MicroRNA-146A slopina G baltymu sujungto receptoriaus tarpininkaujant aktyvavimo NF-κB nukreipiant CARD10 ir COPS8 skrandžio vėžio

MicroRNA-146A slopina G baltymu sujungto receptoriaus tarpininkaujant aktyvavimo NF-κB nukreipiant CARD10 ir COPS8 skrandžio vėžio
tezės
Background
Skrandžio vėžys yra antra labiausiai paplitusi priežastis, dėl vėžio susijusių mirties pasaulis. Uždegimo signalai, kilę iš skrandžio vėžio ląstelių yra svarbu įdarbinti uždegiminių ląstelių ir reguliavimas metastazių skrandžio vėžio. Įrodyta keletas mikro RNR (Mirna) dalyvauti kuriant ir progresavimo skrandžio vėžio. Mirna-146A (MIR-146A) yra uždegiminių signalų moduliatorius, tačiau mažai žinoma apie jo svarbą skrandžio vėžio. Todėl norėjome nustatyti tikslus PPN-146A skrandžio vėžio ir ištirti savo biologinius vaidmenis
. Rezultatai Viesbutis The PPN-146A išraiška buvo įvertintas kiekybine PGR (qPCR) ir nustatė iki reguliuojama per gastrinas pelç , pelės modelis skrandžio vėžiu, o 73% tirtų žmogaus skrandžio adenokarcinomos. Išraiška miR-146A skrandžio vėžio ląstelių buvo patvirtinta in situ hibridizacijos
. Pasaulinis analizė pokyčių mRNR lygius po Pasaulis-146A transfekciją išskyrė dvi nuorašai, kaspazės įdarbinimas domenų, kurių sudėtyje yra baltymų 10 (CARD10) ir COP9 signalosome kompleksas subvieneto 8 (COPS8), kaip nauji Pasaulis-146A tikslus. qPCR, Imunoblotingo ir liuciferazės tyrimai patvirtino šių nuorašai, kaip tiesioginių Pasaulis-146A tikslus. CARD10 ir COPS8 buvo įrodyta, kad būti dalis G baltymu sujungto receptoriaus (GPCR) keliu branduolinės faktoriaus kappaB (NF-kappaB) aktyvacijos. Lysophosphatidic rūgštis (LPA) sukelia NF-kappaB aktyvavimo per
šio kelio ir per išraiškos PPN-146A slopinamas LPA sukeltas NF-kappaB aktyvavimo, sumažino LPA sukeltas išraišką augimą skatinantį citokinų ir augimo faktorių ir slopina monocitų atrakcija .
išvadas
Pasaulis-146A išraiška yra iki reguliuojama į skrandžio vėžio dauguma, kai ji skirta CARD10 ir COPS8, slopina GPCR tarpininkaujant aktyvavimo NF-kappaB, taip sumažinant išraišką NF-kappaB reguliuojama tumor- skatinti citokinus ir augimo faktorius. Nukreipiant komponentus keliose NF-kappaB įsijungiantis kelius, PPN-146A yra pagrindinis komponentas NF-kappaB veiklos reguliavimu.
Raktiniai žodžiai
Skrandžio vėžys Ne kodavimo RNR citokinai faktai
Pasaulyje skrandžio vėžys yra antra labiausiai paplitusi priežastis, dėl vėžio susijusių mirties [1]. Plėtros skrandžio vėžio įtakoja sąveiką priimančiosios, aplinkos ir bakterinių veiksnių. Pavyzdžiai sinergetinio rizikos veiksnių skrandžio vėžiu yra polimorfizmas į genų, dalyvaujančių priimančiosios uždegiminio atsako [2], Helicobacter pylori
(H. pylori
) virulentiškumo veiksniai [3] ir dietos turtingas druskos ir salietros [4] , Nepaisant pastaruoju metu pažangos nustatymo ir gydymo pradžioje skrandžio vėžio, ilgalaikis išgyvenamumas išplitusiu skrandžio vėžiu yra žemas [5]. Pagrindiniai uždaviniai gydant išplitusiu skrandžio vėžiu yra limfinės, pilvaplėvės arba tolimi organų metastazių, kurios vienu metu prognozuoti bloga rezultatą šiems pacientams [6].
Nors buvo pranešta apie daug Onkogeny ir naviko slopintuvai turi būti įtrauktas į plėtros skrandžio karcinoma , molekulinius mechanizmus pagrindinės metastazių išplitusio skrandžio karcinoma yra dar menkai suprantama [7]. Vienas iš pagrindinių įvykių skrandžio kancerogenezėje yra uždegimas. Uždegimas sukelia aktyvavimo transkripcijos veiksnio atominės faktoriaus-kappaB (NF-κB), kuris yra susijęs su skrandžio karcinogenezę [8, 9].
Mikro RNR (Mirna) dalyvauja kuriant ir progresavimo skrandžio vėžio [10- 13]. Mirna yra endogeninio, ne kodavimas, viengrandds RNR molekulių app klasė. 22 nukleotidai, kad tarpininkauja po transkripcijos reguliavimo genų ekspresiją per bazinės Kergimas su 3 'neišverstas regione (UTR) ir tikslinės RNR (iRNR) [14]. miRNAs dalyvauja reguliuojant daugeliu mobiliojo ryšio procesų, įskaitant ląstelių proliferaciją, migraciją, diferenciacijos ir apoptozės [10, 14, 15]. miRNAs yra nenormaliai išreikšta daugeliu žmogaus vėžio ir, kaip baltymų kodavimo genų, miRNAs gali veikti arba kaip naviko slopintuvai ar onkogenų, taip reguliuojant kancerogenezės [10, 12]. Mirna-146A (MIR-146A) reglamentuoja NF-κB ir slopina interleukino-1 receptorių (IL-1R) ir rinkliava panašaus receptoriaus (TLR) - sukeltą aktyvavimo NF-κB nukreipiant interleukino-1 receptorių susijęs kinazės 1 (IRAK1) ir TNF receptoriaus susijęs veiksnys 6 (TRAF6) [16-18]. ir miR-146A buvo pranešė, kad vyksta klaidinga pateikti keliomis uždegiminių ligų ir vėžio, bet miR-146A vaidmuo skrandžio vėžys yra vis dar prieštaringas, kaip išraiškos miR-146A buvo nustatyta, tiek aukštyn ir žemyn reguliuojama čia [19-24 ]. Todėl mes tyrė PPN-146A išraišką skrandžio vėžio ir pasižymi savo tikslus ir molekulių funkcijas paaiškinti prieštaringus rezultatus.
Mes nustatėme, kad Pasaulis-146A yra iki-reguliuojami pelės modelio skrandžio vėžio, taip pat žmogaus skrandžio adenokarcinoma ir nustatė CARD10 ir COPS8 kaip naujų tiesioginių tikslų PPN-146A. Abu yra dalis su G baltymu sujungtas receptorius (GPCR) sąlygojamą signalo transdukcijos, kad tarpininkauja aktyvavimą NF-κB. Tai rodo, kad Pasaulis-146A veikia naviko sulaiko slopindamas GPCR tarpininkaujant aktyvavimo NF-κB ir gautą išraišką augimą skatinantį citokinų ir augimo faktorių.
Rezultatai
Pasaulis-146A išraiška yra iki-reguliuojami pele modelis skrandžio vėžio ir žmogaus skrandžio adenokarcinoma
gastrinas nokautas (ko) pelės yra achlorhydric ir plėtoti žarnyno Metaplasia ir skrandžio adenomų laikui bėgant [25]. Naudojant kiekybine PGR (qPCR), mes nustatėme, Pasaulis-146A app išraiška. 2 kartus iki reguliuojama senosios gastrinas KO pelių arba fundic žarnyno metaplazijos ar antralinių adenoma palyginus su laukinio tipo (WT) pelių išraiškos (P < 0,05) (1a pav.) Naudojant in situ hibridizacijos
miR-146A buvo aptiktas metaplastic skrandžio audinio iš gastrino KO pelių, tačiau ne įprastu skrandžio audinio iš WT pelėmis (2AB paveikslas) (Papildoma failas1: S1 paveiksle). Nustačius, kad Pasaulis-146A yra padidėjęs mūsų pelės modelio skrandžio vėžio mes išnagrinėjo išraišką PPN-146A yra suporuotas žmogaus skrandžio adenokarcinomos ir gretimų kontrolės biopsijos ir nustatė, kad jis buvo reguliuojama į 27 iš 37 atvejų (73%) ( 1B pav.) In situ hibridizacijos
parodė, kad Pasaulis-146A buvo išreikšta žmogaus skrandžio adenokarcinoma ląstelių, o Pasaulis-146A-teigiamų ląstelių nebuvo aptikta normaliai skrandžio gleivinės (2CD paveikslas) (Papildoma failas1: S1 paveiksle). 1 pav Padidėjęs išraišką PPN-146A į gastrinas KO pelės skrandžio vėžio modelio ir žmogaus skrandžio vėžio. (A), santykinė išraiška miR-146A yra metaplastic fundic audinio (n = 8) ir hiperplazinių antralinių gleivinė (n = 4) /antralinių adenoma (n = 4) iš gastrinas nokautas (ko) pelėms, palyginti su vidutiniu išraiška atitikimo laukinio tipo (WT), pelės audinių. * = P < 0,05. (B) Krioklys sklypas miR-146A išraiškos 37 žmogaus skrandžio adenokarcinomos, palyginti su gretimuose normaliuose audiniuose išraiška. Pasaulis-146A buvo iki-reguliuojama 27 iš 37 auglių (73%). Sąvoka lygiai PPN-146A lėmė qPCR ir normalizuotas tiems endogeninio valdymo RNU44.
2 pav situ hibridizacijos aptikimo PPN-146A reikšti savo mintis gastrinas KO pelės skrandžio vėžio modelio ir žmogaus skrandžio vėžio. (A), išraiška miR-146A nebuvo aptikta WT fundic pelės audinių, (B), o Pasaulis-146A-teigiamas ląsteles (mėlyna branduoliai) buvo aptikta metaplastic fundic audinio nuo gastrino KO pelių. (C) ne signalas buvo aptiktas su plakta LNA zondo. (D) ir miR-146A išraiška nestebėtas normalus žmogaus skrandžio audinio, (E) bet aptinkami žmogaus skrandžio adenokarcinoma ląstelių (mėlynus branduoliai). (F) Neigiama kontrolė naudojant koduotus LNA zondą. Reprezentacinės MIR-146A-teigiamas ląstelės yra nurodyti rodyklėmis. Originalus priartinimas x20, Mastelio juosta = 100 mkm.
Nebuvo koreliacija tarp Pasaulis-146A raiškos skrandžio adenokarcinomos ir pacientų amžius, lytis ir lokalizavimo arba navikus klasifikacija (duomenys neparodyti). Nors pacientai, sergantys didelio Pasaulis-146A išraiška atrodė geriau bendrą išgyvenimą tai nebuvo reikšminga. (Papildoma failas1: S2 paveikslas)
Pasaulis-146A siekimo narius GPCR sąlygojamą NF-κB aktyvacijos keliu
įrodė padidėjo išraiška PPN-146A yra skrandžio vėžio dauguma norėjome nustatyti biologiniai veiksmai PPN-146A apibūdindamas savo tiesiogines molekulinius taikinius žmogaus skrandžio vėžio. Norėjome tai padaryti per išreikšti MIR-146A skrandžio vėžio ląsteles ir tada nustatyti mRNR riboto išraiška [26]. Todėl mes išnagrinėjo Pasaulis-146A išraišką iš ląstelių linijų skydelyje ir nustatė, įvairus, tačiau stebėtinai mažą raišką PPN-146A su prieinamais skrandžio ląstelių linijas (Papildoma failas1: S3 paveikslas), atsižvelgus į aptikta per saviraiškos navikų <. Br> žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linija SNU638, kuri turi neglectable lygius endogeninio miR-146A buvo nustatyta tinka mir-146A nei ekspresijos tyrimus. Nuo Pasaulis-146A išraiška tirtų skrandžio ląstelių linijų Pasaulis-146A slopinimo tyrimai nebuvo atlikti buvo labai mažas.
Mes pirmą kartą išbandyti, jeigu per išraiškos PPN-146A paveikė SNU638 ląstelių augimą ir nustatė, ląstelių augimą nepakitę ( Papildoma failas1: S4 pav.) Vėliau buvo ištirtos pasauliniai pokyčiai genų raiškos SNU638 ląstelių šie per išraiškos PPN-146A. Po Pasaulis-146A transfekcijos mRNR, kurio planuojamas 3'UTR Pasaulis-146A tikslinių vietų buvo gerokai žemyn reguliuojama palyginti su mRNR be prognozuotų siekiais svetainių (p < 4.6e-11, du-tailed Vilkoksono rango suma testas) (3A pav) , Tyrėme visus ilgis 5-7 žodžių per-atstovavimas žemyn reguliuojama iRNR po Pasaulis-146A transfekciją ir rasti žodį stipriausia koreliuojantį su žemyn reguliavimas sėklų puslapį papildomą subrendęs Pasaulis-146A bazes 2-7 /8 ( 3B pav.) Nuorašai su prognozuojama 3'UTR Pasaulis-146A tikslines svetaines, kurios buvo gerokai žemyn reguliuojama ant Pasaulis-146A transfekciją buvo laikomi potencialiais tiesioginių Pasaulis-146A tikslus. 847 atitiko šiuos kriterijus (Papildoma failas1: Lentelė S5). Į viršų 10 labiausiai žemyn reguliuojamos potencialūs Pasaulis-146A tikslai rodomi Fig.3C. Kaip neigiamas patvirtinimo kontrolės mes pakartoti procedūrą gydantį SNU638 ląsteles su Pasaulis-146A LNA inhibitorius. Nebuvo jokių reikšmingų iki reguliavimas genų su sėkla svetainėje papildomą subrendęs Pasaulis-146A bazes (duomenys neparodyti). 3 pav identifikavimas Pasaulis-146A tikslus. (A) numatomos Pasaulis-146A tikslinės nuorašai yra gerokai žemyn reguliuojama po Pasaulis-146A transfekciją palyginti su išreikštų genų, kurie nėra prognozuojama tikslus PPN-146A (p < 4.6e-11, du-tailed Vilkoksono rango sumą testą) , (B), Top 10 žodžiai dauguma koreliuoja su žemyn Reglamento (koreliacijos Z-balai yra nurodyti prie kiekvieno žodžio kairėje, visi 10 žodžiai turi apytikriai FDR < 1e-6). Didžiosios raidės pabrėžti Mirna sėklų regioną Watson-Crick BASE-porų (mėlyna), nesutapimų (raudona). Žodis stipriausia koreliacija su Dauno reguliavimo buvo sėkla svetainė papildo subrendęs Mirna bazes 2-7 /8. (C) nuorašai, turintys 6mer arba 7mer Pasaulis-146A sėklų svetainių 3'UTR srities, kurie yra labiausiai žemyn reguliuojama ant Pasaulis-146A transfekciją rodomi. Tai yra potencialūs tiesioginiai Pasaulis-146A tikslai. Išraiška yra pateikta log2 kartų kaita. Į 3'UTR 6 m /7 m stulpeliai rodo numerius 6- arba 7mer Pasaulis-146A sėklų svetainių 3'UTR srities.
Tris labiausiai žemyn reguliuoja genus upon miR-146A per saviraiškos, IRAK1, kaspazės įdarbinimo domenas, kurių sudėtyje yra baltymų 10 (CARD10) ir COP9 steigiamasis photomorphogenic homologas subvieneto 8 (COPS8) (Fig.3C) visi priklauso signalo kelius, padedančią NF-κB aktyvavimo [27-29]. IRAK1 yra žinomas Pasaulis-146A tikslas dalyvauja TLR- ir IL-1R-tarpininkaujant aktyvavimo NF-κB [16-18]. CARD10 dalyvauja GPCR sąlygojamą aktyvavimo NF-κB [27], o COPS8 Manoma, kad dalyvauti šiame kelyje, remiantis jo dalyvavimo T ląstelių receptorių (TCR) sąlygojamą NF-κB aktyvacijos [28]. Stebėtinai, bet panašus į Boldin et al išvadas.
[30], išraiška TRAF6, kuriuo prieš tai buvo aprašyta kaip ir miR-146A tikslą [16, 18, 31], nebuvo sumažinta, transkripcijos lygio po to, Pasaulis-146A per išraiška mūsų modelis sistema.
skrandžio vėžio NF-κB moduliuoja ląstelių išgyvenimą, imunitetą ir uždegimą, ir NF-κB aktyvacijos asocijuojasi su prastos rezultatus skrandžio vėžio [32, 33]. Todėl mes sutelktas į apibūdinantys CARD10 ir COPS8 kaip tiesioginis Pasaulis-146A tikslus ir jų vaidmenį NF-κB aktyvacijos skrandžio vėžio. Mes patvirtino Pasaulis-146A-tarpininkaujant žemyn reguliavimo CARD10, COPS8 ir IRAK1 prie stenograma lygio (4a paveikslas), o taip pat nustatė, kad Pasaulis-146A sumažintas lygius CARD10, COPS8 ir IRAK1 baltymų (4b pav.) Galiausiai, tiesioginis nukreipimas miR-146A su 3'UTRs tikslinių genų buvo įrodyta naudojant liuciferazės tyrimai (4C pav.) Apibendrinant, mes patvirtino ankstesnes pastabas, įrodančius, kad Pasaulis-146A tiesiogiai skirta IRAK1 ir be to mes nustatė du naujus tikslus, CARD10 ir COPS8, kurie kodai baltymų siūlomus dalyvauti NF-κB aktyvacijos. COPS8 yra iš COP9 signalosome kuri susideda iš aštuonių subvienetų (GPS1 ir COPS2-8) [34] dalis. COPS8 yra vienintelis dalinys skirta tiesiogiai miR-146, tačiau nuo pakeistų atskirų padalinių suma buvo įrodyta, turi įtakos kitų padalinių sumą [35, 36], mes išanalizavome, kaip transfekcija su miR-146A įtakos išraiška visi COP9 signalosome komponentai. Be Nestimuliuotų ląstelėse COPS2 išraiška buvo sumažintas (20%) (papildomas failas1: S5 pav). Todėl mes manome, kad PPN-146A apie COP9 komplekso poveikis daugiausia kyla iš A COPS8 išraiškos mažinimą, nors netiesioginis destabilizacija komplekso negalima atmesti. 4 pav CARD10 ir COPS8 yra tiesioginiai Pasaulis-146A tikslai. (A), iRNR raiška dviejų naujų Pasaulis-146A tikslus, CARD10 ir COPS8 ir IRAK1, žinoma miR_146a tikslą, nulėmė qPCR į Kontrolės ir Pasaulis-146A-perkeltų SNU638 ląsteles. Išraiška kiekvieno transkripto yra parodyta, palyginti su kontrolinės transfekuota ląstelių išraiška. CARD10, COPS8 ir IRAK1 išraiška buvo žemyn reguliuojama šią MIR-146A pernelyg išraiška. Duomenys rodomi kaip vidurkis ± Š.D. iš keturių biologinių kopijomis. * = P < 0,05, ** = P < 0,01, *** = P < 0,001. (B), Pasaulis-146A transfekcija taip pat sumažino baltymų lygius CARD10, COPS8 ir IRAK1 į Pasaulis-146A-perkeltų SNU638 ląsteles. Kiekvieno baltymo ekspresija yra parodyta, palyginti su kontrolinės transfekuota ląstelių išraiška. Juostos buvo kiekybiškai palyginti su beta-aktino. Duomenys rodomi kaip vidurkis ± Š.D. iš keturių biologinių kopijomis. * = P < 0,05, ** = P < 0,01, *** = P < 0,001. (C), tikrinimas tiesiogiai ir funkcinio taikinio privalomas naudojant liuciferazės konstruktus laikančius WT 3'UTRs ir mutavo (Mut) 3'UTRs (centrinis 4 nukleotidų buvo pakeistas Pasaulis-146A privalomu aikštelės) CARD10, COPS8 ir IRAK1. Konstruktai, kurių sudėtyje yra arba WT ar mutavo (Mut) 3'UTRs pasroviui Firefly liuciferazės geno buvo bendrai perkeltų į HEK293 ląstelių kartu su Renilla liuciferazė valdymo plazmidžių ir arba miR-146A ar kontrolės (Siglo). Į kairę, liuciferazės veikla skiriama palyginti su aktyvumo kontrolės-perkeltų ląstelių. Pasaulis-146A sumažintas liuciferazės aktyvumą konstruktų su WT CARD10, COPS8 ir IRAK1 3'UTRs. Teisė, seka suderinimai PPN-146A ir galimo WT ir Mut 3'UTR tikslines svetaines rodomi, mutavo bazės rodomas raudonai. Duomenys rodomi kaip vidurkis ± Š.D. dažnai biologiniai kopijomis. *** = P < 0,001. Sekos suderinimai yra pritaikyta iš DIANALab (2009).
MIR-146A slopina GPCR-tarpininkaujant NF-κB veiklą nukreipiant CARD10 ir COPS8
CARD10 ir COPS8 dalyvauja GPCR tarpininkaujant aktyvavimo NF-κB [28, 29 ]. Todėl norėjome sukurti savo vaidmenis signalo perdavime skrandžio vėžiu, o vėliau tirti PPN-146A svarbą slopina šį signalizacijos. Šiam tikslui mes naudojamas lysophosphatiditc rūgšties (LPA), kuris yra žinomas aktyvatorius iš GPCR medijuojamo NF-κB-aktyvacijos keliu [29], ir skatina skrandžio vėžys ląstelių migraciją ir invazija [37]. LPA-stiumlation gerokai padidėjo NF-κB veikla mūsų liuciferazės reporteris sistemos (5 paveikslas). siRNR nokdaunas iš CARD10 ir COPS8 išraiška smarkiai slopino LPA stimuliuojamos GPCR tarpininkaujant aktyvavimo NF-κB į SNU638 ląstelių (5 paveikslas). Tai slopinimas buvo panašus į Mir-146A sukeltas slopinimo. Priešingai, slopina endogeninių Pasaulis-146A buvo be poveikio NF-κB aktyvacijos. Kaip prognozuojama, siRNR tarpininkaujant represijos IRAK1 išraiška neturėjo įtakos LPA stimuliuojamos aktyvavimo NF-κB (5 paveikslas) kaip IRAK1 nedalyvauja su GPCR tarpininkaujant kelią. Kaip TRAF6 yra Pasaulis-146A tikslinė su į NF-κB aktyvavimo vaidmenį, buvo ištirtas iš siRNA tarpininkaujant represijų TRAF6 išraiškos poveikis LPA stimuliuojamos NF-κB veikla. Tačiau nokdaunas iš TRAF6 neslopina LPA stimuliuojamos NF-κB veiklą (5 paveikslas). Šie rezultatai rodo, kad du naujai nustatytos Pasaulis-146A tikslus, CARD10 ir COPS8, dalyvauja GPCR sąlygojamą aktyvavimo NF-κB. Todėl miR-146A over-raiškos LPA stimuliuojamos NF-κB veiklos poveikis buvo tiriamas. Pasaulis-146A smarkiai slopino LPA stimuliuojamos NF-κB veiklą SNU638 ląstelių (5 paveikslas). Iš siRNAs prieš CARD10, COPS8, IRAK1 ir TRAF6 mišinys imitavo Mir-146A slopinamos NF-κB veiklos (5 paveikslas). Nokdaunas kitų dviejų COP9 komponentų (COPS2 ir COPS5) taip pat slopino LPA stimuliuojamos NF-κB veiklą, o tai rodo buvimo visų COP9 signalosome padaliniuose už LPA stimuliuojamos aktyvavimo NF-κB svarbą. qPCR iš skirtingų komponentų tirtų išraiškos patvirtino triuškinantis (5 paveikslas). 5 paveikslas Pasaulis-146A tikslai COPS8 ir CARD10 GPCR tarpininkaujant NF-κB aktyvacijos. SNU638 ląstelės buvo bendrai perkeltų su NF-κB reporteris plazmidžių ir Renilla liuciferazė valdymo plazmidžių kartu su kontrolės (Siglo), siRNA ar miR-146A. Ląstelės buvo stimuliuojama su 25 mkm LPA ir liuciferazės veikla buvo matuojamas. Liuciferazė veikla skiriama palyginti su veiklos kontrolės transfekuota LPA-stimuliuojami ląsteles. siRNR prieš CARD10 ir COPS8, PPN-146A, PPN-146A inhibitorių ir siRNR derinys sumažino liuciferazės veikla. siRNR prieš IRAK1 ir TRAF6 nesumažino liuciferazės veiklą. LPA-skatino NF-κB aktyvacijos taip pat buvo slopinamas siRNA prieš COPS2 ir COPS5, kuriais įrodoma, kad kita pasipiktinimas iš COP9 signalosome kompleksas sumažina GPCR-tarpininkaujant NF-κB aktyvacijos. siMix, sumaišykite siRNAs prieš CARD10, COPS8, IRAK1 ir TRAF6. Duomenys parodė, kaip vidurkis ± Š.D. Septynių biologinių kartotinių * = P <.; 0,05. Santykinis išraiška TRAF6, COPS8, IRAK1, CARD10, COPS2 ir COPS5 buvo matuojamas naudojant qPCR. Pilkai jautrūs rodo reikšmingą pokytį saviraiškos, p < 0,05, n = 4.
miR-146A išraiškos yra iš dalies kontroliuojama NF-κB. Todėl mes taip pat išbandyti, kaip miR-146A išraiška turėjo įtakos LPA ir IL-1β stimuliacijos. Mes nustatėme, kad LPA gydymas dvigubai PPN-146A ir IL-1β stimuliacijos išraišką davė 4 kartus padidinti Pasaulis-146A išraiška, kuri yra panaši į ankstesnes pastabas [16, 38] (Papildoma failas1: S6 pav). Nors Pasaulis-146A LNA padidino trijų Mir-146A tikslų (TRAF6, IRAK1 ir CARD10) išraišką (5 paveikslas) bendras aktyvavimo NF-κB nebuvo pakeista LPA stimuliuojamos Pasaulis-146A LNA elgiamasi SNU638 ląsteles.
Pasaulis-146A sumažina LPA sukeltos išraiška citokinų ir augimo faktorių
daugeliu karcinoma mikroklimato veiksniai, o ne genetiniai pakitimai yra turbūt atsakingas už aktyvuoti NF-κB signalizacijos, kuri reguliuoja kelis procesus, įskaitant sekrecijos augimo faktoriais ir citokinais [39, 40]. Taigi, mes ištirti, kaip Pasaulis-146A moduliuoja išraišką pasirinktų NF-κB reguliuojamų augimo faktoriais ir citokinais sukeltų už ląstelių signalus, pvz LPA. LPA-stimuliacija žymiai padidėjo išraiška interleukino-6, -8, 23A (IL-6, IL-8, IL-23A) ir chemokino (CC motyvas) ligandas 5 (CCL5), kolonijas stimuliuojančio faktoriaus 1 (makrofagų) (CSF- 1) ir trombocitų kilmės augimo faktorius beta polipeptidas (PDGFB) į SNU638 ląstelių (6 paveikslas). Tai patvirtino, kad išraiška šių genų reguliuoja LPA-sukeltos NF-κB aktyvumą. Per išraiškos PPN-146A gerokai sumažėjo išraiška IL-8, IL-23A, CCL5, KKM-1 ir PDGFB į SNU638 ląstelių (6 paveikslas). Nors IL-6 yra tikslinio geno NF-κB, taip pat aktyvinama iki LPA miR-146A per išraiškos nesumažino IL-6 išraišką mūsų sąlygomis (6 paveikslas). Tačiau LPA indukcija IL-6 išraiška ne tik tarpininkaujant NF-κB bet ir per kitus kelius (MAPK /ERK, PI3K /Akt ir p38) [41], kurios gali prisidėti prie skirtumų. Į SNU638 ląstelių bazinis lygis IL-6 yra didesnis nei IL-8, kuri gali turėti įtakos iRNR apyvartą. Tai gali būti viena iš priežasčių, kad Pasaulis-146A turi mažesnį poveikį LPA stimuliuojamos IL-6 raiškos nei ant IL-8 išraiška, kuri taip pat buvo pastebėtas kitų ląstelinių sistemų [42]. 6 pav Pasaulis-146A slopina LPA sukeltas citokinų išraiška. 25 mkm LPA buvo naudojama sukelti citokinų reiškinį iš žmogaus skrandžio karcinoma SNU638 ląsteles. LPA daug didesnis išraiška IL-6, IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 ir PDGFB, kuris buvo matuojamas naudojant qPCR ir parodyta, palyginti su ekspresijos lygio neapdorotų kontrolinių ląstelių. Šis atsakymas yra sumažintas Pasaulis-146A-perkeltų ląstelių. Duomenis, yra nurodyti kaip vidurkis ± Š.D., n = 4, * = P < 0.05, NS = nėra reikšmingas.
MIR-146A per išraiška SNU638 ląstelių sumažėja įdarbinimą monocitų
karcinoma monocitai gali būti įdarbintas pvz CCL5 ir CSF-1 auglio ląstelių išreikštas ir šis navikas infiltracija monocitų prisideda prie naviko-skatinti uždegiminio atsako į vėžio [39, 40]. Kuri įrodė, jog Pasaulis-146A sumažintas LPA sukeltas išraišką citokinų, mes išanalizavome, kaip Pasaulis-146A per išraiškos įtakos įdarbinimo monocitų. Mes nustatėme, kad LPA apdorojimas SNU638 ląstelių padidėjo monocitų migraciją link sąlygoja vidutinio iš SNU638 ląstelių (7 pav ir Papildoma failas1: S7 paveikslas), o transfekcija su miR-146A iš dalies panaikintas, šį atsakymą (7 pav), vėl parodoma, kad miR -146a slopina biologinius atsakus GPCR sąlygojamą aktyvavimo NF-κB, tokių kaip, įdarbinimo monocitų. 7 pav Pasaulis-146A sumažina monocitų migracija. Monocitų migracija prieš apdorotas laikmenoje Kontrolės arba Pasaulis-146A-perkeltų SNU638 ląstelių, kurios buvo negydoma arba skatino su 25 mikromolių LPA buvo stebimi per 8 valandas. Migracija ląsteles yra parodytas, palyginti su migracijos neapdorotų kontrolinių ląstelių. Monocitų migracija prieš laikmenoje LPA stimuliuojamos SNU638 ląstelių buvo padidintas, palyginti su migracija prieš laikmenoje neapdorotų ląstelių, o monocitų migracija prieš vidutinio MIR-146A-perkeltų, LPA stimuliuojamos ląstelės buvo sumažėjęs, lyginant su laikmenoje kontrolės perkeltų, LPA-skatino ląstelės. Duomenys rodomi kaip vidurkis ± Š.D. iš keturių biologinių kopijomis. ** = P < 0,01, ns = ne reikšmingas.
Diskusijos
mikroklimato veiksnių yra svarbūs NF-κB aktyvavimo uždegimas varoma vėžio, pavyzdžiui, skrandžio vėžiui ir šio NF-κB aktyvavimo gali teikti vėžines ląsteles su privalumais, kurie prisideda prie tumorgenic procesai [32, 43]. Moduliacija NF-κB įsijungiantis signalizacijos Todėl svarbu kontroliuoti uždegimas tarpininkaujant naviko vystymąsi. Čia mes parodysime, kad Pasaulis-146A yra pagrindinis neigiamas reguliatorius NF-κB aktyvavimo, kadangi jis slopina keletas NF-κB įsijungiantis kelius.
Pasaulis-146A išraiška buvo nustatyta iki-reguliuojami app. 03/02 iš žmogaus skrandžio adenokarcinomos, taip pat kaip ir gastrino KO pelės modelio skrandžio vėžio. Panašiai, išraiška miR-146A buvo nustatyta, padidėjo gimdos kaklelio, krūties, kasos ir skydliaukės vėžio [11, 44-46]. Anksčiau išraiška miR-146A buvo rasta tiek aukštyn ir žemyn reguliuojama skrandžio vėžio [21-24]. Šie prieštaringi rezultatai gali atspindėti skirtumus navikų ir jų mikroaplinka, dėl įvairių laipsnių NF-κB veiklą, kuri kontroliuoja Pasaulis-146A išraišką [16]. Keista, mes nustatėme, mažas PPN-146A žmogiškųjų skrandžio vėžio ląstelių linijas. Tai gali reikšti, kad padidėjęs Pasaulis-146A lygiai pastebėti navikai yra coursed iki mikroklimato veiksnių pvz ląstelės, supančios navikines ląsteles.
išnagrinėti padidėjo Pasaulis-146A lygių poveikį skrandžio vėžio mes nustatyti du naujus Pasaulis-146A tikslus, CARD10 ir COPS8 ir tyrė šių tikslų vaidmenis. Mes nustatėme, kad Pasaulis-146A slopinamas GPCR-tarpininkaujant NF-κB aktyvacija tiesiogiai nusitaikyti ir žemyn reguliavimo išraišką CARD10 ir COPS8. CARD10 yra žinoma, kad būti reikalaujama GPCR sukeltos aktyvavimo NF-κB [27, 29], o COPS8 yra COP9 signalosome subvieneto, kuri kontroliuoja NF-κB aktyvacijos [28, 47]. Mes parodėme, kad CARD10 dalyvauja GPCR sąlygojamą aktyvavimo NF-κB, ir jei naujų įrodymų, kad COPS8 yra įtrauktas į šį kelio, taip pat. Pasaulis-146A per išraiška taip pat lėmė sumažėjusios išraiška COPS2, kitoje COP9 signalosome subvieneto. Manome, kad tai yra netiesioginis poveikis, nes nėra Pasaulis-146A privalomas svetainė COPS2 3'UTR srities ir buvo įrodyta, pokyčiai vienoje subvieneto išraiškos paveikti, kad kitos [35, 36]. Todėl įmanoma, kad Pasaulis-146A tam tikru mastu gali veikti ne tik nukreipti COPS8 bet destabilizuoti COP9 signalosome.
Neįprastos signalizacijos per GPCRs buvo susijęs su naviko ląstelių augimui ir išlikimui, ir NF-κB įsijungiantis GPCRs buvę parodė, prisidėti prie įvairių vėžio (įvertintų pagal Dorsam & Gutkind [48]). GPCRs galite įjungti NF-κB per Viesbutis The CARD10 /BCL10 /MALT1 komplekso po ligandus pavyzdžiui, LPA, enothelin-1, angiotenzino II (Ang II) ir chemokino (CXC motyvas) ligando 12 (CXCL12) (8 pav) [ ,,,0],29, 49]. Mūsų tyrime mes naudojome LPA modeliuoti GPCR-tarpininkaujant aktyvavimo NF-κB. LPA sukeltos GPCR signalizacijos laidus iki naviko progresavimo [49]. Tokiu būdu, miR-146A-slopinamos GPCR-signalizacijos gali turėti auglio slopinant poveikį. 8 paveiksle Pasaulis-146A tikslai daug NF-κB aktyvinimo būdus. Schematiškai iliustruoja NF-κB įsijungiantis kelius. Pasaulis-146A anksčiau buvo įrodyta, kad nukreipti IRAK1 ir TRAF6 ir šiame tyrime mes parodome, kad Pasaulis-146A skirta CARD10 ir COPS8. Pasaulis-146A tikslai yra pažymėti raudonu apskritimu.
Be GPCR sąlygojamą NF-κB aktyvavimo, NF-κB gali būti aktyvuota per pervežimas naviko nekrozės faktoriaus receptoriaus-(TNFR), IL-1R, TLR, TCR ir B ląstelių receptorių (BCR) [50] (8 pav.) Anksčiau, PPN-146A buvo slopina NF-κB aktyvavimo per
šių receptorių žemyn reguliavimo išraiška TRAF6 ir IRAK1 [16, 18, 30, 31]. Pasaulis-146A skirta IRAK1 skrandžio vėžio ląsteles, bet ne TRAF6. Nors, mes čia rodo, kad miR-146A skirta GPCR-sužadinti NF-κB, be to, suaktyvinimo per
TNFR, IL-1R, TLR, TCR ir BCR, nukreipiant CARD10 ir COPS8 (8 pav). Taigi, PPN-146A orientuota į daugelį komponentų NF-κB įsijungiantis kelius skrandžio vėžio ląsteles. Tai nebuvo įrodyta, kad NF-κB keliu anksčiau, tačiau anksčiau buvo vertinama atsižvelgiant į transformuojantis augimo faktorius-ß (TGF-beta) keliu, kur tiek MIR-21 ir Mir-17-92 klasteris tikslinės keletas mRNR koduojančio baltymų, TGF-beta keliu [51, 52]. Nukreipiant kelis komponentus skirtingų NF-κB įsijungiantis kelius Pasaulis-146A tarpininkauja tvirtą ir sudėtingą kontrolės NF-κB veikla. Keletas kitų miRNAs taip pat gali reguliuoti NF-κB signalų, tačiau tik Pasaulis-146A tikslai keletą genų skirtingų NF-κB įsijungiantis kelius, rodančių MIR-146A kaip pagrindinis moduliatorius NF-κB aktyvacijos.
NF-κB reguliuoja išraiška citokinų ir augimo faktorių, dalyvaujančių keletą aspektų naviko progresavimo [43]. Atsižvelgiant į tai, kad Pasaulis-146A mažėja NF-κB veiklą, tai yra įmanoma, kad Pasaulis-146A veikia naviko sulaiko mažinant išraiška tokių citokinų ir augimo faktorių. Iš tiesų, mes nustatėme, kad Pasaulis-146A per išraiška sumažėjo išraiška kelių citokinų ir augimo faktorių su žinomu vaidmenį vėžio vystymąsi; IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 ir PDGFB. Šie genai gali padidinti ląstelių proliferaciją, ląstelių sukibimą ir angiogenezę [53-55], prisideda prie naviko limfangiogenezės [56], aktyvuokite fibroblastai [57], įdarbinti monocitų navikai [39, 40] ir paskatinti naviku susijusių makrofagai (TAM) iki sekretuoja augimą skatinantį tarpininkai [58] (9 pav.) 9 pav biologinius procesus skrandžio vėžio ląsteles slopina miR-146A. Kairiajame skydelyje, PPN-146A tiesiogiai skirta IRAK1, CARD10 ir COPS8 į SNU638 ląsteles. Tai veda prie slopinimu NF-κB aktyvavimo, ir todėl, kad nuslopintos išraiška NF-κB reguliuojamų citokinų ir augimo faktorių. Išraiška miR-146A taip pat reglamentuoja NF-κB [16]. Dešinėje pusėje, PPN-146A sumažėja išraiška CCL5, KKM-1, IL-8, PDGF ir IL-23A, kuri dalyvauja monocitų migracijos ir diferenciacijos, dauginimosi, angiogenezę, limfangiogenezės ir fibroblastų ir makrofagų augimo faktoriaus spaudai. Taigi, PPN-146A gali veikti kaip naviko slopintuvas mažinant vėžį skatinančius NF-κB veiklos.
Chemotaksinio citokinus išleistas vėžinių ląstelių gali įdarbinti monocitų naviko svetainių [39, 59]. Šie monocitai gali skatinti naviko progresavimas [60]. CCL5 ir KSF-1 pavyzdžiai monocitų-įdarbinti citokinų išleistas vėžinių ląstelių [39, 40]. Kaip ir tikėtasi, monocitai migravo mažiau prieš apdorotas laikmenoje LPA stimuliuojamos SNU638 ląstelių per išreikšti MIR-146A, palyginti su LPA stimuliuojamos kontrolinių ląstelių. 0,05. Visi autoriai skaityti ir patvirtino galutinį rankraštį.

• Kartu Padidėjusi serumo p53 mutacijos, susijusios su Helicobacter pylori infekcija
• Intraneural metastazės skrandžio karcinoma sukelia sėdimojo nervo palsy