Integrativa roller transformerande tillväxtfaktor-α i cytoprotektion mekanismer av gastrisk mukosal injury

integrativa roller transformerande tillväxtfaktor-α i cytoprotektion mekanismer av gastrointestinala skador Bild Sammanfattning
Bakgrund
transformerande tillväxtfaktor α (TGFa) skyddar mot gastrointestinala skador och underlättar sårläkning. Emellertid är dess överuttryck känd för att inducera hypertrofisk gastropati liknar Menetrier sjukdom hos transgena (TG) möss på en FVB bakgrund, som en av författarna som tidigare rapporterats. Vi studerade en annan TGFa-uttryckande mus linje på en CD1 bakgrund, vars magslemhinnan verkar normalt. Eftersom detta TG mus hade en stark motståndskraft mot etanol-inducerad gastrisk skada, ansåg vi den långsiktiga effekten av TGFa på flera mekanismer gastric skydd.
Metoder
TGFa-uttryckande transgena (TG) mus linjer bär human TGFa cDNA under kontroll av mus-metallotionein-genen i-promotorn genererades på en CD 1-mus bakgrund, och analyserade deras etanolskaderesistenta fenotyper som produceras av TGFa.
Resultat
i TG slemhinna, var blodflödet väl underhållna efter etanolskada . Vidare, neurala och inducerbara typer av NO-syntaser genomgående och allmänt uttryckt i TG slemhinnan jämfört med begränsad spridning av neural typ NO-syntas i luminala grop regionen av vildtyp (WT) slemhinna. COX-2 och dess uppströms transkriptionsfaktor NFkB var konstitutivt förhöjd i TG slemhinna redan innan etanoladministration, medan de inducerades i samma region av WT slemhinnan endast efter etanolskada. Två anti-apoptotiska proteiner, HSP70 och Bcl-2, var uppreglerad i TG slemhinna redan innan etanol administration, samtidigt som de inte uttrycktes i WT slemhinnan innan skadan. Vidare pro-kaspas 3 aktivering inhiberas i TG slemhinnan, medan det omvandlades till den aktiva formen i WT slemhinnan efter etanoladministration.
Slutsats
Vi drar slutsatsen att TGFa bibehåller gastrointestinala försvar mot gastric skada genom integrera andra cytoprotektiva mekanismer.
bakgrund
Etanol har länge använts för att generera en hemorragisk gastrointestinala skador hos gnagare [1]. Med oral administrering av absolut eller saltsyra surgjord etanol, kan omfattande hemorragiska skador framställas i magslemhinnan. Denna experimentella gastric skada modell har använts flitigt för gastrointestinala skydd och restitution studier. I själva verket har ett antal cytoprotektiva föreningar testats för att utvärdera deras potens att motstå gastrisk skada, inklusive gastrointestinala hormoner, tillväxtfaktorer, prostaglandiner, bioaktiva aminer, och milda irriterande ämnen såsom capsaicin [2-5]. Bland dessa föreningar, epidermal tillväxtfaktor (EGF) familj tillväxtfaktorer, särskilt transformerande tillväxtfaktor α (TGFa), har rapporterats som potenta cytoprotektiva föreningar mot etanol, ättiksyra-eller aspirin-inducerad gastrisk skada [2, 4].
TGFa uttrycktes i råtta magslemhinnan efter oral administrering av surgjord taurokolat eller saltsyra, vilket tyder på dess reparativa roll i gastrisk skada [6]. TGFa gavs intraperitonealt skyddade mot etanol-inducerad gastrisk skada med en betydande ökning av vidhäftande gastriskt mucin hos råttor [7]. Den cytoprotektiva funktion av TGFa tycktes vara medierad genom aktivering av fosfolipas C-γ1, men inte av prostaglandiner, och var oberoende av den anti-sekretoriska effekten av TGFa [7]. Å andra sidan, prostaglandiner och deras syntetiska enzym, cyklooxygenas (COX), har länge föreslagits som cytoprotektiva faktorer mot gastric skada [5, 8]. EGF har visat sig uttrycka en inducerbar COX isoform, COX-2, i RGM1 råtta gastrointestinala cellinje genom ett ERK MAP-kinasvägen [9] och i schweiziska 3T3 fibloblasts, särskilt genom samtidig stimulering med gastrin [10]. Vidare COX-2 expression genom heparinbindande EGF-liknande tillväxtfaktor, en medlem av EGF-familjen tillväxtfaktorer, blockerades av en specifik EGF-receptor (EGF-R) inhibitor i rått magslemhinnan [11]. Således verkar den EGF-R-signalen att mediera COX-2-induktion i magslemhinnan.
De viktigaste cytoprotektiva mekanismer innefattar gastrointestinala blodflödet. EGF och TGFa har visat sig utöva cytoprotektiva effekter via stimulering av kapsaicin känsliga nervceller med frisättning av kalcitonin gen-relaterad peptid (CGRP) och kväveoxid (NO) i råttor som utsätts för orogastric etanol administration, vilket resulterar i en ökning av gastrointestinala blod flöde [11, 12]. I motsats härtill Konturek et al. minimeras den roll som CGRP-beroende ökning av gastrisk blodflödet genom att visa att administrering av NO-frisättande aspirin erbjuds skydd mot absolut etanol-inducerad gastrisk skada även i kapsaicin-denerverad råttor, vilket resulterar i uppreglering av värmechockproteinet 70 (HSP70 ) uttryck och dämpning av den oxidativa skada av en stark uppreglering av antioxidativa gener såsom zink koppar superoxiddismutas (SOD) och glutationperoxidas [13].
TGFa var immun främst GSM-celler längs mag grop i människor [14], intensivt i gastric yta slemhinna (GSM) celler över proliferativa zonen och svagt längs körtel regionen under proliferativa zonen hos råttor [15], och markant längs slemhinnor halscellområdet i FVB /N stam möss [16]. Å andra sidan, var EGF-R immunostained i GSM-celler som kantar foveolar grop och slemhinnor hals cellregionen till den nedre körtel region hos människa [17]. Hos råttor var EGF-R lokaliserad längst upp gropen regionen och i de främsta cellkluster i botten av mag körtlar [15]. Även om TGFa är känt för att inducera cellproliferation i primär-odlade råttgastriska mukosala celler [18], och hyperplastisk proliferation i slemhinnan på TGFa-uttryckande transgena (TG) mus [19, 20], fördelningen av TGFa och EGF-R i terminalt differentierade magslemhinnan celler tyder på att TGFa utövar icke-proliferativa funktioner inklusive anti-apoptotiska effekter och gastric epitelbarriär bildning i en autokrin /parakrin sätt. Till exempel TGFa hämmade apoptos hos en mus gastrointestinala cellinje, GSM06, genom att uttrycka anti-apoptotiska Bcl-2 familjen proteiner genom ett NF-KB-beroende väg [21]. Gastric apikala och basolaterala EGF-R har visats inducera en minskning av paracellulära permeabilitet för syra för skydd av körtelceller i en sur miljö [18, 22]. Således, TGFa utövar både proliferativa och icke-proliferativa effekter på magslemhinnan funktioner, och dessa olika TGFa effekter bör omprövas, åtminstone när det gäller huruvida deras resultat härrör från korttidsbehandling med hjälp av kultur cellinjer eller från lång- uttrycket uttryck med hjälp av TGFa-transgen-uttryckande djur. Review, en tio år sedan, en av författarna, H. Takagi genererade TGFa-uttryck TG mus linjer under kontroll av metallotionein genpromotorn, och en av dessa linjer (MT100) uppvisade hypertrofisk gastropati liknar Menetrier sjukdom, som på liknande sätt visas av andra forskare [19, 20]. Däremot en annan TG linje (MT42) uppvisade en normal-framträdande magslemhinnan, även om TGFa transgen uttrycktes i liknande omfattning i båda TG linjer [20]. Eftersom MT42 linjen visade en överraskande nivå av resistens mot etanol-inducerad skada på magslemhinnan ansåg vi att det kunde vara till nytta för att utforska icke-proliferativa effekterna av TGFa såsom slemhinna motstånd till etanol skada. I den aktuella studien undersökte vi de långsiktiga effekterna av TGFa på etanol-inducerad gastrisk skada genom att analysera förändringar i cellskyddande och anti-apoptotiska regulatoriska faktorer, inklusive gastric blodflödet, NO-syntas, COX-2, och apoptos-associerade proteiner såsom som HSP70, Bcl-2, och kaspas 3.
Metoder
TGFa-uttryckande transgena musen och etanol-inducerad gastrisk skada
TGFa-uttryckande transgena (TG) muslinjer som bär human TGFa-cDNA under kontroll av den mus metallotionein-genen promotorn genererades på en CD 1 eller FVB mus bakgrund, såsom beskrivits tidigare [20]. En av TG linjer, MT100 på en FVB mus bakgrund, visas hypertrofisk gastropati liknar Menetrier sjukdom [20], medan den andra linjen, MT42 på en CD 1-mus bakgrund uppvisade en normal-framträdande magslemhinnan. Fenotypen av TGFa-TG mus tycktes bero på musstammen, eftersom både MT100 och MT42 linjer uttryckte en liknande nivå av TGFa-transgenen i magen [20]. I den aktuella studien använde vi MT42 raden av TGFa-uttryck TG hanmöss och CD1 vildtyp (WT) hanmöss i åldrarna sex till åtta veckor. Djuren hölls under kontrollerade ljus (7:00 till 7:00) med mat och vatten tillhandahölls ad libitum
.
Mössen, som vägde 30-35 g, fick fasta under 24 timmar före experimentet men tilläts fri tillgång till vatten. Alla experimentella procedurer som påverkar mössen godkändes av Animal Care och användning Review Committee vid Gunma University. Mössen fick sedan orogastric surgjord etanol (100 pl; 60% etanol i 0,15 mol /L HCl). Tre, sex och tolv timmar efter den surgjorda etanol administrationen avlivades mössen för utvärdering av gastriska skador och immunohistokemiska analyser, och för RNA och protein extraktion för realtids PCR, Northern och Western blot-analyser.
Fysiologiska studier
magsyrasekre mättes såsom beskrivits tidigare [20, 23]. I korthet innebar detta WT och TG-mössen fasta under 3 h och därefter bedövades med eter. Efter snittet av bukväggen, var pyrolus ligerades, och snittet suturerades. Magsaften uppsamlades 4 h efter den pyrolus ligering. För maximal syraproduktion, var syrasekretion stimuleras genom att injicera pentagastrin subkutant (500 fig /kg kroppsvikt). Magsaften titrerades med 0,1 N NaOH till pH 7,0 med användning av en microtitrator.
Gastric mucosal blodflödet mättes med en laser Doppler flödesmätare (modell SFA211, Advance Co., Tokyo) genom att placera en sond på ytan av det gastriska slemhinna, såsom beskrivits tidigare [24]. Flödessignalen övervakades med MacLab inspelningsprogrammet. Blodflödet uttrycktes i förhållande till den basala nivån.
Morfologiska studier
Tjockleken på magslemhinnan mättes från den högsta delen till botten av packboxen med en mikrometer. På samma sätt har de gastriska skador lesioner mätas (bredd och longitud) med en mikrometer för att beräkna det skadade området. Hus Till immunfärgning, vi fått antikroppar enligt följande. Polyklonal antikropp mot H + /K + - ATPas erhölls genom att injicera kanin parietalcellens-mikrosomala fraktioner i möss [25]. Kanin polyklonal antikropp mot metallotionein var en vänlig gåva från Dr. Nagamine, Gunma University Hälsohögskolan [26]. Vi köpte antikroppar enligt följande: kanin-polyklonal antikropp mot TGFa, kanin polyklonal antikropp till EGF-R, get polyklonal antikropp mot COX-2, kanin polyklonal antikropp mot NFkB, och monoklonal musantikropp mot nNOS och iNOS från Santa Cruz Biotech. (Santa Cruz, CA); mus monoklonal antikropp mot proliferativ cellkärnantigen (PCNA) från Zymed Lab. (South San Francisco, CA); fårantikropp till humant pepsinogen II från BioPur AB (Bubendorf, Schweiz), som också reagerar på mus pepsinogen; kanin polyklonal antikropp mot HSP70 från Stressgen Biotech. (Victoria, BC, Kanada); och mus-monoklonal antikropp till Bcl-2 från BD Biosciences (San Diego, CA).
För pepparrotsperoxidas (HRP) -catalyzing immunohistokemisk färgning, var malet magar fixerades i neutraliserad 10% formalin vid 4 ° C under 24 h och därefter inbäddad i paraffin för mikrotom sektionering. De avparaffinerade vävnadssektioner rehydrerades och inkuberades i 3% -ig vätesuperoxidlösning för att inhibera endogen peroxidasaktivitet. Då sektionerna inkuberades med en första antikropp som beskrivits ovan med en lämplig utspädning vid rumstemperatur under 30 min. En sekundär biotinylerad antikropp valdes baserat på de första antikroppsproducerande djurarter, och användes sedan med HRP-konjugerat streptavidin. HRP-reaktionen utfördes med 3-amino-9-etyl-karbazol och väteperoxid enligt instruktionerna som medföljer streptavidin-biotin färgning Vectastatin Elite Kit (vektorer Laboratories, Burlingame, CA). Positiva färgningar uppträdde brun färg.
För immunfluorescensfärgning, var malet magar fixerades i 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffert, pH 7,4 vid 4 ° C under 24 h. Små bitar av malet vävnad gick sackaros ersättning och bäddades in i OCT-förening som förberedelse för en fryst sektion med hjälp av en mikrotom. För den primära immunoreaktion, var skivade sektionerna sonderades med en första antikropp, och inkuberades sedan antingen med indodicarbocyanide (Cy3) -konjugerad affinitetsrenad åsne-anti-kanin, anti-mus-IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), eller fluorescein isotiocyanat (FITC) -märkt anti-kanin IgG (Jackson ImmunoResearch), som en sekundär antikropp. Den sekundära antikroppen IgG valdes baserat på de arter som den första antikroppen höjdes.
In situ detektion av apoptotiska celler utfördes med användning av In Situ Apoptos Detection Kit (TAKARA BIO INC. Tokyo, Japan). Satsen innehöll en terminal deoxinukleotidyltransferas-medierad deoxiuridintrifosfat biotin nick end-märkning (TUNEL) analyssystem. Mage sektioner permeabiliserades med proteinas K, och 3'-OH-ändarna av DNA-fragment färgades sedan följa instruktionerna som levererades med satsen. Kärnorna färgas mörkbrun ansågs vara apoptotiska celler.
RNA-analys
Magarna trimmas och den totala RNA extraherades med användning av TRIzol (Gibco BRL, Tokyo) enligt protokollet från tillverkaren. För Northern blöt, var det totala RNA: t elektrofores på en 1,0% agarosgel och överfördes till ett nylonmembran (Amersham Pharmacia Biotech, Tokyo). Hybridisering utfördes med en prob av den humana TGFa-cDNA (917 bp) märkt med [α- 32P] deoxi-CTP. Denna prob igenkänner humant TGFa-mRNA, men inte mus TGF-mRNA.
Mus TGFa mRNA-nivån mättes med användning av en realtidspolymeraskedjereaktion (PCR) med glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH) som en intern kontroll. Realtids-PCR utfördes med användning av ABI Prism 7700 Sequence Detector och mjuka (Applied Biosystems, Foster City, CA) med användning av DNA-fluorescerande färgämnet SYBR Green detektering. Primers utformades med hjälp av Primer Express design mjukvara (Applied Biosystems). Det slutliga resultatet för varje prov normaliserades genom den respektive GAPDH värdet. Primersekvenser är följande: mus TGFa: 5'-CCTGAGCACCCGAAGAT-3 'och 5'-CCTTCCCTCATGCCTTACT-3'; GAPDH: 5'-GTCGTGGATCTGACGTGCC-3 'och 5'-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3'
Western blot-analys
Gastric vävnadsprover trimmades och totalt protein från magslemhinnan homogeniserades i RIPA-buffert innehållande en cocktail av proteasinhibitorer. (fenylmetylsulfonylfluorid, pepstatin, leupeptin och aprotinin) (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland). Supernatanten separerades på en SDS-PAGE-gel, och därefter blottades till ett polyvinylidendifluoridmembran. Membranet sonderades med följande antikroppar: antikroppar mot iNOS, COX-1, COX-2, HSP70, och Bcl-2, vilket var samma som användes för morfologiska studier; mus monoklonal antikropp till Bax (Santa Cruz Biotech.); kanin polyklonal antikropp mot kaspas 3 (Santa Cruz Biotech.); och mus-monoklonal antikropp till aktinfilament (Santa Cruz Biotech.). Antikropp-reagerade band detekterades med användning av ett ECL-detektionssystem (Amersham, Buckinghamshire, UK).
Mätning av gastrin
Serum gastrin mättes med användning av en gastrin radioimmunanalyskit (gastrin RIA-kit, Dainabot, Tokyo, Japan). Antikroppen är specifik för gastrin med en amidgrupp vid dess karboxylterminal.
Mätning av prostaglandin E2
magslemhinnan homogeniserades vid 4 ° C i lysbuffert. Homogenaten centrifugerades vid 12000 rpm under 20 min och supernatanterna underkastades prostaglandin E 2-analysen med användning av en prostaglandin E 2 Monoklonal enzymimmunoanalys Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), enligt tillverkarens anvisningar .
Statistisk analys
Statistisk analys utfördes genom upprepad åtgärd variansanalys (ANOVA) för den totala längden av de gastriska skador genom oparat t-test för gastric mucosal blodflödesminskning förhållande. Alla värden är uttryckta som medelvärde ± SE. P < 0,05 accepterades som statistiskt signifikant.
Resultat
karakterisering av TGFa-uttryck TG mus magslemhinnan
WT CD1-stammen och TGFa-transgen uttrycker MT42 linje möss växte på liknande sätt och visade ingen märkbar skillnad i deras egenskaper, beteenden eller lifespans. Den största tjockleken som observeras för magväggen och fundic körtlar var 3,50 ± 0,18 mm och 2,33 ± 0,20 mm, respektive, i de WT möss, och 3,85 ± 0,24 mm och 2,63 ± 0,16 mm, respektive, i de TG-möss; Det fanns inga signifikanta skillnader i form av mag slemhinnor och körtlar mellan WT och TG möss. Förutom det normala utseendet på magslemhinnan, denna TG mus linje hade också en normal-framträdande lever, bukspottkörtel, och andra organ.
Vi jämförde sedan syrasekrekapaciteten mellan WT- och TG-möss. I WT möss, ökad maximal syraproduktionen avsevärt från basnivå av 25 ± 1,4 mEq /h till 50 ± 5,8 mekv /h efter pentagastrinstimulering. Däremot i Tg-möss, ökade maximal syra utsignal till en mindre utsträckning till 30 ± 5,7 mekv /h från basal utgången på 23 ± 0,7 mekv /h (n = 5 i WT och TG-möss). Den trubbiga syraproduktion kan återspegla den reducerade parietal cellmassan i TG slemhinna (Figur 1e). Figur 1 Karakterisering av TGFa-uttryck TG slemhinna. Skala i varje figur visar 100 nm. (A) Fördelning av TGFa-uttryckande celler. Brunfärgad TGFa-positiva celler var synliga längs den luminala gropen regionen i WT slemhinna, den långsträckta foveolar gropregion, och den nedre en tredjedel av den glandulära regionen i TG slemhinna. (B) Överlapp av rödfärgade TGFa-positiva celler och gröna-färgad H + /K + -ATPas-positiva parietalceller. Lägre TGFa-positiva celler i kluster skiljer sig från de grönfärgade parietalceller i TG slemhinnan. (C) Northern blöt av humant TGFa mRNA och PCR-amplifieras mus TGFa mRNA. Human TGFa mRNA uttrycks i TG slemhinnan enbart (vänster panel), men PCR-förstärkt mus TGFa mRNA uttrycks på samma sätt i både WT och TG slemhinnor (högra panelen). (D) Western blöt av TGFa mellanformer. TGFa föregångare (20 kDa) och dess mellanformer visualiseras mer intensivt i TG slemhinnan än i WT slemhinna. (E) Lokalisering av EGF-receptor i magslemhinnan. EGF-receptor (EGF-R) färgades med Cy3 (röd) och H + /K + -ATPas var färgade med FITC (grön). EGF-R immun måttligt i den övre gropen regionen och starkt i den nedre körtel regionen på samma sätt i både WT och TG slemhinnor. (F) Fördelning av metallotionein i magslemhinnan. Metallotionein är immun starkt i den nedre körtel regionen, och måttligt längs foveolar regionen. (G) Förlängning av mag grop i TG slemhinnan. PCNA-positiva celler ut vid det övre tredje region i WT mag körtlar, medan de distribueras mer talrikt och i stort sett i mitten körtel regionen. (H) PAS färgning visar avlånga grop i TG slemhinnan.
Expression av TGFa transgen
TGFa-uttryckande celltyper var identifierats utifrån celltyp-specifik immunfärgning och deras mucosal plats. TGFa var enligt uppgift immun längs GSM-celler i mag-grop i människor [14] och råttor [15], och längs slemhinnor halscell region i FVB stam möss [16]. I föreliggande studie, var brunfärgad TGFa-positiva celler fördelade längs foveolar regionen av både WT och TG slemhinnorna, och längs den undre körtel regionen av TG mucosa (Figur 1a). TGFa-positiva celler längs foveolar regionen tycktes vara gastric grop celler, baserar sin plats (Figur 1b, övre panelen), och längs den nedre körtel regionen av TG slemhinnan inte överlappa med den grönfärgade H ^ /K + - ATPas-positiva parietalceller (Figur 1B, undre panelen), men lämnade överlappa de pepsinogen-positiva chief-celler (data ej visade). Antikroppen vi använde för immunfärgning för TGFa kunde inte skilja mellan människa och mus TGFa, men dess mRNA-sond kunde göra så för Northern blot-analys. Den humana TGFa-transgen uttrycktes i TG slemhinnan medan ingen expression noterades i WT slemhinna (figur 1c, vänstra panelen). Däremot var endogena mus TGFa mRNA liknande uttryck i både WT och TG slemhinnor genom realtids-PCR (figur 1c, högra panelen). TGFa är en 50 aminosyrapeptid, som härrör från dess 160 aminosyror membranomspännande prekursorn klyvs av tumörnekrosfaktor-α-konverterande enzym (TACE) [27, 28]. Med överskotts uttrycket av den humana TGFa-transgen i TG slemhinna, en cirka 20 kDa TGFa-prekursor och dess mellanformer ökades genom immunoblotting (figur 1d).
Eftersom både prekursorn och bearbetade formerna var lika aktiva för att stimulera EGF -R [28] undersökte vi ytterligare EGF-R lokalisering i slemhinnan. EGF-R lokaliserades tungt i lägre chefscellkluster regionen och måttligt i slemhinnor hals cell regionen och i foveolar gropen regionen i både WT och TG slemhinnor (Figur 1e), som tidigare rapporterats för råtta magslemhinnan [15 ]. Sedan TGFa transgenen kontrollerades under mus-metallotionein-genen [20] och metallotionein har enligt uppgift produceras i magslemhinnan [29] undersökte vi metallotionein-uttryckande celltyper i slemhinnan. Immunhistokemiskt, noterade vi metallotionein färgning mestadels längs nedre körtel regionen och scatteringly längs gropen regionen styr CD1-stammen magslemhinnan (figur 1F). Således-uttryck TGFa celltyper är fördelningen av liknande det i metallotionein-uttryckande celler i magslemhinnan TG (figurerna 1a och 1f).
I WT mus slemhinna, H + /K + - ATPas-positiva parietalceller spreds vida över körtel område, utom för den översta-pit skikt, medan H + /K + - ATPas-positiv körtel region reducerades i höjd i TG slemhinna (Figur 1e). Faktiskt, isthmus vid basen av gropen-regionen, vilket bekräftades genom PCNA-färgning, flyttades ner till mitten av TG mucosa (Figur 1 g). Dessutom var PCNA-positiva celler tätt fördelad i mitten av slemhinnan. Konsekvent var PAS-färgning positiva foveolar grop långsträckta i TG slemhinna i motsats till den korta grop i WT mucosa (Figur 1h). Således, även om höjden på magslemhinnan var liknande mellan WT och TG slemhinnor, var det proliferativa zonen flyttas ned och foveolar pit regionen var mer avlång med en reducerad körtel region i TG mocosa. Eftersom tillväxten av pit celler är starkt förbättras genom gastrin [25, 30], vi jämförde serumgastrinnivåerna mellan WT och Tg-möss, men fann ingen ökning i nivåerna av serum gastrin i TG musen (WT, 213 ± 41 pg /ml;. TG, 263 ± 47 pg /ml, n = 5, p = 0,438) Review etanol-inducerad gastrisk skada i WT och TG mus slemhinnorna
Orogastric administrering av surgjord etanol (100 | il) orsakade hemorragisk skada i TG mucosa (figur 2a, vänster). Histologiskt skadan skalade bort grop och näset regioner och nådde till mitten av körtel region (Figur 2b, vänster). Däremot var inte anmärkningsvärt denna typ av skada i TG mus slemhinna (figur 2a, höger). Skadan var histologiskt begränsad till den luminala gropen regionen (Figur 2b, höger). I WT slemhinna, ökade det skadade området snabbt med en topp vid 6 h efter etanoladministration, medan i TG slemhinnan området ökade långsamt och minimalt utan en markant topp (figur 2c). Genomgående, apoptotiska celler visas av TUNEL-färgning distribueras djupt till lägre körtel regionen 3 timmar efter etanol administrationen i WT slemhinnan, medan apoptotiska celler begränsades till gropen regionen, men inte sträcker sig till körtel regionen i TG slemhinna ( Figur 2d). Figur 2 Etanol-inducerad gastrisk skada i mag slemhinnor. (A) Makroskopisk vy av magslemhinnan. Skala: 5 mm. Båda slemhinnor är 6 timmar efter etanoladministration. Notera att de WT mukosa visar omfattande hemorragiska skador, i kontrast, ser oskadade efter etanol administrering TG slemhinna. (B) Hematoxylin och eosin-färgning av etanol-skadade WT slemhinnor (till vänster) och TG slemhinnor (till höger). Notera den djupa sårbildning i WT slemhinna. Skala: 100 ^ m. (C) Tidsförlopp av etanol-inducerad gastrisk skada. Skadade området är avsatt mot tiden upp till 12 timmar efter etanoladministration. Varje punkt representerar ett medelvärde av fem möss. p Hotel < 0,05 (d) TUNEL-färgning av WT slemhinnor (till vänster) och TG slemhinnor (till höger). Båda sektionerna är i följd med dem i 2B
, respektive. Apoptotiska celler är synliga med mörkbruna kärnor. Ett stort antal apoptotiska celler noteras i WT slemhinna. Alla bilder var 6 timmar efter etanoladministration. Skala:. 100 um
Gastric mucosal blodflödet i etanolbehandlade slemhinna
Även om ett antal cytoprotektiva reglerande faktorer har rapporterats, inklusive NO, CGRP, COX2 och HSP70 [12, 13, 31, 32] , mucosal blodflödet har föreslagits som en primär faktor för att skydda och återlämnande av etanol-inducerad gastrisk skada [1, 33]. Vi mätte gastric blodflödet genom att placera en sond av laserdopplerflödesmätare på magslemhinnan nås via en exponerad bukväggen på anestetiserad mus. Gastric blodflöde minskade lades av 43,5 ± 6,37% efter etanol förvaltningen på magslemhinnan av WT mus (Figur 3). Däremot minskade bara med 17,2 ± 9,21% efter etanol förvaltningen på TG slemhinna (Figur 3). Således var den gastriska blodflödet väl underhållna i TG slemhinna även efter etanolbehandling. Eftersom slemhinna ischemi är en av de viktigaste ulcerogena faktorerna [33], inte upprätthållandet av gastric blodflödet verkar vara en viktig faktor för mucosal skydd. Figur 3 Bedömning av gastrointestinala blodflödet i magsäcken slemhinnor. Gastrointestinala blodflöde utvärderades genom att jämföra den flödesförhållandet blod före och efter etanolbehandling. Förhållandet erhölls som en procent mot blodflödet före behandlingen, som var mycket större i WT slemhinnan än i TG slemhinna. * P Hotel < . 0.03
Redovisning av cytoprotektiva proteiner: NO-syntas, COX-2, och HSP70
För att undersöka mekanismen för högt blodflöde underhåll i TG slemhinna, undersökte vi uttrycket av NO-syntaser, vilket gör NO från arginin, och slappnar vaskulära glatta muskler via cGMP-beroende proteinkinas [34]. Det finns tre typer av NO-syntas (NOS): neural NOS (nNOS), inducerbara NOS (iNOS) och endotel NOS (eNOS). nNOS och eNOS är konstitutivt uttryckt, medan iNOS induceras vid gastric skada [35]. nNOS delades ut på liknande sätt som PAS-färgning över foveolar gropen regionen (Figur 1 g); Det observerades under den långsträckta grop i TG slemhinna och var begränsad till den luminala grop i WT slemhinna (Figur 4a). eNOS gjordes svagt spridda över hela magslemhinnan på liknande sätt i både WT och TG slemhinnorna (data ej visade). INOS-färgning var försumbar i WT slemhinnan, även om det var i hög grad induceras i den nedre körtel regionen efter slemhinnan exponerades för etanol (figur 4b). I TG slemhinnan, var iNOS konstitutivt uttryck i lägre körtel regionen på samma sätt före och efter skadan (Figur 4b), som verkar för att ytterligare bidra till upprätthållandet av högt blodflöde. Figur 4 Immunfärgning av NO-syntaser i magslemhinnan. Skala: 100 ^ m. (A) nNOS immunfärgning. nNOS var synlig längs gropen regionen, vilket resulterar i dess bredare spridning längs den långsträckta grop i TG slemhinna. (B) iNOS immunfärgning. iNOS framkallades i den nedre körtel regionen efter etanol skada i WT slemhinnan, medan den konstitutivt uttryckt i samma region av TG slemhinna oavsett etanolskada.
Prostaglandiner föreslogs som en viktig cellskyddande faktor över tre decennier sedan [ ,,,0],8] och deras roller har studerats omfattande [36, 37]. Rollen av prostaglandinbildande enzymer, COX-1 och COX-2, har varit kontroversiell i den mukosala skyddet mot gastriska irritations [7, 11, 32]. Vi undersökte uttrycket av COX i WT och TG slemhinnan under etanolskada. Uttrycket av COX-1 skilde sig inte mellan WT och TG slemhinnor, eller före eller efter etanolskada (Figur 5b). COX-2 var inte detekterbar i WT slemhinna, men dess expression blev uppenbart 6 h efter etanolskada, och dess färgning lokaliserades till det nedre körtel regionen (figur 5a och 5b). I TG slemhinnan, COX-2 immunofärgning var intensiv på samma område redan innan skadan och fortsatt positiv efter skadan (Figur 5a). Eftersom Coxs har visat sig uttryckas i mesenkymala celler såsom fibroblaster och mononukleära celler i magslemhinnan [38], och streptoavidin /biotin /HPR-metoden presenterar ibland falskt positiv färgning, utförde vi immunofluorescerande färgning med hjälp av en frusen sektion som bekräftade COX uttryck på liknande sätt i den nedre körtel regionen av TG mucosa (data ej visade). Genom immunoblottning, COX-2 ökade efter skada i WT mucosa, medan det var starkt förhöjt i liknande omfattning före och efter skadan (Figur 5b).

• Genomsekvensen av Helicobacter suis stöder sin roll i gastric patologi
• Uppreglering av CLDN1 i magsäckscancer är korrelerad med minskad överlevnad