Integruotos vaidmenys transformuojantis augimo faktorius-alfa į ląstelių apsaugą mechanizmų skrandžio gleivinės traumos

Integruotos vaidmenys transformuojantis augimo faktorius-alfa į ląstelių apsaugą mechanizmų skrandžio gleivinės traumos
tezės
Background pervežimas transformuojantis augimo faktoriaus alfa (TGFα) apsaugo nuo skrandžio gleivinės traumos ir palengvina žaizdos gijimą. Tačiau, jo raiška yra žinoma, kad sukelti hipertrofiniam gastropatijos primenančiu Menetrier liga transgeninių (Tg) pelėmis ant FVB fone, kaip vienas iš autorių buvo pranešta anksčiau. Mes studijavo kitą TGFα ekspresija pelės liniją dėl CD1 fone, kurio skrandžio gleivinė atrodo normalu. Kadangi tai TG pelės turėjo stiprų atsparumą etanolio sukeliamo skrandžio traumos, mūsų nuomone, ilgalaikį poveikį TGFα keletą skrandžio apsaugos mechanizmus.
Metodai
TGFα ekspresija transgeninių (Tg) pelės linijas guolis žmogaus TGFα kDNR prie pelės metalotioneiną geno I promotoriaus kontrolės buvo sukurtas ant CD1 pelės fone, ir analizuojami jų etanolis žalos atsparus fenotipų gaminamas TGFα.
rezultatai
TG gleivinę, kraujotaka buvo gerai prižiūrimi po etanolio traumos , Be to, neuronų ir indukuojami tipų NO synthases buvo nuosekliai ir plačiai išreikštas TG gleivinės, palyginti su riboto platinimo neuroninio tipo NO sintazės į luminitinis duobę regiono laukinio tipo (WT) gleivinę. COX-2, ir jos prieš srovę transkripcijos faktorius NfkB buvo konstitutyviai padidėjusi TG gleivinės net iki etanolio administravimo, kadangi jie buvo indukuota pačiu regione WT gleivinės tik po to, kai etanolio traumos. Dvi kovos su Apoptozinės baltymai, HSP70 ir BCL-2, buvo aktyvinama į TG gleivinės net prieš etanolio administracijos, o jie nebuvo išreikšta WT gleivinės prieš traumos. Be to, pro kaspazės 3 aktyvavimo buvoinhibuotas TG gleivinę, o ji buvo paverčiamas aktyvia forma WT gleivinės po etanolio administracija.
Išvada
Galime daryti išvadą, kad TGFα palaiko skrandžio gleivinės apsaugą nuo skrandžio žalos
faktai
Etanolis jau seniai naudojamas generuoti hemoraginis skrandžio gleivinės pažaidų graužikams integruojant kitus apsaugančių mechanizmų. [1]. Su išgėrus absoliutaus ar druskos rūgšties-raugintas etanolio, platus hemoraginių pažeidimai gali būti gaminamas skrandžio gleivinę. Tai eksperimentinis skrandžio žalos modelis buvo dažnai naudojamas skrandžio gleivinės apsaugos ir restitucijos studijas. Iš tiesų, apsaugančių junginių skaičius buvo patikrintas įvertinti jų potenciją priešintis skrandžio sužeisti, įskaitant virškinimo trakto hormonų, augimo faktorių, prostaglandinai, biologiškai aktyvių aminų ir švelnios dirgiklių, pavyzdžiui, kapsaicino [2-5]. Tarp šių junginių, epidermio augimo faktorius (EGF) šeimos augimo faktoriai, ypač transformuojantis augimo faktoriaus alfa (TGFα), buvo pranešta, kad stipriai apsaugančių junginių prieš etanolį, acto rūgščiai, arba aspirino sukelta skrandžio traumos [2, 4].
TGFα buvo išreikštas žiurkių skrandžio gleivinės Išgėrus parūgštintu taurocholato ar druskos rūgšties, o tai rodo jos restoratyvinę vaidmenį skrandžio traumos [6]. TGFα nurodysite pilvaplėvę apsaugotas nuo etanolio sukeliamo skrandžio sužalojimo su gerokai padidinti prigludusių skrandžio muciną žiurkių [7]. Citoprotekciniu funkcija TGFα pasirodė, kad tarpininkaujant aktyvavimo fosfolipazės C-γ1, bet ne prostaglandinų, ir buvo nepriklausoma nuo anti-sekrecijos poveikio TGFα [7]. Kita vertus, prostaglandinų ir jų sintetinių fermento, ciklooksigenazės (COX), jau seniai siūlomas kaip apsaugančių veiksnių prieš skrandžio traumos [5, 8]. EGF buvo įrodyta, kad išreikšti indukuojamą COX izoformos, COX-2, į RGM1 žiurkių skrandžio gleivinės ląstelių linijos per ERK MAP kinazės keliu [9] ir Šveicarijos 3T3 fibloblasts, ypač bendradarbiavimo stimuliacijos Gastrino [10]. Be to, COX-2 išraiška heparinas, surišantis EGF panašaus augimo faktoriaus, iš EGF šeimos augimo faktorių narys, buvo užblokuotas tam tikrą EGF receptoriaus (EGF-R) inhibitorius žiurkių skrandžio gleivinės [11]. Taigi, atrodo, EGF-R signalas tarpininkauti COX-2 indukcijos skrandžio gleivinę.
Svarbiausi apsaugančių mechanizmų yra skrandžio gleivinės kraujotaką. Bendras EGF ir TGFα buvo įrodyta, kad daryti apsaugančių poveikį per "stimuliacijos kapsaicino jautrus neuronų su išleidimo Kalcitonino genų, susijusių su peptido (CGRP) ir azoto oksido (NO) žiurkėms veikiami orogastric etanolio administracijos, dėl to skrandžio gleivinės kraujo padidinti tekėti [11, 12]. Priešingai, Konturek ir kt. sumažintas, kad CGRP priklausomas skrandžio kraujotaka vaidmenį, parodant, kad administracija NO atpalaiduojančio aspirino siūlomų apsaugą nuo absoliutaus etanolio sukeliamo skrandžio traumos net kapsaicino-denervuojamo žiurkių, todėl į šilumos šoko baltymų 70 ląstelę (Hsp70 ) išraiška ir slopinimas oksidacinio žalos stiprus ląstelę antioksidacinės genų, pavyzdžiui, cinko vario superoksido dismutazės (SOD) ir glutationo peroksidazės [13].
TGFα buvo immunostained daugiausia GSM ląstelių kartu su skrandžio duobę žmonėms [14], intensyviai skrandžio paviršiaus gleivinės (GSM) ląstelių per proliferacijos zonoje ir silpnai palei liaukų regione pagal proliferacijos zonoje žiurkių [15], ir gerokai palei gleivinės kaklo ląstelių regione FVB /N padermės pelių [16]. Kita vertus, EGF-R buvo immunostained GSM ląstelių pamušalas foveolar duobę ir gleivinės kaklo ląstelių regioną prie apatinės liaukų regione žmonėms [17]. Žiurkių, "EGF-R buvo lokalizuotas ne aukščiausio duobę regione ir aukštuosius ląstelių branduolių ties skrandžio liaukų [15] apačioje. Nors TGFα yra žinoma, kad sukelti ląstelių proliferaciją pirminėje-kultūringas žiurkių skrandžio gleivinės ląstelių [18], ir hiperplazinį proliferaciją in gleivinės dėl TGFα ekspresija transgeninių (Tg) pelė [19, 20], kad TGFα paskirstymas ir "EGF-R į nepagydomai diferencijuotų skrandžio gleivinės ląstelių rodo, kad TGFα daro ne antiproliferacinės funkcijas, įskaitant kovos su apoptozinių poveikį ir skrandžio epitelio barjeras formacijos autokrino /paracrine būdu. Pavyzdžiui, TGFα slopina apoptozę pelės skrandžio gleivinės ląstelių linija, GSM06, išreikšdama Anti-apoptozinių BCL-2 šeimos baltymų per NF-κB priklausomas keliu [21]. Skrandžio viršūninio ir basolateral "EGF-R buvo įrodyta, kad sukelti į paracellular pralaidumas sumažėjo iki rūgštimi tam, kad liaukų ląstelių apsaugos rūgščioje aplinkoje [18, 22]. Taigi, TGFα daro abu antiproliferacinės ir ne antiproliferacinės poveikį skrandžio gleivinės funkcijos, ir šie skirtingi TGFα poveikis turėtų būti iš naujo įvertinami bent pagal tai, ar jų rezultatai yra gaunami iš trumpalaikiam gydymui naudojant kultūra ląstelių linijas ar nuo ilgo terminas išraiška naudojant TGFα-transgenui ekspresija gyvūnus.
prieš dešimtmetį, vienas iš autorių H. Takagi, sukurtas TGFα ekspresija TG pelės linijas prie metalotioneino geno promotoriaus kontrolės, ir vienas iš šių linijų (MT100) Sudėtis parodos hipertrofinė gastropatijos primenantys Menetrier liga, nes panašiai parodyta kitų tyrėjų [19, 20]. Priešingai, kitas TG linija (MT42) rodomas normalus-nesimatytų skrandžio gleivinę, nors išsakė TGFα transgeno panašiu mastu tiek TG linijų [20]. Kadangi MT42 linija rodomas stebina atsparumo lygį etanolio sukeliamo žalos skrandžio gleivinę, mūsų nuomone, kad ji galėtų būti naudinga tyrinėti ne antiproliferacinės poveikį TGFα pavyzdžiui, gleivinės atsparumą etanolio traumos. Šioje studijoje, mes ištirti ilgalaikes pasekmes TGFα etanolio sukeliamo skrandžio traumos analizuojant pokyčius apsaugančių ir anti-apoptozinių reguliavimo veiksnių, įskaitant skrandžio kraujotaka, NO sintezės, COX-2 ir apoptozę susijęs baltymų tokių kaip HSP70, BCL-2, ir kaspazė 3.
metodai
TGFα ekspresija transgeninio pele ir etanolio sukeliamo skrandžio žalos
TGFα ekspresija transgeninių (Tg) pelės linijas guolis žmogaus TGFα kDNR pagal kontrolės pelės metalotioneino genas Aš rengėjas buvo sukurtas ant CD1 ar FVB pelės fone, kaip aprašyta anksčiau [20]. Vienas iš TG linijas, MT100 ant FVB pelės fone rodomas hipertrofiniam gastropatijos primenančiu Menetrier liga [20], o kita linija, MT42 ant CD1 pelės fone rodomas normalus-nesimatytų skrandžio gleivinę. Iš TGFα-TG pele fenotipas pasirodė priklauso nuo pelių kamieną, nes abu MT100 ir MT42 linijos išreiškė panašų lygį TGFα transgenui skrandyje [20]. Šioje studijoje, mes panaudojome MT42 liniją TGFα ekspresija TG pelių patinams ir CD1 laukinio tipo (WT) pelių patinams sulaukus 6 iki 8 savaičių. Gyvūnai buvo prižiūrimi pagal valdomą šviesos (7:00 iki 7:00 PM) su maistu ir teikiamos vandens iki soties pervežimas.
Pelių, sveria 30-35 g, buvo pasninkavo 24 h prieš eksperimentą, bet buvo leista laisvai patekti į vandenį. į gyvūnų priežiūrai ir naudojimui peržiūros komiteto Visi eksperimentiniai procedūros, įtakojusios pelėms buvo patvirtinti Gunma universitete. tada pelėms buvo duota orogastric parūgštintų etanolio (100 pL; 60% etanolio 0,15 mol /l HCl). Trys, šeši, ir dvylika valandų po to, kai parūgštintu etanolio administravimo pelės buvo paaukotos už skrandžio žalos ir imunohistoche analizės vertinimo, ir RNR ir baltymų ekstrahavimo realiu laiku PGR, Šiaurės ir Vakarų dėmė analizę.
Tyrimų fiziologinius
Skrandžio rūgšties sekrecijos buvo matuojamas kaip aprašyta anksčiau [20, 23]. Trumpai, WT ir TG pelėms buvo badavusios 3 h ir tada anestezuoti eteriu. Po to, kai pilvo sienos pjūvį, pyrolus susiūtas, ir pjūvis buvo susiūtas. Skrandžio skysčio buvo surinkta 4 val po pyrolus perrišimas. Maksimaliai rūgšties produkcijos, rūgšties sekrecija stimuliuojama injekcijų pentagastrino po oda (500 mikrogramų /kg kūno svorio). Skrandžio skystis buvo titruojamas 0,1 N NaOH iki pH 7,0, naudojant microtitrator.
Skrandžio gleivinės kraujo tekėjimą buvo matuojamas su lazerio Doplerio srauto matuokliu (modelis SFA211, Išankstinis Co, Tokijas) pateikimo zondą dėl skrandžio paviršiaus gleivinė, kaip aprašyta anksčiau [24]. Srauto signalas buvo stebimi su MacLab įrašymo programa. Kraujotaka buvo išreikštas lyginant su baziniu lygiu.
Morfologiniai tyrimai
skrandžio gleivinės storis buvo matuojamas nuo aukščiausio dalis į liauka su mikrometru apačioje. Be to, skrandžio žalos pažeidimai buvo matuojamas (plotis ir ilgumą) su mikrometru apskaičiuoti sužeistą plotą.
Imuniniam mes gauti antikūnai taip. Polikloninis antikūnų H + /K + - ATPazės buvo gautas injekcijų triušis pakauškaulio ląstelių mikrosomų frakcijas į pelių [25]. Triušis polikloninis antikūnas metalotioneiną buvo natūra dovana dr Nagamine, Gunma universiteto Sveikatos mokslų [26]. Mes įsigijo antikūnai taip: triušio polikloninį antikūną TGFα, triušio polikloniniu antikūnų EGF-R, ožka polikloninis antikūnas COX-2, triušių polikloninis antikūnas NFκB ir pelės monokloninis antikūnas prieš nNOS ir iAOS iš Santa Cruz Biotech. (Santa Krusas, Kalifornija); pelės monokloninis antikūnas prieš antiproliferacinės-ląstelių branduolių antigeno (PCNA) nuo Zymed Lab. (Pietų San Franciskas, Kalifornija); avių antikūnas prieš žmogaus pepsinogen II nuo BioPur AB (Bubendorf, Šveicarija), kuri taip pat reaguoja į pelės pepsinogen; triušis polikloninis antikūnas HSP70 iš Stressgen Biotech. (Victoria, BC, Kanada); ir pelės monokloninis antikūnas prieš Bcl-2 nuo BD Biosciences (San Diego, CA).
Dėl krienų peroksidazės (HRP) -catalyzing imunohistocheminis dažymas, smulkintos skrandžiai buvo fiksuoti neutralizuotas 10% formalinu, esant 4 ° C temperatūroje 24 h, ir tada buvo įdėta į parafino už Mikrotoms pjūviu. Į deparaffinized audinio skyriai buvo rehidrataciją ir inkubuojami 3% vandenilio peroksido tirpalo slopina endogeninio peroksidazės aktyvumo. Tada dalys buvo inkubuotos su pirmąjį antikūną, aukščiau aprašytą su atitinkamo praskiedimo kambario temperatūroje 30 min. Antrinis biotinilinto antikūnas buvo pasirinktas remiantis pirmųjų antikūnų gyvūnų rūšims, ir tada buvo naudojamas su HRP-konjuguoto streptavidino. HRP reakcija buvo atlikta su 3-amino-9-etil-Karbazolo ir vandenilio peroksido pagal tiekiamų su streptavidino-biotinas dažymo Vectastatin Elite Kit (Vektorius Laboratories, Burlingame, CA) nurodymus. Teigiami stainings pasirodė rudos spalvos.
Dėl imunofluorescencines dažymo, smulkintos skrandžiai buvo fiksuoti 4% paraformaldehido 0,1 M fosfato buferiu, kurio pH 7,4, esant 4 ° C temperatūroje 24 val. Maži maltos audinio patyrė sacharozę pakeitimo ir buvo įdėta į UŠT-junginio rengiantis šaldytų skyriuje naudojant Mikrotoms. Dėl pirminės imuninė reakcija, griežinėliais skyriai buvo tyrinėjo su pirmuoju antikūnų, o tada buvo inkubuojami arba su indodicarbocyanide (Cy3) konjuguoto giminingumas-išgrynintas asilas kovos su triušio, anti-pelės IgG (Jacksonas ImmunoResearch, Vakarų Grove, PA) arba fluoresceino izotiocianato (FITC) žymėto kovos su triušio IgG (Jacksonas ImmunoResearch), kaip antrinį antikūnais. Antrinė antikūnų IgG buvo pasirinktas remiantis rūšių, dėl kurių buvo iškeltas pirmasis antikūnas.
Situ aptikti apoptozinių ląstelių buvo atliekama naudojant in situ apoptozę Detection Kit (TAKARA BIO INC. Tokijas, Japonija). Rinkinys esančius terminalo deoksinukleotidiltransferazės tarpininkaujant deoksiuridino trifosfatas biotinas Nikas pabaiga ženklinimas (TUNEL) Analizės sistemą. Skrandžio dalys buvo padarytos laidžiomis su proteinazės K, ir 3'-OH galai DNR tada fragmentai buvo nudažomi taip tiekiamų su rinkiniu instrukcijas. Tamsintas tamsiai rudos branduoliai buvo laikomas Apoptozinės ląstelės.
RNR analizė
skrandžiai buvo apipjaustyta ir bendra RNR buvo paimti naudojant TRIzol (Lanksčiai BRL, Tokijas) pagal protokolą gamintojo pateikta. Šiaurės dėmė, bendras RNR elektroforeze ant 1,0% agarozės gelyje ir buvo perkeltas į nailono membranos (Amersham Pharmacia Biotech, Tokijas). Buvo atliekama hibridizacija su žmogaus TGFα kDNR (917 bp), pažymėto [a- 32P] deoksi-CTP zondo. Tai zondas pripažįsta žmogaus TGFα iRNR, bet ne pelė TGF iRNR.
Pelės TGFα iRNR lygis buvo matuojamas naudojant realaus laiko polimerazės grandininė reakcija (PGR) su gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenazės (GAPDH) kaip vidaus kontrolės. Realaus laiko PGR buvo atliekama naudojant ABI PRISM 7700 Eilės detektorius ir minkštas (taikoma BIOSYSTEMS, Foster City, CA), naudojant DNR liuminescencinių dažų SYBR Green aptikimo. Gruntai buvo sukurta naudojant Gruntas Express projektavimo programinės įrangos (taikomųjų BIOSYSTEMS). Galutinis rezultatas kiekvienam mėginiui buvo normalizuoti atsižvelgiant į atitinkamos GAPDH vertės. Pradmenų sekos yra taip: pelės TGFα: 5'-CCTGAGCACCCGAAGAT-3 'ir 5'-CCTTCCCTCATGCCTTACT-3'; GAPDH: 5'-GTCGTGGATCTGACGTGCC-3 "ir 5'-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3"
Vakarų dėmė analizė
skrandžio audinių mėginių buvo apipjaustyta ir bendro baltymo iš skrandžio gleivinės buvo homogenizuoti Ripa buferio, kurio sudėtyje yra proteazės inhibitoriais kokteilį. (phenylmethylsulphonyl fluoridas, pepstatin, leupeptiną ir aprotininą) (Roche Diagnostics, Manheimas, Vokietija). Supernatantas buvo atskirtos SDS-PAGE metodu, ir tada buvo pernešama į polivinilideno difluoridą membranos. Membrana buvo zonduotos su šių antikūnų: antikūnų iNOS, COX-1, COX-2, HSP70, ir Bcl-2, kuri buvo tie patys, naudojami Morfologiniai tyrimai; pelės monokloninis antikūnas prieš Bax (Santa Cruz Biotech.); triušis polikloninis antikūnas kaspazė 3 (Santa Cruz Biotech.); ir pelės monokloninis antikūnas prieš aktino gijų (Santa Cruz Biotech.). Antikūnų reaguojantis juostos buvo aptiktas naudojant ECL aptikimo sistemą (Amersham, Buckinghamshire, Jungtinė Karalystė).
Matavimas gastrinas pervežimas Serumas Gastrino buvo matuojamas naudojant gastrinas radioimuninė rinkinį (gastrinas RIA komplektas, Dainabot, Tokijas, Japonija). Antikūnas yra specifinis gastrino su amido fragmentą jos karboksilo galo.
Matavimas prostaglandino E2
skrandžio gleivinės buvo homogenizuoti, esant 4 ° C temperatūroje, lizės buferiniame tirpale. Homogenatai buvo centrifuguojamas 12000 rpm 20 min, o supernatantai buvo atliktas prostaglandinų E 2 analizėje, naudojant prostaglandino E 2 monokloniniai fermentų Immunoassay Kit (Cayman chemijos, Ann Arbor, MI), pagal gamintojo nurodymus .
Statistinė analizė
Statistinė analizė buvo atlikta pakartotinai priemonės dispersinė analizė (ANOVA) viso ilgio skrandžio pakitimų iki neporiniai t-testas skrandžio gleivinės kraujotaką sumažėjimas santykis. Visos vertės yra išreiškiamos kaip vidurkis ± SE. P < 0,05 buvo priimta kaip statistiškai reikšmingas.
Rezultatai
apibūdinimas TGFα ekspresija, TG pelės skrandžio gleivinės Viesbutis The WT CD1 deformacijų ir TGFα-transgenui ekspresuojančiam MT42 linija pelės augo panašiai ir parodė jokio pastebimo skirtumo jų funkcijų, elgesio ar gyvenimo trukmė. Didžiausias storis pastebėtas skrandžio sienos ir fundic liaukos buvo 3,50 ± 0,18 mm, o 2,33 ± 0,20 mm, atitinkamai WT pelių ir 3,85 ± 0,24 mm, o 2,63 ± 0,16 mm, atitinkamai TG pelių; nebuvo jokių reikšmingų skirtumų skrandžio gleivinės ir liaukų tarp WT ir TG pelėmis formos. Be to, prie normalaus išvaizdą skrandžio gleivinės, tai TG pelės linija taip pat buvo normalus-rodomi kepenų, kasos, ir kitus organus.
Mes tada palyginti rūgšties sekrecijos laikotarpiu tarp WT ir TG pelėms. Per WT pelių, maksimalus rūgšties išeiga žymiai padidėjo nuo bazinio lygio 25 ± 1,4 mEq /h 50 ± 5,8 mEq /h po pentagastrino stimuliacijos. Priešingai, TG pelėmis, maksimalus rūgštis produkcija padidėjo iki mažiau, kiek 30 ± 5,7 mEq /h nuo bazinio produkcijos 23 ± 0,7 mekv /h (n = 5 WT ir TG pelėmis). Užapvalintos rūgšties išeiga gali atspindėti sumažintas Išorinis ląstelių masę TG gleivinės (1e paveikslas). 1 pav apibūdinimas TGFα ekspresija TG gleivinę. Mastelis kiekvienoje figūra rodo 100 mikronų. (A) pasiskirstymas TGFα-ekspresuojančių ląstelių. Rudas TGFα teigiami ląstelės buvo matomi palei luminal duobę regione WT gleivinės, pailgos foveolar duobę regiono ir apatinio trečdalio liaukų regione TG gleivinę. (B) Perdangos raudonųjų spalvos TGFα-teigiamų ląstelių ir žaliųjų spalvos H + /K + -ATPazės-teigiamų parietalinėse ląstelėse. Mažesnės TGFα teigiami ląstelės branduolio skiriasi nuo žalios spalvos pakauškaulio ląstelių TG gleivinę. (C) Šiaurės dėmė žmogaus TGFα mRNR ir PGR papildyta pelės TGFα mRNR. Žmogaus TGFα iRNR išreiškiamas vien TG gleivinės (kairėje skydelio), bet PGR papildyta pelės TGFα iRNR yra išreiškiamas panašiai tiek WT ir TG gleivinės (dešinėje skydelio). (D) Western blot iš TGFα tarpinių formų. TGFα pirmtakas (20 kDa) ir jos tarpinių formų yra ryškinamos intensyviau TG gleivinės nei WT gleivinę. (E) lokalizacijos EGF receptoriaus skrandžio gleivinės. "EGF receptorių (EGF R), buvo tamsintas su Cy3 (raudona) ir H + /K + -ATPazės buvo tamsintas su FITC (žalia). EGF-R buvo immunostained vidutiniškai viršutiniame duobę regione ir tvirtai apatiniame liaukų regione panašiai tiek WT ir TG gleivinės. (F) pasiskirstymas metalotioneinu į skrandžio gleivinę. Metalotioneino yra immunostained stipriai apatiniame liaukų regione, ir vidutiniškai išilgai foveolar regione. (G) Pailgėjimas iš skrandžio duobę TG gleivinę. PCNA teigiami ląstelės pasiskirsto viršuje trečdalis regiono WT skrandžio liaukų, o jie yra platinami daugiau daugelį kartų ir iš esmės vidurinės liaukų regione. (H) PAS dažymo rodo pailgos duobės į TG gleivinę.
Išraiška TGFα transgenui
TGFα ekspresija ląstelių tipų, buvo nustatyti remiantis ląstelių tipui būdingas imunodažymu ir jų gleivinės vietoje. TGFα buvo pranešta immunostained palei GSM ląstelių skrandžio duobę žmonėms [14], ir žiurkės [15], ir kartu gleivinės kaklo ląstelių regionas FVB padermės pelių [16]. Šioje studijoje, rudos spalvos TGFα teigiami ląstelės buvo platinamas kartu su foveolar regione tiek WT ir TG gleivinės ir palei apatinį liaukų regione TG gleivinės (1a pav.) Į TGFα teigiami ląstelės palei foveolar regione pasirodė skrandžio duobės ląstelės, remiantis jų buvimo vietą (1b pav, viršutinė panelės), ir tie, palei apatinį liaukų regione TG gleivinės nebuvo sutampa su žalia spalvos H + /K + - ATPazės teigiami parietalinės ląstelės (1b pav mažesnis skydelis), bet sutampa su pepsinogen teigiamas vyriausiųjų ląstelių (duomenys neparodyti). Antikūnų mes naudojamas imunodažymu už TGFα negalėjo atskirti žmogaus ir pelės TGFα, tačiau jo iRNR zondas gali padaryti už Šiaurės blot analizė. Žmogaus TGFα-transgeno buvo išreikštas TG gleivinės, o ne išraiška buvo pažymėta WT gleivinės (1c pav, kairiajame skydelyje). Priešingai, endogeninė pelės TGFα iRNR buvo panašiai išreikštas tiek WT ir TG gleivinės pagal realaus laiko PGR (1c pav, tiesa skydelio). TGFα yra 50 aminorūgščių peptidas, gaunama iš jos 160 aminorūgščių membrana apimanti pirmtakas suskaldomas naviko nekrozės faktoriaus-a-konvertuojančio fermento (TACE) [27, 28]. Su pertekliaus išraiška žmogaus TGFα-transgeno TG gleivinės, maždaug 20 kDa TGFα pirmtakas ir jos tarpinių formų buvo padidintos munoblotingu (1d pav).
Nuo tiek pirmtakas ir perdirbti formos buvo vienodai aktyviai stimuliuoti EGF -R [28], mes toliau nagrinėjo "EGF-R lokalizacijos gleivinės. "EGF-R buvo lokalizuotas labai apatiniame vyriausiasis ląstelių grupių regione ir nuosaikiai gleivinės kaklo ląstelių regione ir foveolar duobę regione tiek WT ir TG gleivinės (1e paveikslas), kaip buvo pranešta anksčiau už žiurkių skrandžio gleivinės [15 ]. Kadangi TGFα transgeno buvo kontroliuojama pagal pelės metalotioneiną geno [20] metalotioneinu buvo pranešama, gaminamas skrandžio gleivinės [29], mes išnagrinėjome metalotioneiną ekspresija ląstelių tipus gleivinę. Immunohistochemically, mes pažymėti metalotioneiną dažymo daugiausia palei apatinį liaukų regione ir scatteringly palei duobę regiono valdymo CD1-deformacijų skrandžio gleivinės (1f paveikslas). Tokiu būdu, kad paskirstymo TGFα išreiškiančias, iš Cell-rūšis yra panašus į tą, metalotioneiną išreiškiančias, iš ląstelių TG skrandžio gleivinės (Duomenys 1a ir 1f).
WT pelės gleivinės, H + /K + - ATPazės teigiami parietalinės ląstelės buvo plačiai paplito visame liaukų regione, išskyrus aukščiausio duobę sluoksniu, o H + /K + - ATPazės teigiamas liaukų regionas buvo sumažintas aukštis TG gleivinė (1e pav.) Iš tiesų, tuo duobės regione, kurioje buvo patvirtinta pagal PCNA dažymo pagrindo sąsmauka, buvo perkeltas žemyn į TG gleivinės (1g pav) viduryje. Be to, PCNA-teigiamos ląstelės buvo tankiai išplatinta vartoti per gleivinę, viduryje. Nuosekliai, PAS dažymo teigiamas foveolar duobė buvo pailgos TG gleivinės priešingai trumpą duobę WT gleivinės (1h pav.) Taigi, nors iš skrandžio gleivinės aukštis buvo panašus tarp WT ir TG gleivinės, proliferacinis zona buvo perkeltas žemyn ir foveolar duobę regionas buvo daugiau pailgos su sumažintu liaukų regione TG mocosa. Kadangi GPM ląstelių augimas yra stipriai padidintas Gastrino [25, 30], mes palyginti serumą gastrinas lygių tarp WT ir TG pelių, bet nerado padidėjimas Gastrino serumo lygį TG pele (Wt, 213 ± 41 pg /ml;., TG, 263 ± 47 pg /ml, n = 5, p = 0,438)
Etanolis sukelta skrandžio žalai WT ir TG pelė gleivinės
Orogastric administravimo rūgštinto etanolio (100 pl) sukelia hemoraginį žalos į TG gleivinės (2a pav, kairėje). Histologiškai žala nuplėšti duobės ir sąsmauka regionus ir pasiekė vidurio liaukų regione (2b pav, kairėje). Priešingai, ši sužalojimo TG pelės gleivinės Rūšiuoti nebuvo pastebimas (2a pav, dešinėje). Žalos buvo histologiškai apsiriboja luminal duobę regione (2b pav dešinėje). Be WT gleivinę, nukentėjusioji plotas sparčiai augo su piko metu 6 h po etanolio administracijos, o TG gleivinės plotas lėtai ir minimaliai padidino be pažymėto piko (2c pav). Nuosekliai, Apoptozinės ląstelės rodomas iki Tünel dažymo giliai platinami apatinės liaukų regionas 3 h po etanolio administracijos WT gleivinės, o apoptozės ląstelės buvo tik duobės regione, bet nebuvo apimti liaukų regione TG gleivinės ( 2d pav.) 2 pav Etanolis sukelta skrandžio žalos, kaip skrandžio gleivinės. (A) Makroskopinis vaizdas iš skrandžio gleivinės. Skalė: 5 mm. Abu gleivinės yra 6 h po etanolio administracija. Atkreipkite dėmesį, kad WT gleivinė rodo platus hemoraginių pažeidimai, priešingai, TG gleivinė atrodo nepažeista po etanolio administracija. (B) hematoksilinu ir eozinas dažymo etanolio-sužeisti WT gleivinės (kairėje) ir TG gleivinės (dešinėje). Pastaba giliai opų formavimąsi WT gleivinę. Mastelis: 100 mkm. (C) laikas kursas etanolio sukeliamo skrandžio traumos. Sužeistieji plotas grafiškai laiko atžvilgiu iki 12 h po etanolio administracija. Kiekvienas taškas reiškia penkių pelių vidurkis. p
< 0,05 (D) TUNEL dažymo WT gleivinės (kairėje) ir TG gleivinės (dešinėje). Abi dalys yra eilės tiems 2B
, atitinkamai. Apoptozinės ląstelės matomi su tamsiai rudos branduolių. Daugybė Apoptozinės ląstelės pažymėta WT gleivinę. Visos nuotraukos buvo 6 h po etanolio administracija. Mastelis:. 100 mkm
skrandžio gleivinės kraujotaką etanolio gydytų gleivinės
Nors buvo pranešta iš apsaugančių reguliavimo veiksnių, įskaitant NE, CGRP, COX2 ir HSP70 [12, 13, 31, 32] , gleivinės kraujotaka buvo pasiūlyta kaip pagrindinis veiksnys, apsaugos ir atkūrimo etanolio sukeliamo skrandžio traumos [1, 33]. Mes matuojamas skrandžio kraujotaką pateikdamas lazerių Doplerio srauto matuokliu zondą ant skrandžio gleivinės prieinama per veikiami pilvo sienos į anesteziją pele. Skrandžio kraujotaka sumažėjo pažymėta 43,5 ± 6,37% po etanolio administracija dėl skrandžio gleivinę WT pele (3 paveikslas). Priešingai, jis sumažėjo tik 17,2 ± 9,21% po etanolio administracija TG gleivinės (3 paveikslas). Tokiu būdu, skrandžio kraujotaka buvo gerai išlaikytas TG gleivinės net po to, kai etanolio gydymui. Nuo gleivinės išemija yra vienas iš svarbiausių veiksnių, opas [33], skrandžio kraujotaka priežiūra, atrodo, yra esminis veiksnys gleivinės apsaugai. 3 pav įvertinimas skrandžio gleivinės kraujotakos skrandžio gleivinės. Skrandžio gleivinės kraujotaka buvo vertinama lyginant kraujo srauto santykį prieš ir po to, kai etanolio gydymui. Santykis buvo gautas kaip procento nuo kraujo srauto prieš gydymą, kuris buvo daug didesnis WT gleivinės nei TG gleivinę. * P
< . 0.03
išraiška apsaugančių baltymų: NE sintezės, COX-2 ir HSP70
Tirti aukšto kraujo srauto išlaikymo TG gleivinės mechanizmą, mes išnagrinėjo NO synthases išraišką, kuri neteikia jokių nuo arginino, ir atpalaiduoja kraujagyslių lygiuosius raumenis per "GMP priklausomas baltymų kinazės [34]. Yra trijų tipų NO sintezės (NOS): nervų NOS (nNOS), indukuojamąją NOS (iAOS) ir endotelio NOS (eNOS). nNOS Enas yra constitutively išreiškė, o iAOS sukeltos ant skrandžio traumos [35]. nNOS buvo platinamas panašiai į Pa dažymo per foveolar duobę regione (1g paveikslą); ji buvo pastebėta, kad per pailgos duobę TG gleivinės ir buvo apribota iki luminal duobę WT gleivinės (4a pav). eNOS buvo silpnai išsibarstė po visą skrandžio gleivinės panašiai tiek WT ir TG gleivinės (duomenys neparodyti). INOS dažymo buvo nedidelis, kaip WT gleivinės, nors tai buvo labai sukeltas apatiniame liaukų regione po to, kai gleivinė buvo veikiami etanolio (4b pav). Į TG gleivinės, iNOS buvo konstitutyviai išreikštas apatiniame liaukų regione panašiai prieš ir po traumos (4b paveikslas), kuri, kaip ir toliau prisidėti prie aukšto kraujospūdžio srauto išlaikymo. 4 pav imunodažymu NO skrandžio gleivinės synthases. Mastelis: 100 mkm. (A) nNOS imunodažymu. nNOS buvo matomas kartu duobę regione, todėl jos platesniam platinimui išilgai pailgo duobę TG gleivinę. (B) iNOS imunodažymu. iAOS buvo sukeltas apatiniame liaukų regione po etanolio sužalojimo WT gleivinę, kadangi buvo constitutively išreikšta ta pačia regione TG gleivinės nepriklausomai nuo etanolio traumos.
prostaglandinai buvo pasiūlyta kaip pagrindinis apsaugančių faktorius daugiau nei prieš tris dešimtmečius [ ,,,0],8], o jų vaidmenys buvo plačiai ištirtas [36, 37]. Su prostaglandinų formavimo fermentų vaidmuo, COX-1 ir COX-2, buvo prieštaringas gleivinės apsaugos nuo skrandžio dirgiklių [7, 11, 32]. Mes išnagrinėjo COX į WT ir TG gleivinės išraišką per etanolio traumos. Iš COX-1 išraiška nesiskyrė tarp WT ir TG gleivinės, nei prieš, nei po etanolio žalos (5b pav.) COX-2 buvo neaptinkamas WT gleivinę, bet jo išraiška tapo akivaizdu, 6 h po to, kai etanolio traumos, ir jos dažymo buvo lokalizuotas į apatinę liaukų regione (5a pav ir 5b). Į TG gleivinės, COX-2 imunodažymu buvo intensyvus tuo pačiu regione dar prieš žalos ir išliko teigiamas po traumos (5a pav). Nuo Įrodyta Coxs būti išreikštas mezenchiminių ląstelių, tokių kaip fibroblastų ir vienabranduolėse ląstelių skrandžio gleivinės [38], o streptoavidin /biotinas /HPR metodas kartais kelia klaidingai teigiamą dažymo, mes atliekame imunofluorescencinių dažymo naudojant šaldytą skyrių, kuris patvirtino COX išraiška panašiai apatiniame liaukų regione TG gleivinės (duomenys neparodyta). Munoblotingu, COX-2 padidėjo po to, kai WT gleivinės traumos, kadangi ji buvo labai padidėjusi panašiu mastu prieš ir po traumos (pav 5b). Nuosekliai, prostaglandino E 2 lygis buvo gerokai didesnis TG gleivinės nei WT gleivinės (5c pav.)

• Genomo sekos Helicobacter suis palaiko savo vaidmenį skrandžio pathology
• Iki-reguliavimo CLDN1 skrandžio vėžio yra susijęs su sumažėjusiu survival