microRNA-146a inhiboi G-proteiiniin kytketty reseptori-välitteisen NF-KB: n kohdistamalla CARD10 ja COPS8 mahalaukun cancer

microRNA-146a inhiboi G-proteiiniin kytketty reseptori-välitteisen NF-KB: n kohdistamalla CARD10 ja COPS8 mahasyövän
tiivistelmä
tausta
Mahalaukun syöpä on toiseksi yleisin syy syöpään liittyvät kuolemat maailmassa. Tulehduksellinen signaaleja peräisin mahasyövän solut ovat tärkeitä rekrytoida tulehdussolujen ja sääntelyä etäpesäke mahasyövän. Useat MikroRNA (miRNA) on osoitettu olevan osallisena kehittymistä ja etenemistä mahasyövän. miRNA-146a (miR-146a) on modulaattori tulehduksellisten signaalien mutta vähän tiedetään sen merkitys mahasyövän. Siksi halusimme kohteiden tunnistamiseen Mir-146a mahasyövän ja tutkia sen biologisia rooleja.
Tulokset
ilmentyminen miR-146a arvioitiin kvantitatiivinen PCR (qPCR) ja todettu säädellään ylöspäin gastriini hiirien , hiirimallissa mahasyövän ja 73% tutkituista ihmisen mahalaukun adenokarsinooman. Expression of miR-146a mahalaukun syövän solujen varmistettiin in situ
hybridisaatio. Global muutosten analysointi mRNA jälkeen miR-146a transfektio tunnistetaan kaksi selostukset, kaspaasi rekrytointi domain sisältävä proteiini 10 (CARD10) ja COP9 signalosomi monimutkainen alayksikköä 8 (COPS8), kun uusi miR-146a tavoitteita. qPCR, Western blotting ja Lusiferaasimäärityksiä vahvisti nämä selostukset suorana miR-146a tavoitteita. CARD10 ja COPS8 osoitettiin olevan osa G-proteiiniin kytketty reseptori (GPCR) polun Nukleaaritekijä-kappaB (NF-kappaB) aktivointi. Lysofosfatidihappo (LPA) indusoi NF-kappaB aktivointi
tämän reitin ja yli-ilmentyminen miR-146a inhiboi LPA-indusoidun NF-kappaB aktivointi, vähentää LPA-indusoidun ilmentymisen kasvaimen edistävien sytokiinien ja kasvutekijöiden ja estivät monosyyttien vetovoima .
Johtopäätökset
miR-146a ilmentyminen on säädelty useimmissa syöpien missä se on suunnattu CARD10 ja COPS8, estämällä GPCR-välitteisen NF-kappaB, mikä vähentää ilmentymistä NF-kappaB-säännelty kasvain- edistämällä sytokiinien ja kasvutekijöiden. Kohdistamalla komponentteja useita NF-kappaB aktivoiva kulkuväylillä miR-146a on keskeinen osa sääntelyä NF-kappaB aktiivisuutta.
Avainsanat
Mahasyöpä koodaamattomalla RNA Sytokiinit Taustaa
Maailmanlaajuisesti mahasyöpä on toiseksi yleisin syy syövän liittyvän kuoleman [1]. Mahasyövän vaikuttaa vuorovaikutuksia isäntä, ympäristö- ja bakteerien tekijöistä. Esimerkkejä synergisen riskitekijät mahasyövän ovat polymorfismit geenien isännän tulehdusvastetta [2], Helicobacter pylori
(H. pylori
) virulenssitekijät [3] ja ruokavalion runsaasti suolaa ja nitraatti [4] . Huolimatta viimeaikaisesta edistyksestä havaitsemiseen ja hoitoon varhaisen mahasyövän, pitkän aikavälin eloonjäämistodennäköisyys edennyt mahasyöpä on alhainen [5]. Suurimmat haasteet hoidossa edennyt mahasyöpä ovat imusuonten, vatsakalvon tai kaukaisia ​​elin etäpesäkkeitä, joka samalla ennustaa huono tulos näille potilaille [6].
Vaikka monet onkogeenien ja tuumorisuppressoreita on raportoitu olevan mukana kehittämisessä mahakarsinoomat , molekyylitason mekanismit etäpesäkkeiden pitkälle mahakarsinoomat tunnetaan edelleen huonosti [7]. Yksi tärkeimmistä tapahtumista mahasyövän on tulehdus. Tulehdus johtaa aktivoitumiseen transkriptiotekijän tumatekijä-kappaB (NF-KB), joka on liitetty mahasyövän [8, 9].
MikroRNA (miRNA) ovat mukana kehittymistä ja etenemistä mahasyövän [10- 13]. miRNA on luokan endogeenisten ei-koodaus, yksijuosteisia RNA-molekyylejä app. 22 nukleotidin, jotka välittävät transkription jälkeinen geenin ilmentymisen säätelyyn emäspariutumisen kautta kanssa 3'alue (UTR) kohde lähetti-RNA (mRNA) [14]. miRNA osallistuvat sääntelyn useimpien sellulaaristen prosessien myös solujen jakautumista, migraatiota ja apoptoosin [10, 14, 15]. miRNA ovat poikkeavasti ilmaistaan ​​useimmissa ihmisen syövissä ja, kuten proteiini-koodaus geenit, miRNA voivat toimia joko tuumorisuppressorien tai onkogeenien, säädeltyä karsinogeneesin [10, 12]. miRNA-146a (miR-146a) säätelee NF-KB: n ja estää interleukiini-1-reseptorin (IL-1R) ja toll-like-reseptori (TLR) - indusoidun NF-KB: n kohdistamalla interleukiini-1-reseptoriin liittyvän kinaasin 1 (IRAK1) ja TNF-reseptori liittyy tekijä 6 (TRAF6) [16-18]. miR-146a on raportoitu poikkeuksellisesti ilmaistu useissa tulehdustautien ja syöpiin, mutta rooli miR-146a mahasyövän on yhä kiistanalainen, koska ilmentyminen miR-146a on löydetty sekä ylä- ja alassäädetty tästä [19-24 ]. Siksi tutkimme ilmaus miR-146a mahasyövän ja ominaista sen tavoitteita ja molekyylitason toimintojen selventää ristiriitaisia ​​havaintoja.
Huomasimme, että miR-146a on säädelty hiirimallissa mahasyövän sekä ihmisen mahalaukun adenokarsinoomia ja tunnistettu CARD10 ja COPS8 uusina kohdistu suoraa miR-146a. Molemmat ovat osa G-proteiiniin kytketty reseptori (GPCR) -välitteisen signaalitransduktion, joka välittää NF-KB. Tämä viittaa siihen, että miR-146a toimii kasvaimen tukahduttava estämällä GPCR-välitteisen NF-KB: n ja tuloksena ilmentyminen kasvaimen edistävien sytokiinien ja kasvutekijöiden.
Tulokset
miR-146a ilmentyminen on säädelty in hiiren malli mahasyövän ja ihmisen mahalaukun adenokarsinooman
Gastrin knockout (KO) hiiret ovat hapoton ja kehittää suoliston metaplasiaa ja mahalaukun adenoomia ajan [25]. Käyttämällä kvantitatiivinen PCR (qPCR) löysimme ilmentymistä miR-146a-sovellus. 2-kertainen säädellään ylöspäin vanhassa gastriini KO hiiriä joko fundic suoliston metaplasiaa tai antral adenooma verrattuna ilmentymisen villityypin (WT) hiiret (P < 0,05) (kuvio 1A). Käyttäen in situ
hybridisaatio miR-146a havaittiin metaplastiset mahalaukun kudosta gastriini KO-hiirissä, mutta ei normaalissa mahalaukun kudosta WT-hiirissä (kuvio 2AB) (Additional file1: Kuva S1). Todettuaan, että miR-146a on kasvanut meidän hiirimallissa mahasyövän tutkimme ilmentymistä miR-146a in pariksi ihmisen mahalaukun adenokarsinoomia ja viereisen ohjaus koepaloja ja totesi, että se oli säädellään ylöspäin 27 ulos 37 tapauksessa (73%) ( kuvio 1 B). In situ
-hybridisaatio osoitti, että miR-146a ilmaistiin ihmisen mahan adenokarsinooman soluja, kun taas miR-146a-positiivisia soluja ei havaittu normaalissa mahalaukun limakalvon (kuvio 2CD) (Additional file1: Kuva S1). Kuva 1 lisääntynyt ilmentyminen miR-146a gastriini KO hiiren mahasyövässä malli ja ihmisen mahasyövän. (A) Suhteellinen ilmentyminen miR-146a in metaplastiset fundic kudoksessa (n = 8) ja hyperplastic antral limakalvo (n = 4) /antral adenoomia (n = 4) gastriini Knockout (KO) hiiriä verrattuna keskimääräiseen ilmaisua matching villityypin (WT) hiirikudoksessa. * = P < 0,05. (B) vesiputous käyrä ilmentymisen miR-146a 37 ihmisen mahalaukun adenokarsinoomia suhteessa ilmaisun viereisissä normaalia kudosta. miR-146a oli säädellään ylöspäin 27 ulos 37 kasvaimia (73%). Ilmentymistasojen miR-146a määritettiin qPCR ja normalisoitiin kuin endogeenisen valvonnan RNU44.
Kuvio 2 in situ -hybridisaatio havaitseminen miR-146a ilmentymisen gastriini KO hiiren mahasyövän mallin ja ihmisen mahasyövän. (A) Expression of miR-146a ei havaittu WT fundic hiiren kudosta, (B), kun taas miR-146a-positiivisten solujen (siniset tumat) havaittiin metaplastiset fundic kudoksen gastriini KO-hiirissä. (C) Mitään signaalia ei havaittu sekoitetun LNA anturi. (D) miR-146a ilmentyminen oli poissa normaaleissa ihmisen mahalaukun kudoksesta, (E), mutta läsnä ihmisen mahalaukun adenokarsinooman soluja (sininen ytimet). (F) Negatiivinen kontrolli käyttämällä salattu LNA anturi. Edustaja miR-146a-positiivisten solujen on osoitettu nuolilla. Alkuperäinen suurennos x20, Mittakaava = 100 pm.
Ei ollut korrelaatiota miR-146a ilmentymistä mahalaukun adenokarsinooman ja potilaiden iästä, sukupuolesta ja lokalisointi tai luokittelua kasvaimia (tuloksia ei esitetty). Vaikka potilaille, joilla on korkea miR-146a ilme näytti olevan parempi yleinen eloonjääminen tämä ei ollut merkitsevä (Additional file1: Kuva S2).
MiR-146a tavoitteet jäsenten GPCR-välitteisen NF-KB-reitin
osoittaneen lisääntynyt ilmentyminen miR-146a useimmissa syöpien, halusimme vahvistaa biologisten vaikutusten miR-146a tunnusomaiset piirteet sen suoran molekyylikohteista ihmisen mahasyövän. Halusimme tehdä tämän yli-ilmentävät miR-146a mahalaukun syöpäsoluissa ja sitten tunnistaa mRNA: t, joilla on alentunut ilme [26]. Siksi tutkimme miR-146a ilmentymisen paneelia solulinjojen ja todettu vaihtelevia, mutta yllättävän alhainen ilmentyminen miR-146a on käytettävissä mahalaukun solulinjoissa (Additional file1: Kuva S3), ottaen huomioon havaitut yli-ilmentyminen kasvaimissa.
ihmisen mahalaukun syövän solulinja SNU638, joka on merkityksetön tasot endogeenisen miR-146a todettiin soveltuu miR-146a over-ilmentyminen tutkimukset. Koska miR-146a ilmentyminen oli hyvin alhainen testattu mahalaukun solulinjojen miR-146a esto ei ole tehty.
Ensin testataan jos yli-ilmentyminen miR-146a vaikutti kasvuun SNU638 solujen ja löysi solujen kasvua ennallaan ( Muita tiedosto1: Kuva S4). Sen jälkeen, globaali muutoksia geenien ilmentymisen SNU638 soluissa yli-ilmentyminen miR-146a tutkittiin. Sen jälkeen miR-146a transfektio mRNA: iden ennustettu 3'UTR miR-146a kohdesivustot olivat merkitsevästi alassäädetty verrattuna mRNA: iden ilman ennustetun tavoitteet sivustoja (P < 4.6e-11, kaksisuuntainen Wilcoxonin-sum test) (kuvio 3A) . Analysoimme kaikki pituisia sanoja 5-7 yli-edustus alassäädetty mRNA: t jälkeen miR-146a transfektio ja löysi sanan vahvin korreloi alassäätöä oli siemen sivuston täydentävä kypsyä miR-146a emäkset 2-7 /8 ( kuvio 3B). Tekstitystiedostojen kanssa ennusti 3'UTR miR-146a kohdesivustot jotka olivat huomattavasti alassäädetty upon miR-146a transfektion pidettiin mahdollisina suoraan miR-146a tavoitteita. 847 Hyväksytty nämä kriteerit (Additional file1: Taulukko S5). Top 10 alassäädetty potentiaali miR-146a tavoitteet on esitetty kuvassa 3C. Negatiivisena validointi ohjaus toistimme menettelyä hoitoon SNU638 solut miR-146a LNA estäjä. Ei ollut mitään merkittävää säätely ylöspäin geenejä siemenen päällä täydentävät kypsyä miR-146a emäkset (tuloksia ei ole esitetty). Kuvio 3 tunnistaminen miR-146a tavoitteita. (A) ennustettu miR-146a tavoite transkriptit ovat merkittävästi alassäädetty jälkeen miR-146a transfektiolla verrattuna ilmaisi geenejä, joita ei ennustettu tavoitteita miR-146a (P < 4.6e-11, kaksisuuntainen Wilcoxonin-sum test) . (B) Top 10 sanaa eniten korreloi alassäätöä (korrelaatio Z-score on merkitty vasemmalle jokaisen sanan, kaikki 10 sanaa on arviolta FDR < 1e-6). Isot kirjaimet korosta miRNA siemenen alueelle, Watson-Crick emäsparia (sininen), epäsuhta (punainen). Sana vahvin korreloi alassäätöä oli siemen sivuston täydentävä kypsyä miRNA emäksiä 2-7 /8. (C) Transcripts, joilla 6mer tai 7mer miR-146a siemen sivustoja 3'UTR, jotka ovat kaikkein alassäädetty upon miR-146a transfektiota näkyvät. Nämä ovat mahdollisia suoria miR-146a tavoitteita. Expression annetaan log2 kertaluokkamuutos. 3'UTR 6 m /7 m sarakkeet osoittavat numerot 6- tai 7mer miR-146a siemen sivustoja 3'UTR.
Kolme alas geenien upon miR-146a yliekspressio, IRAK1, kaspaasi rekrytointi verkkotunnuksen sisältävä proteiini 10 (CARD10) ja COP9 konstitutiivinen photomorphogenic homologi alayksikön 8 (COPS8) (kuvio 3C), kuuluvat kaikki signalointireittien NF-KB: n aktivaation [27-29]. IRAK1 on tunnettu miR-146a tavoite mukana TLR- ja IL-1R-välitteinen NF-KB: n [16-18]. CARD10 on mukana GPCR-välitteisen NF-KB: n [27], kun taas COPS8 uskotaan olevan mukana tämän reitin, joka perustuu sen osallistumisesta T-solureseptorin (TCR) -välitteisen NF-KB [28]. Yllättäen mutta samanlainen havainnot Boldin et al.
[30], ilmentyminen TRAF6, joka on aiemmin kuvattu miR-146a tavoite [16, 18, 31], ei pienentää transkription tason jälkeen miR-146a yli-ilmentyminen mallimme järjestelmässä.
mahasyövän, NF-KB moduloi solujen eloonjäämistä, immuniteetti ja tulehdus, ja NF-KB: n aktivaatio liittyy huono lopputulos mahasyövässä [32, 33]. Siksi keskittyneet luonteenomaiset CARD10 ja COPS8 suorana miR-146a tavoitteet ja niiden roolit NF-KB mahasyövän. Olemme vahvistaneet miR-146a-välitteinen säätely alaspäin CARD10, COPS8 ja IRAK1 klo transkripti tasolla (kuvio 4A) ja totesi myös, että miR-146a alhaisempia CARD10, COPS8 ja IRAK1 proteiinia (kuvio 4B). Lopuksi, kohdistaminen suoraan miR-146a on 3'UTRs kohdegeenien osoitettiin käyttäen Lusiferaasimäärityksiä (kuvio 4C). Yhteenvetona vahvisti aiemmat havainnot, jotka osoittavat, että miR-146a suoraan tavoitteet IRAK1 emmekä lisäksi tunnistettiin kaksi uutta tavoitteita, CARD10 ja COPS8, joka koodaa proteiineja ehdotti olla mukana NF-KB: n aktivoitumisen. COPS8 on osa COP9 signalosomi, joka koostuu kahdeksasta alayksiköt (GPS1 ja COPS2-8) [34]. COPS8 on ainoa alayksikkö suunnattu suoraan miR-146, mutta koska muutos määrää yksittäisten alayksiköiden on osoitettu vaikuttavan määrän muita alayksiköitä [35, 36], tutkimme kuinka transfektion miR-146a vaikuttaa ilmaus kaikki COP9 signalosomi komponentteja. Stimuloimattomissa soluissa ekspressiota COPS2 väheni (20%) (Muut file1: Kuvio S5). Siksi oletetaan, että vaikutukset miR-146a on COP9 monimutkainen pääasiassa seurausta väheneminen COPS8 ilmaisua, vaikka epäsuora epävakautta kompleksin ei voida sulkea pois. Kuva 4 CARD10 ja COPS8 ovat suoria miR-146a tavoitteita. (A) mRNA ilmaus kaksi uutta miR-146a tavoitteet, CARD10 ja COPS8, ja IRAK1, tunnettu miR_146a tavoite, määritettiin qPCR in ohjaus- ja miR-146a-transfektoitujen SNU638 soluissa. Expression kunkin transkriptin on esitetty suhteessa ilmentymisen kontrolli-transfektoiduissa soluissa. CARD10, COPS8 ja IRAK1 ilmentyminen alassäädetty seuraavat miR-146a yli-ilmentyminen. Data näytetään keskimääräisenä ± S.D. neljä biologista rinnakkaisnäytettä. * = P < 0,05, ** = P < 0,01, *** = P < 0,001. (B) miR-146a transfektio vähensi myös proteiinin tasot CARD10, COPS8 ja IRAK1 in miR-146a-transfektoitujen SNU638 soluissa. Jokaisen näistä proteiinin on esitetty suhteessa ilmentymisen kontrolli-transfektoiduissa soluissa. Kvantitoitiin suhteessa P-aktiini. Data näytetään keskimääräisenä ± S.D. neljä biologista rinnakkaisnäytettä. * = P < 0,05, ** = P < 0,01, *** = P < 0,001. (C) todentaminen suora ja toimiva kohde sitova käyttämällä lusiferaasia konstruktioita tilalla WT 3'UTRs ja mutatoitunut (Mut) 3'UTRs (Keski 4 nukleotidin uusittiin miR-146a sitoutumiskohta) varten CARD10, COPS8 ja IRAK1. Konstruktit, jotka sisältävät joko WT tai mutatoitu (Mut) 3'UTRs alavirtaan tulikärpäsen lusiferaasi-geeni kotransfektoitiin HEK293-soluihin yhdessä Renilla lusiferaasin ohjaus plasmidi ja joko miR-146a tai ohjaus (siglo). Vasen, lusiferaasiaktiivisuus annetaan suhteessa toiminnan valvonta-transfektoiduissa soluissa. miR-146a vähensi lusiferaasiaktiivisuutta konstruktit WT CARD10, COPS8 ja IRAK1 3'UTRs. Oikea sekvenssijärjestystä Mir-146A ja mahdollisten WT ja Mut 3'UTR kohdekohtia esitetään, mutatoitunut emäkset näkyvät punaisella. Data näytetään keskimääräisenä ± S.D. usein biologinen rinnakkaista. *** = P < 0,001. Sekvenssirinnastukset on mukautettu DIANALab (2009).
MiR-146a inhiboi GPCR-välitteisen NF-KB: n aktiivisuuden kohdistamalla CARD10 ja COPS8
CARD10 ja COPS8 ovat mukana GPCR-välitteisen NF-KB: n [28, 29 ]. Siksi halusi perustaa niiden roolit signaalitransduktion mahasyövän ja sen jälkeen tutkia, miten tärkeää on miR-146a estämään tätä signalointi. Tätä tarkoitusta varten käytimme lysophosphatiditc happoa (LPA), joka on tunnettu aktivaattori GPCR-välitteisen NF-KB-aktivaatioreitin [29], ja edistää mahalaukun syövän solujen vaeltamiseen ja invaasiota [37]. LPA-stiumlation huomattavasti NF-KB: n aktiivisuuden meidän lusiferaasireportterisysteemillä (kuvio 5). siRNA knockdovvn CARD10 ja COPS8 ilmentyminen merkitsevästi inhiboi LPA-stimuloitujen GPCR-välitteisen NF-KB: SNU638 soluissa (kuvio 5). Tämä inhibitio oli verrattavissa miR-146a-indusoidun inhibition. Sen sijaan, estämällä endogeeninen miR-146a ollut vaikutusta NF-KB: n aktivaation. Kuten ennustettiin, siRNA-välitteinen tukahduttaminen IRAK1 ilmaisua ei vaikuttanut LPA-stimuloidun NF-KB: n (kuvio 5), kuten IRAK1 ei osallistu GPCR-välitteisen reitin. Koska TRAF6 on miR-146a kohdistaa rooli NF-KB: n aktivoitumisen, vaikutus siRNA-välitteisen tukahduttamisesta TRAF6 ilmaisun LPA-stimuloi NF-KB: n aktiivisuutta tutkittiin. Kuitenkin, pudotus ja TRAF6 ei estänyt LPA-stimuloimaa NF-KB: n aktiivisuuden (kuvio 5). Nämä tulokset osoittavat, että kaksi äskettäin tunnistettu miR-146a tavoitteet, CARD10 ja COPS8, ovat mukana GPCR-välitteisen NF-KB: n. Siksi vaikutus miR-146a over-ilme LPA-stimuloi NF-KB: n aktiivisuutta tutkittiin. miR-146a inhiboi merkittävästi LPA-stimuloitujen NF-KB: n aktiivisuutta SNU638 soluissa (kuvio 5). Sekoitus siRNA: iden vastaan ​​CARD10, COPS8, IRAK1 ja TRAF6 jäljitteli miR-146a-välitteinen NF-KB: n aktiivisuuden (kuvio 5). Pudotus kahden muun COP9 komponenttien (COPS2 ja COPS5) inhiboi myös LPA-stimuloidun NF-KB: n aktiivisuuden, mikä osoittaa, että on tärkeää se sisältää kaikki COP9 signalosomi alayksiköitä varten LPA-stimuloidun NF-KB: n. qPCR ilmentymisen eri komponenttien tutkittiin vahvisti pudotus (kuvio 5). Kuvio 5 miR-146a tavoitteet COPS8 ja CARD10 GPCR-välitteisen NF-KB: n aktivaation. SNU638 solut kotransfektoitiin NF-KB reportteriplasmidilla ja Renilla lusiferaasin ohjaus plasmidiin yhdessä ohjaus (Siglo), siRNA tai miR-146a. Soluja stimuloitiin 25 uM LPA, ja lusiferaasiaktiivisuus mitattiin. Lusiferaasiaktiivisuutta annetaan suhteessa toiminnan kontrollitransfektoidut LPA stimuloiduista. siRNA vastaan ​​CARD10 ja COPS8, miR-146a, miR-146A estäjän että siRNA yhdistelmä vähensi lusiferaasiaktiivisuutta. siRNA vastaan ​​IRAK1 ja TRAF6 ei pienentänyt lusiferaasiaktiivisuus. LPA-stimuloitujen NF-KB: n aktivaatio inhiboi myös siRNA vastaan ​​COPS2 ja COPS5, mikä osoittaa, että muut häiritseekin COP9 signalosomi monimutkainen vähentää GPCR-välitteisen NF-KB: n aktivaation. siMix, sekoita siRNA: iden vastaan ​​CARD10, COPS8, IRAK1 ja TRAF6. Data on esitetty keskiarvona ± S.D. Seitsemän biologisten toistojen. * = P < 0,05. Suhteellinen ilmentyminen TRAF6, COPS8, IRAK1, CARD10, COPS2 ja COPS5 mitattiin käyttäen qPCR. Gray-varjostus todetaan merkittävä muutos ilmaisun, p < 0,05, n = 4.
ilmentyminen miR-146a on osittain ohjataan NF-KB. Siksi testattiin myös miten ilmaus miR-146a vaikuttivat LPA ja IL-1β stimulaatiota. Olemme havainneet, että LPA hoito kaksinkertaistunut ilmentymistä miR-146A ja IL-1β stimulaation antoi 4-kertainen nousu miR-146a ilmaisua, joka on verrattavissa aikaisempien havaintojen [16, 38] (Additional file1: Kuva S6). Vaikka miR-146a LNA lisääntynyt ilmentyminen kolme miR-146a tavoitteet (TRAF6, IRAK1 ja CARD10) (kuvio 5) koko NF-KB ei muuttunut LPA-stimuloiduissa miR-146a LNA käsiteltyjen SNU638 soluja.
miR-146a pienentää LPA-indusoidun sytokiinien ja kasvutekijöiden
useimmissa karsinoomat microenvironmental tekijöiden sijaan geneettiset muutokset ovat todennäköisesti vastuussa aktivoimalla NF-KB: n signalointia, joka säätelee useita prosesseja, mukaan lukien erittymisen kasvutekijöiden ja sytokiinien [39, 40]. Siksi tutkimme miten miR-146a moduloi ilmentyminen valitun NF-KB-säänneltyjen kasvutekijöiden ja sytokiinien aiheuttama solun ulkopuolisen signaalit kuten LPA. LPA-stimulaatio huomattavasti interleukiini-6, -8, 23A (IL-6, IL-8, IL-23A) ja kemokiinin (CC-motiivi) ligandin 5 (CCL5), pesäkkeitä stimuloiva tekijä 1 (makrofagi) (CSF- 1) ja verihiutaleperäisen kasvutekijän beeta-polypeptidi (PDGFB) in SNU638 soluissa (kuvio 6). Tämä vahvisti, että näiden geenien ilmentymistä säätelee LPA-indusoidun NF-KB: n aktiivisuutta. Yli-ilmentyminen miR-146a merkittävästi vähentynyt IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 ja PDGFB in SNU638 soluissa (kuvio 6). Vaikka IL-6 on kohdegeenin NF-KB: n, ja myös voimistuvan LPA miR-146a yli-ilmentyminen ei vähentänyt IL-6 ekspressiota meidän olosuhteissa (Kuva 6). Kuitenkin LPA induktio IL-6 ekspressiota ei ole vain välitteinen NF-KB: n, mutta myös käyttämällä muita väyliä (MAPK /ERK, PI3K /Akt, ja p38) [41], joka voi myötävaikuttaa eroja. Vuonna SNU638 solujen perustasoon IL-6 on suurempi kuin IL-8, jotka voivat vaikuttaa mRNA: n liikevaihdon. Tämä voi olla osa syy että miR-146a on vähemmän vaikutusta LPA-stimuloitujen IL-6 ilme kuin IL-8 lausekkeen, joka on havaittu myös muissa solukkojärjestelmissä [42]. Kuva 6 miR-146a estää LPA aiheuttamaa sytokiinien ilmaisua. 25 uM LPA käytettiin indusoimaan sytokiinien ilmentymisen ihmisen mahakarsinooman SNU638 soluja. LPA merkittävästi parannettu IL-6, IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 ja PDGFB, joka mitattiin käyttäen qPCR ja esitetään suhteessa ilmentymistason käsittelemättömissä kontrollisoluissa. Tämä vaste vähennetään miR-146a-transfektoiduissa soluissa. Data näytetään keskimääräisenä ± S.D., n = 4, * = P < 0,05, ns = ei merkitsevä.
MiR-146a yli-ilmentyminen SNU638 soluissa vähentää monosyyttien
karsinoomat monosyyttejä voidaan palvelukseen esim CCL5 ja CSF-1 ilmaistaan ​​kasvainsolujen ja tämän kasvaimen infiltraatiota monosyyttien edistää kasvaimen edistää tulehdusvastetta syövän [39, 40]. On osoittanut, että miR-146a vähentää LPA-indusoidun sytokiinien, tutkimme kuinka miR-146a yli-ilmentyminen vaikuttaa monosyyttien. Huomasimme, että LPA-hoito SNU638 solujen lisääntynyt monosyyttien siirtymistä elatusaine SNU638 soluista (kuvio 7 ja Additional file1: Kuva S7), kun taas transfektio miR-146a osittain kumottu tämä vastaus (kuvio 7), osoittaa jälleen, että miR -146a estää biologisia vasteita ja GPCR-välitteisen NF-KB: n, kuten monosyyttien. Kuva 7 miR-146a vähentää monosyyttien muuttoliikettä. Monosyytti muuttoliike vastaan ​​kunnostetun alustan välille ohjaus- tai miR-146a-transfektoituja SNU638 soluja, jotka jätettiin hoitamatta tai stimuloidaan 25 uM LPA seurasi yli 8 tuntia. Solujen migraatiota on esitetty suhteessa migraation käsittelemättömään kontrolliin soluja. Monosyytti muuttoliike vastaan ​​väliaine LPA-stimuloitujen SNU638 solujen lisääntynyt verrattuna maahanmuuttoa vastaan ​​väliainetta käsittelemättömät solut, kun taas monosyyttien muuttoliike vastaan ​​väliaine miR-146a-transfektoidut, LPA stimuloiduista vähennettiin kuin keskimääräisen kontrollista-transfektoiduista, LPA stimuloiman solut. Data näytetään keskimääräisenä ± S.D. neljä biologista rinnakkaisnäytettä. ** = P < 0,01, ns = ei merkitsevä.
Keskustelu
Microenvironmental tekijät ovat tärkeitä NF-KB: n aktivaation tulehduksen-ajettu syöpien, kuten mahasyövän, ja tämän NF-KB: n aktivaatio voi antaa syöpäsolut etuja, jotka edistävät tumorigeeniset prosesseja [32, 43]. Modulointi NF-KB-aktivoiva signalointi on siksi tärkeä ohjaamiseksi tulehdusvälitteisen kasvainten kehittymiseen. Tässä osoitamme, että miR-146a on keskeinen negatiivinen säätelijä NF-KB: n aktivaation, koska se estää useita NF-KB-aktivoivia reittejä.
MiR-146a ilmentyminen havaittiin säädellään ylöspäin app. 2/3 ihmisen mahalaukun adenokarsinooman sekä gastriini- KO hiirimallissa mahasyövän. Vastaavasti ilmaus miR-146a on havaittu lisääntynyt kohdunkaulan, rinta-, haima- ja kilpirauhassyöpä [11, 44-46]. Aiemmin ilmentyminen miR-146a on löydetty sekä ylä- ja alassäädetty mahasyövän [21-24]. Nämä ristiriitaiset tulokset voivat heijastaa eroja kasvaimia ja niiden mikroympäristön johtaa eriasteisia NF-KB: n toimintaa, joka ohjaa miR-146a ilmaisun [16]. Yllättäen huomasimme alhainen miR-146a ihmisen mahasyövän solulinjoissa. Tämä voi osoittaa, että lisääntynyt miR-146a tasoilta kasvaimet coursed mukaan microenvironmental tekijät esim. jotka ympäröivät kasvainta soluihin.
vaikutusten tutkimiseksi lisääntyneen miR-146a tasot mahasyövässä tunnistimme kaksi uutta miR-146a tavoitteet, CARD10 ja COPS8, ja tutki roolit näihin tavoitteisiin. Olemme havainneet, että miR-146a inhiboi GPCR-välitteisen NF-KB: n aktivaatio suoraan kohdistuksen ja alaspäin säätäminen ilmentymisen CARD10 ja COPS8. CARD10 tiedetään vaaditaan GPCR-indusoidun NF-KB: n [27, 29], kun taas COPS8 on alayksikkö COP9 signalosomi, joka ohjaa NF-KB: n aktivaation [28, 47]. Olemme osoittaneet, että CARD10 on mukana GPCR-välitteisen NF-KB: n, ja jos uutta näyttöä, joka COPS8 on mukana tämän reitin kautta samoin. miR-146a liiallinen ilmentyminen johti myös pienentää ilmentymisen COPS2 toinen alayksikköä COP9 signalosomi. Oletamme, että tämä on epäsuora vaikutus, koska ei ole miR-146a sitoutumiskohta COPS2 3'UTR ja muutokset ilmentymisen yhden alayksikön on osoitettu vaikuttavan kuin muut [35, 36]. On siis mahdollista, että miR-146a jossain määrin voi toimia paitsi kohdentamalla COPS8 vaan horjuttaa COP9 signalosomi.
Poikkeava signalointia kautta GPCR: ien on yhdistetty kasvaimen solujen kasvua ja selviytymistä, ja NF-KB-aktivoiva GPCR: ien on ollut osoitettu myötävaikuttavan monenlaisia ​​syöpiä (katsaus Dorsam & Gutkind [48]). GPCR: t voivat aktivoida NF-KB: n välityksellä of the CARD10 /BCL10 /MALT1 kompleksin sitoutumisen jälkeen ligandit, kuten LPA, enothelin-1, angiotensiini II (Ang II) ja kemokiinin (CXC-motiivin) ligandin 12 (CXCL12) (kuvio 8) [ ,,,0],29, 49]. Meidän tutkimuksessa käytettiin LPA mallin GPCR-välitteisen NF-KB: n. LPA aiheuttama GPCR-signalointi johtaa kasvaimen etenemistä [49]. Siten miR-146a-estoa GPCR-signalointi voi olla kasvain tukahduttamaan vaikutuksia. Kuvio 8 miR-146a tavoitteet useita NF-KB: n aktivaation reittejä. Kaaviollisesti NF-KB-aktivoivia reittejä. miR-146a on aiemmin osoitettu kohdistaa IRAK1 ja TRAF6 ja tässä tutkimuksessa osoitamme, että miR-146a tavoitteet CARD10 ja COPS8. miR-146a tavoitteet on merkitty punaisella piireissä.
lisäksi GPCR-välitteisen NF-KB: n aktivaation, NF-KB voidaan aktivoida
kasvaimen nekroosi-reseptoria (TNFR), IL-1R, TLR, TCR ja B-solureseptorin (BCR) [50] (kuvio 8). Aiemmin miR-146a: n on osoitettu estävän NF-KB: n aktivoitumisen kautta
näiden reseptorien alaspäin säätäminen ilmentymisen TRAF6 ja IRAK1 [16, 18, 30, 31]. miR-146a tavoitteet IRAK1 mahalaukun syöpäsolut, mutta ei TRAF6. Vaikka olemme tässä osoittavat, että miR-146a on kohdistettu GPCR-välitteisen NF-KB: n, lisäksi aktivointi
TNFR, IL-1R, TLR, TCR ja BCR, kohdentamalla CARD10 ja COPS8 (kuvio 8). Siten miR-146a kohdistettu useisiin osat NF-KB-aktivoivia reittejä mahalaukun syöpäsoluja. Tätä ei ole osoitettu, että NF-KB-reitin ennen, mutta on aiemmin nähty transformoivan kasvutekijä-β (TGF-β) reitin, jossa sekä miR-21 ja miR-17-92 cluster tavoite useiden mRNA: iden koodaavat proteiinien TGF-β-reitin [51, 52]. Kohdistamalla useita komponentteja eri NF-KB-aktivoivan sellaisia ​​keinoja miR-146a välittää vankan ja monimutkainen valvonta NF-KB: n aktiivisuutta. Useat muut miRNA voidaan myös säädellä NF-KB-signaloinnin, mutta vain miR-146a tavoitteet useita geenejä eri NF-KB-aktivoiva reittejä, mikä viittaa siihen, miR-146a, joka on keskeinen modulaattori NF-KB: n aktivaation.
NF-KB säätelee sytokiinien ja kasvutekijöiden mukana useita näkökohtia syövän etenemisen [43]. Ottaen huomioon, että miR-146a vähentää NF-KB: n aktiivisuutta, on mahdollista, että miR-146a toimii kasvaimen tukahduttava vähentämällä ilmentymisen tällaisten sytokiinien ja kasvutekijöiden. Itse asiassa huomasimme, että miR-146a yli-ilmentyminen vähentää ilmentymistä useiden sytokiinien ja kasvutekijöiden, joiden tiedetään olevan rooli syövän kehittymisessä; IL-8, IL-23A, CCL5, CSF-1 ja PDGFB. Nämä geenit voivat lisätä solujen lisääntymistä, soluadheesiota ja angiogeneesissä [53-55], myötävaikuttaa kasvaimen lymfangiogeneesiä [56], aktivoi fibroblastit [57], rekrytoida monosyyttien kasvaimia [39, 40] ja aiheuttaa kasvaimeen liittyvä makrofagit (TAM) ja erittävät kasvain edistäviä välittäjäaineita [58] (kuvio 9). Kuva 9 Biologiset prosessit mahalaukun syöpäsoluissa estettiin miR-146a. Vasen paneeli, miR-146a suoraan suunnattu IRAK1, CARD10 ja COPS8 in SNU638 soluissa. Tämä johtaa NF-KB: n aktivaation ja näin ollen tukahdutettu ekspressiota NF-KB: n säädelty sytokiinien ja kasvutekijöiden. Expression of miR-146a säädellään myös NF-KB: n [16]. Oikea paneeli, miR-146a vähentää ilmentymä CCL5-, CSF-1, IL-8, PDGF ja IL-23A, jotka ovat mukana monosyyttien vaeltamisen ja erilaistumisen, leviämisen, angiogeneesin, imusuonten ja fibroblastien ja makrofagien kasvutekijä vapautumista. Siten miR-146a voi toimia tuumorisuppressorina vähentämällä syöpää edistävää vaikutusta NF-KB: n aktiivisuutta.
Kemotaktiset sytokiinit vapauttaa tuumorisolujen voi rekrytoida monosyyttien tuumorikohdissa [39, 59]. Nämä monosyytit voivat edistää syövän etenemistä [60]. CCL5- ja CSF-1 ovat esimerkkejä monosyyteista rekrytointi sytokiinien vapautuu tuumorisoluissa [39, 40]. Kuten odotettua, monosyytit siirtyneet vähemmän vastaan ​​kasvualusta peräisin LPA-stimuloitujen SNU638 solut yli-ilmentävät miR-146a verrattuna LPA stimuloimaa ohjaus soluissa. 0,05. Kaikki kirjoittajat luettu ja hyväksytty lopullinen käsikirjoitus.

• Samanaikainen yliekspressio seerumin p53-mutaation liittyy helikobakteeri-infektio
• Intraneural etäpesäke mahakarsinooman johtaa iskiashermoa vamma