavih celicah, vendar ne TRAF6. Čeprav smo tukaj pokazali, da miR-146a cilja-GPCR posredovano aktiviranje NF-κB, poleg aktivacije preko
TNFR, IL-1R, TLR, TCR in BCR z usmerjanjem CARD10 in COPS8 (slika 8). Tako miR-146a cilja več komponent NF-κB aktiviranje poti v želodcu rakavih celic. To se ni izkazalo za NF-κB poti prej, vendar je bilo prej videti v transformirajočega rastnega faktorja ß (TGF-P) poti, kjer sta MIR-21 in ciljne gruče MIR-17-92 več mRNA, ki kodira beljakovine v TGF-beta poti [51, 52]. Z usmerjanjem več komponent različnih NF-κB-aktiviranje poti pa miR-146a posreduje močan in zapleten nadzor NF-κB dejavnosti. Številne druge miRNAs lahko urejal tudi NF-κB signalizacije, vendar le miR-146A cilji več genov v različnih NF-κB-aktiviranja poti, kar kaže MIR-146A kot ključni modulator aktivacije NF-κB.
NF-κB ureja izražanje citokinov in rastnih faktorjev, vključenih v več vidikih napredovanja tumorja [43]. Glede na to, da miR-146a zmanjša NF-κB aktivnost, je možno, da miR-146a deluje tumorja zatirati zmanjša ekspresijo teh citokinov in rastnih faktorjev. Res smo ugotovili, da miR-146a prekomerno ekspresijo zmanjšano ekspresijo več citokinov in rastnih faktorjev z znano vlogo pri razvoju raka; IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 in PDGFB. Ti geni lahko povečajo proliferacije celic, adhezijo celic in angiogenezo [53-55], ki prispevajo k tumorja limfangiogenezo [56], aktivira fibroblaste [57], zaposliti monocitov, da tumorjev [39, 40] in povzročijo povezane s tumorjem makrofagov (TAMs) do izloča s tumorjem spodbujanje mediatorji [58] (Slika 9). Slika 9 biološke procese v rakavih celicah želodca s pokoj-146A zavirajo. Levo panel, miR-146a neposredno namenjen IRAK1, CARD10 in COPS8 v SNU638 celicah. To vodi do inhibicije aktivacije NF-κB in zato zatrta izražanja NF-κB reguliranih citokinov in rastnih faktorjev. Izražanje pokoj-146A je urejeno tudi z NF-κB [16]. Desna plošča, miR-146a zmanjša izražanje CCL5, CSF-1, IL-8, PDGF in IL-23A, ki so vključene v migracije monocit in diferenciacijo, proliferacijo, angiogenezo, limfangiogenezo in fibroblastnega in rast makrofagov faktorja za javnost. Tako lahko miR-146a deluje kot zaviralnih z zmanjševanjem raka spodbujanje učinke NF-κB dejavnosti.
Kemotaktičnih citokinov v tumorskih celicah sprosti lahko zaposli monocitov na tumorskih mestih [39, 59]. Te monociti lahko spodbujajo napredovanja tumorja [60]. CCL5 in CSF-1 so primeri, monocitov zaposlovanje citokinov, ki jih tumorskih celic [39, 40] sproščeni. Kot je bilo pričakovati, monociti selili manj proti pripravljenih mediju iz LPA-stimuliranih SNU638 celicah prekomerno izražanje MIR-146A primerjavi LPA-stimuliranih kontrolnih celicah. Slika S2. Slika S3. Slika S4. Slika S5. Slika S6. Vsi avtorji prebrali in potrdil končni rokopis.

• Sočasno overexpression serum p53 mutacije povezane s Helicobacter pylori od infection
• Intraneural metastaze raka želodca vodi ishiadičnega živca palsy