Integratieve rol van transformerende groeifactor-α in de celbescherming mechanismen van maagslijmvlies

Integrative rol van transforming growth factor-α in de celbescherming mechanismen van beschadiging van het maagslijmvlies
Abstracte achtergrond
transforming growth factor α (TGFa) beschermt tegen beschadiging van het maagslijmvlies en faciliteert wondgenezing. Echter, is de overexpressie bekend hypertrofische gastropathy ziekte lijkt Menetrier in transgene (TG) muizen induceren op een FVB achtergrond, als een van de auteurs eerder beschreven. We onderzochten een andere TGFa expressie muis lijn op een CD1 achtergrond, wiens maagslijmvlies lijkt normaal. Aangezien dit TG muis had een sterke weerstand tegen-ethanol geïnduceerde maag letsel, we beschouwd als de lange termijn effect van TGFa verschillende maag beschermingsmechanismen.
Methods
TGFa expressie transgene (TG) muis lijnen met humaan TGFa cDNA onder de controle van de muis metallothioneïne-I-gen promoter werden gegenereerd op een achtergrond CD1 muizen en geanalyseerd hun ethanol schade-resistente fenotypen geproduceerd door TGFa.
Resultaten
In de TG mucosa werd bloedstroom onderhouden ethanol na letsel . Verder werden neurale en induceerbare typen NO synthase consistent en algemeen voor in de TG mucosa in vergelijking met de beperkte distributie van neurale typen NO synthase in de put luminale gebied van het wild-type (WT) mucosa. COX-2 en de upstream transcriptiefactor NFkB werden constitutief verhoogd in de TG slijmvlies nog voor ethanol administratie, terwijl ze in dezelfde regio van de WT slijmvlies pas na ethanol verwondingen werden veroorzaakt. Twee anti-apoptotische eiwitten, HSP70 en Bcl-2 werden opgereguleerd in de TG mucosa zelfs voordat ethanol toediening, terwijl ze niet werden uitgedrukt in de WT mucosa vóór de verwonding. Verder pro-caspase 3 activatie werd geremd in de TG mucosa, terwijl het werd omgezet in de actieve vorm in de WT mucosa na toediening ethanol.

Conclusie We concluderen dat TGFa handhaaft het maagslijmvlies verdediging tegen gastrische schade die cytoprotective integratie van andere mechanismen. achtergrond
Ethanol is lange tijd gebruikt om een ​​hemorragische maagslijmvlies bij knaagdieren genereren [1]. Met orale toediening van absolute of zoutzuur aangezuurde ethanol, kunnen grote hemorragische lesies geproduceerd in het maagslijmvlies. Deze experimentele maag letsel model werd vaak gebruikt voor het maagslijmvlies bescherming en teruggave studies. Inderdaad zijn een aantal cytoprotective verbindingen getest om hun vermogen te weerstaan ​​gastrische schade, waaronder gastro-intestinale hormonen, groeifactoren, prostaglandinen, bioactieve amines en milde irriterende zoals capsaïcine [2-5] evalueren. Van deze verbindingen, epidermale groeifactor (EGF) familie groei factoren, zoals transformerende groeifactor α (TGFa), zijn gerapporteerd als potente cytoprotectieve verbindingen tegen ethanol-, azijn- zuur, of aspirine geïnduceerde gastrische schade [2, 4].
TGFa werd expressie in de rat maagslijmvlies na orale toediening van aangezuurde taurocholaat of zoutzuur, wijst erop herstellende rol gastrische schade [6]. TGFa gegeven intraperitoneaal beschermd tegen door ethanol geïnduceerde gastrische schade met een aanzienlijke toename van hechtende gastrische mucine bij ratten [7]. De cytobeschermende functie van TGFa bleek te worden gemedieerd door activering van fosfolipase C-γ1, ze niet prostaglandines en was onafhankelijk van de anti-secretoire werking van TGFa [7]. Anderzijds, prostaglandinen en hun synthetische enzym cyclooxygenase (COX), al lang voorgesteld als cytoprotectieve factoren tegen gastrische schade [5, 8]. EGF is aangetoond dat een induceerbare isovorm COX, COX-2 in de rat RGM1 maagslijmvlies cellijn tot expressie door een ERK MAP kinase pathway [9] en in Zwitserse 3T3 fibloblasts, vooral door co-stimulatie met gastrine [10]. Bovendien COX-2-expressie door heparine bindende EGF-achtige groeifactor, een lid van de EGF familie groei factoren, werd geblokkeerd door een specifieke EGF receptor (EGF-R) remmer bij de rat maagslijmvlies [11]. Aldus wordt het EGF-R-signaal te bemiddelen COX-2 inductie in het maagslijmvlies. Ondernemingen De belangrijkste mechanismen is cytoprotectieve maagslijmvlies bloedstroom. EGF en TGFa is aangetoond dat cytoprotectieve effecten via stimulatie van capsaïcine-gevoelige neuronen bij afgifte van calcitonine-gen gerelateerd peptide (CGRP) en stikstofoxide (NO) uitoefent bij ratten blootgesteld aan orogastric ethanol toediening, resulteert in een toename van maagslijmvlies bloed stroom [11, 12]. Daarentegen Konturek et al. geminimaliseerd de rol van de CGRP-afhankelijke toename van de gastrische bloedstroom door aan te tonen dat de toediening van NO-afgevende aspirin bescherming bood tegen absolute ethanol geïnduceerde gastrische schade zelfs capsaïcine-gedenerveerde ratten, waardoor de opwaartse regulatie van heat shock eiwit 70 (HSP70 ) expressie en verzwakking van de oxidatieve schade die sterke opwaartse regulatie van antioxidatieve genen zoals koper zink superoxide dismutase (SOD) en glutathion peroxidase [13].
TGFa werd overwegend immunologisch GSM cellen langs de put maag bij mensen [14], intensief maagzijde mucosale (GSM) cellen via proliferatieve zone en zwak langs de glandulaire gebied onder de proliferatieve zone bij ratten [15], en sterk aan het slijmvlies hals cel gebied FVB /N stam muizen [16]. Anderzijds, werd EGF-R immuno GSM epitheelcellen van de foveolar put en slijmvliezen hals cel tot het lagere klier bij de mens [17]. Bij ratten werd EGF-R gelokaliseerd 'in de put gebied voor het hoofdcel clusters onderaan de maagklieren [15]. Hoewel TGFa bekend is celproliferatie in primaire gekweekte rat maagslijmvlies cellen [18] en hyperplastische proliferatie induceren in de mucosa van de TGFa-expressie transgene (TG) muizen [19, 20], de verdeling van TGFa en EGF-R in terminaal gedifferentieerde maagslijmvlies cellen suggereert dat TGFa uitoefent non-proliferatieve functies waaronder anti-apoptotische effecten en maagepitheel barrièrevorming op een autocriene /paracriene wijze. Bijvoorbeeld, TGFa remde apoptose van een muis maagslijmvlies cellijn GSM06 door expressie anti-apoptotische Bcl-2 familie eiwitten door een NF-kB-afhankelijke route [21]. Maag apicale en basolaterale EGF-R is aangetoond dat een verlaging van paracellulaire permeabiliteit zuur ter bescherming van kliercellen induceren in een zuur milieu [18, 22]. Zo TGFa oefent zowel proliferatieve en non-proliferatie effect op maagslijmvlies functies, en deze diverse TGFa effecten moet opnieuw worden geëvalueerd, althans in termen van de vraag of de resultaten zijn afgeleid van een kortdurende behandeling met behulp van cultuur cellijnen of van lange termijn expressie behulp TGFa-transgen-expressie dieren.
een decennium geleden, een van de auteurs, H. Takagi, gegenereerd TGFa-expressie TG muizenlijnen onder de regeling van de metallothioneïne-genpromotor, en één van deze lijnen (MT100) vertoonde hypertrofische gastropathy lijkt Menetrier ziekte, zoals eveneens getoond door andere onderzoekers [19, 20]. Daarentegen ander TG lijn (MT42) vertonen een normale lijkend maagslijmvlies, hoewel TGFa transgen expressie in dezelfde mate in zowel TG lijnen [20]. Aangezien de MT42 lijn vertoonde een verrassende weerstand tegen ethanol-geïnduceerde schade aan het maagslijmvlies, vonden wij dat het nuttig voor het verkennen van non-proliferatieve effecten van TGFa kan zoals mucosale weerstand tegen ethanol letsel. In het onderhavige onderzoek onderzochten we de lange termijn effecten van TGFa on-ethanol geïnduceerde gastrische schade door het analyseren van veranderingen in cytoprotective en anti-apoptotische regulerende factoren, waaronder gastrische bloedstroom, NO synthase, COX-2, en apoptose geassocieerde eiwitten, zoals HSP70, Bcl-2 en caspase 3.
Methods
TGFa-expressie transgene muis-ethanol geïnduceerde gastrische schade
TGFa-expressie transgene (TG) muizenlijnen TGFa met humaan cDNA onder de controle van de muizen metallothioneïne I gen promoter werden gegenereerd op CD1 of FVB muizen achtergrond, zoals eerder [20] beschreven. Een van de TG lijnen, MT100 op FVB-muis achtergrond, weergegeven hypertrofische gastropathy ziekte lijkt Menetrier's [20], terwijl de andere lijn, MT42 op CD1 muizen achtergrond, vertonen een normale lijkende maagslijmvlies. Het fenotype van de TGFa-TG muis bleek afhankelijk van de muizenstam, omdat zowel de MT100 en MT42 lijnen een vergelijkbaar niveau van TGFa het transgen in de maag [20] tot expressie. In de huidige studie, gebruikten we de MT42 lijn van TGFa expressie TG mannelijke muizen en CD1 wild type (WT) mannelijke muizen op de leeftijd van 6 tot 8 weken. De dieren werden onder gecontroleerde licht gehouden (7:00-07:00) met voedsel en water ad libitum
. Ondernemingen De muizen, met een gewicht van 30-35 g werden gevast gedurende 24 uur voor het experiment, maar mochten gratis toegang tot water. Alle experimentele procedures die de muizen werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Review Committee aan de Gunma University. De muizen werden vervolgens orogastric aangezuurd ethanol (100 ul, 60% ethanol in 0,15 mol /L HCl). Drie, zes en twaalf uur na de aangezuurde ethanol toediening werden de muizen opgeofferd voor de evaluatie van gastrische schade en immunohistochemische analyses en RNA en eiwitten extraheren real time PCR, Northern en Western blot analyses.
Fysiologische studies
maagzuurafscheiding werd gemeten zoals eerder beschreven [20, 23]. Kort samengevat, werden WT-muizen en TG gevast gedurende 3 uur en vervolgens met ether verdoofd. Na het insnijden van buikwand werd de pyrolus geligeerd en de incisie werd gehecht. Het maagsap werd gewonnen 4 uur na de pyrolus ligatie. Voor maximale zuurproductie werd zuursecretie gestimuleerd door injecteren pentagastrine subcutaan (500 ug /kg lichaamsgewicht). Het maagsap werd getitreerd met 0,1 N NaOH tot pH 7,0 met een microtitrator.
Maagslijmvlies bloedstroming werd gemeten met een laser Doppler flowmeter (model SFA211, Advance Co., Tokyo) door een sonde op het oppervlak van de gastrische mucosa, zoals eerder beschreven [24]. De stroom signaal werd gevolgd met de MacLab opnameprogramma. De bloedstroom werd uitgedrukt in verhouding tot het basisniveau.
Morfologische studies Ondernemingen De dikte van het maagslijmvlies werd gemeten vanaf het hoogste gedeelte aan de onderkant van de klier met een micrometer. Op dezelfde manier werden de maag letsel laesies gemeten (breedte- en lengtegraad) met een micrometer om de gewonde gebied te berekenen.
Voor immunokleuring, kregen we antilichamen als volgt. Polyklonale antilichaam tegen H + /K + - ATPase werd verkregen door het injecteren van konijnen pariëtale cel-microsomale fracties in muizen [25]. Konijn polyklonaal antilichaam tegen metallothioneïne was een soort geschenk van Dr. Nagamine, Gunma University School of Health Sciences [26]. We gekocht antilichamen als volgt: konijn polyklonaal antilichaam tegen TGFa, konijn polyklonaal antilichaam tegen EGF-R, geiten polyklonaal antilichaam tegen COX-2, konijn polyklonaal antilichaam tegen NFKB en muizen monoklonaal antilichaam tegen iNOS en nNOS uit Santa Cruz Biotech. (Santa Cruz, CA); muis monoklonaal antilichaam tegen proliferatieve cel nucleair antigen (PCNA) vanaf Zymed Lab. (South San Francisco, CA); schaap antilichaam tegen humane pepsinogeen II van biopur AB (Bubendorf, Zwitserland), dat eveneens reageert met muizen pepsinogeen; konijn polyklonaal antilichaam tegen HSP70 van Stressgen Biotech. (Victoria, BC, Canada); en monoklonaal antilichaam tegen Bcl-2 van BD Biosciences (San Diego, CA).
voor mierikswortelperoxidase (HRP) -catalyzing immunohistochemische kleuring, gehakt magen werden gefixeerd in 10% formaline geneutraliseerd bij 4 ° C gedurende 24 uur, en vervolgens werd ingebed in paraffine voor microtoom snijden. De gedeparaffineerde weefselsecties werden gerehydrateerd en geïncubeerd in 3% waterstofperoxideoplossing endogene peroxidase activiteit te remmen. Vervolgens werden de secties geïncubeerd met een eerste antilichaam hierboven met een geschikte verdunning bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Een gebiotinyleerd secundair antilichaam werd geselecteerd op basis van de eerste antilichaamproducerende diersoorten, en werd vervolgens gebruikt met HRP-geconjugeerd streptavidine. De HRP reactie werd uitgevoerd met 3-amino-9-ethyl-carbazool en waterstofperoxide volgens het met de streptavidine-biotine kleuring Vectastatin Elite kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) geleverd. Positieve kleuringen verscheen bruin van kleur.
Voor immunofluorescentie kleuring werden gehakt maag gefixeerd in 4% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer, pH 7,4 bij 4 ° C gedurende 24 uur. Kleine stukjes gehakt weefsel ondergingen saccharose vervanging en ingebed in OCT-verbinding als voorbereiding op een bevroren sectie met een microtoom. Voor de primaire immuunreactie, werden gesneden secties gehybridiseerd met een eerste antilichaam, en werden vervolgens geïncubeerd met ofwel indodicarbocyanide (Cy3) -geconjugeerd-affiniteit gezuiverd ezel anti-konijn, anti-muis IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), of fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) gemerkt anti-konijnen IgG (Jackson ImmunoResearch), als een secundair antilichaam. Het secundaire antilichaam IgG werd gekozen op basis van de soort waarop de eerste antistof opgewekt werd.
In situ detectie van apoptotische cellen werd uitgevoerd met het in situ Apoptosis Detection Kit (TAKARA BIO INC. Tokyo, Japan). De kit bevat een terminal deoxynucleotidyltransferase-gemedieerde deoxyuridine trifosfaat biotine nick end-labeling (TUNEL) testsysteem. Maag secties werden gepermeabiliseerd met proteinase K, en de 3'-OH-uiteinden van de DNA-fragmenten werden vervolgens gekleurd met de bij de kit geleverde instructies. De kernen gekleurde donkerbruine werden als apoptotische cellen.
RNA analyse
magen schoongemaakt en de totale RNA's werden geëxtraheerd met behulp van TRIzol (Gibco BRL, Tokyo) volgens de door de fabrikant geleverde protocol. Voor Northern blot, werd het totale RNA geëlektroforeerd op een 1,0% agarosegel en overgebracht naar een nylonmembraan (Amersham Pharmacia Biotech, Tokyo). Hybridisatie werd uitgevoerd met een probe van humaan TGFa cDNA (917 bp) gemerkt met [α- 32P] CTP-deoxy. Deze probe herkent menselijke TGFa mRNA, maar niet TGF muis mRNA.
Muis TGFa mRNA werd gemeten met een Real-time PCR (PCR) met glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) als een interne controle. De real time PCR werd uitgevoerd onder gebruikmaking van de ABI Prism 7700 Sequence Detector en zachte (Applied Biosystems, Foster City, CA) onder toepassing van het DNA fluorescerende kleurstof SYBR Green detectie. Primers werden ontworpen met behulp van de Primer Express design software (Applied Biosystems). Het uiteindelijke resultaat voor elk monster werd genormaliseerd door de respectieve GAPDH waarde. Primersequenties zijn als volgt: muis TGFa: 5'-CCTGAGCACCCGAAGAT-3 'en 5'-CCTTCCCTCATGCCTTACT-3'; GAPDH: 5'-GTCGTGGATCTGACGTGCC-3 'en 5'-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3'
Western blotanalyse
Gastric weefselmonsters werden bijgesneden en totaal eiwit van het maagslijmvlies werd gehomogeniseerd in RIPA buffer die een cocktail van proteaseremmers. (fenylmethylsulfonylfluoride, pepstatine, leupeptine, en aprotinine) (Roche Diagnostics, Mannheim, Duitsland). Het supernatant werd gescheiden op een SDS-PAGE gel, en werd vervolgens geblot op een polyvinylideendifluoridemembraan. Het membraan werd gehybridiseerd met de volgende antilichamen: antilichamen tegen iNOS, COX-1, COX-2, HSP70 en Bcl-2, die dezelfde als gebruikt voor morfologische studies waren; muis monoklonaal antilichaam tegen Bax (Santa Cruz Biotech.); konijn polyklonaal antilichaam tegen caspase 3 (Santa Cruz Biotech.); en monoklonaal antilichaam tegen actine filamenten (Santa Cruz Biotech.). -Antilichaam reageerde banden werden gedetecteerd met gebruikmaking van een ECL detectiesysteem (Amersham, Buckinghamshire, UK). Meet- gastrine
serumgastrinespiegel werd gemeten met een gastrine radioimmunoassay kit (gastrine RIA kit, Dainabot, Tokyo, Japan). Het antilichaam is specifiek voor gastrine met een amidegroep op de carboxylterminus. Meet- van prostaglandine E2 Ondernemingen De maagslijmvlies werd gehomogeniseerd bij 4 ° C in lysisbuffer. Homogenaten werden gecentrifugeerd bij 12.000 rpm gedurende 20 min en de supernatanten werden onderworpen aan prostaglandine E 2 assay met een prostaglandine Ei 2 Monoklonale Enzyme Immunoassay Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), volgens de aanwijzingen van de fabrikant Statistische analyse Statistische analyse
.
werd uitgevoerd door herhaalde meting variantieanalyse (ANOVA) voor de totale lengte van de gastrische lesies door ongepaarde t-test voor maagslijmvlies bloedstroom afname ratio. Alle waarden zijn uitgedrukt als het gemiddelde ± SE. P < 0,05 werd als statistisch significant geaccepteerd.
Resultaten
Karakterisering van de TGFa expressie TG muis maagslijmvlies
De WT CD1 stam en TGFa-transgene uitdrukken MT42 lijn muizen groeide op dezelfde manier en toonde geen merkbaar verschil in hun eigenschappen, gedragingen of levensduur. De grootste dikte waargenomen voor de maagwand en fundus klieren waren 3,50 ± 0,18 mm en 2,33 ± 0,20 mm werden in de WT-muizen, en 3,85 ± 0,24 mm en 2,63 ± 0,16 mm, respectievelijk in de TG muizen; er waren geen significante verschillen in de vorm van de gastrische mucosa en klieren tussen WT- en TG muizen. Naast het normale uiterlijk van het maagslijmvlies, had ook dit TG muizenlijn normaal lijkend lever, pancreas en andere organen.
Wij vergeleken zuursecretie capaciteit tussen de WT en Tg-muizen. In de WT-muizen, maximale zuur productie aanzienlijk gestegen van basale niveau van 25 ± 1,4 mEq /h tot 50 ± 5,8 mEq /h na de pentagastrine stimulatie. Dit in tegenstelling tot de TG muizen, maximale maagzuurproductie verhoogd in mindere mate 30 ± 5,7 mEq /h uit de basale productie van 23 ± 0,7 mEq /h (n = 5 in WT-muizen en TG). De stomp zuur uitgang kan de gereduceerde pariëtale cel massa in de TG slijmvlies (Figuur 1e) weerspiegelen. Figuur 1 Karakterisering van de TGFa-expressie TG mucosa. Schaal in elke figuur geeft 100 urn. (A) verdeling van TGFa-exprimerende cellen. Bruin gekleurde TGFa-positieve cellen werden zichtbaar langs het luminale kuilgebied in de WT mucosa, de langwerpige foveolar kuilgebied en de onderste eenderde van de glandulaire regio in de TG mucosa. (B) Overlap van rood-gekleurde TGFa-positieve cellen en groengekleurde H + /K + -ATPase-positieve pariëtale cellen. Lagere TGFa-positieve cellen in cluster verschillen van de groengekleurde pariëtale cellen in de mucosa TG. (C) Northern blot van menselijk TGFa mRNA en PCR-geamplificeerd muis TGFa mRNA. Menselijke TGFa mRNA tot expressie wordt gebracht in de mucosa alleen TG (linker paneel), maar PCR-geamplificeerd muis TGFa mRNA wordt eveneens tot expressie gebracht in zowel WT en TG slijmvliezen (rechter paneel). (D) Western blot van TGFa tussenvormen. TGFa precursor (20 kDa) en de tussenvormen zijn intensiever gevisualiseerd in de TG mucosa dan in de WT mucosa. (E) lokalisatie van EGF receptor in het maagslijmvlies. EGF receptor (EGF-R) werd gekleurd met Cy3 (rood) en H + /K + -ATPase werd gekleurd met FITC (groen). EGF-R was matig in het bovenste kuilgebied en sterk immuno in het onderste glandular regio eveneens in zowel WT en TG slijmvliezen. (F) Distributie van metallothioneïne in het maagslijmvlies. Metallothioneine is sterk immunostained in de lagere klier regio, en matig langs de foveolar regio. (G) Verlenging van de maag van de put TG mucosa. PCNA-positieve cellen verdeeld bovenaan in het derde gebied in de WT maagklieren, terwijl ze meer talrijk en breed verspreid in het midden glandulaire regio. (H) PAS kleuring toont langwerpige put in de TG mucosa.
Expressie van TGFa transgen
TGFa-expressie celtypen werden geïdentificeerd op basis van cel-specifieke immunokleuring en de mucosale plaats. TGFa verluidt immunologisch langs de GSM-cellen in de maag put bij mensen [14] en ratten [15], en langs het slijmvlies hals cel gebied in de stam FVB muizen [16]. In de onderhavige studie werden bruin gekleurde TGFa-positieve cellen verdeeld over de foveolar gebied van zowel de WT- en TG mucosae en langs het onderste gebied van glandulaire mucosa de TG (figuur 1a). De TGFa-positieve cellen langs de foveolar gebied bleek maag pitcelen, gebaseerd op hun locatie (figuur 1b, bovenste paneel), en die langs de onderste glandulaire gebied van de TG slijmvlies niet overlappen met de groengekleurde H + /K + - ATPase-positieve pariëtale cellen (figuur 1b, onderste paneel), maar overlappen het pepsinogeen-positieve chief cellen (gegevens niet getoond). Het antilichaam we hebben gebruikt voor immunokleuring voor TGFa kon geen onderscheid maken tussen mens en muis TGFa, maar de mRNA sonde kon doen dit voor het Northern blotanalyse. De menselijke TGFa-transgen tot expressie gebracht in de mucosa TG terwijl geen expressie in de mucosa WT (figuur 1c, linkerpaneel) opgemerkt. Daarentegen werd endogeen muis TGFa mRNA eveneens uitgedrukt in zowel WT en TG slijmvliezen door real time PCR (figuur 1c, rechter paneel). TGFa is een 50 aminozuur peptide, afgeleid van de 160 aminozuur-membraanoverspannende precursor gesplitst door tumornecrosefactor-α-omzettend enzym (TACE) [27, 28]. Met het overschot expressie van het menselijke TGFa-transgen in de TG mucosa, een ongeveer 20 kDa precursor TGFa en tussenvormen verhoogd met immunoblotting (Figuur 1d).
Aangezien zowel de precursor en verwerkte vormen waren even actief stimuleren EGF -R [28], we verder onderzocht EGF-R lokalisatie in het slijmvlies. EGF-R werd zwaar gelokaliseerd in de onderste chief cel cluster regio en matig in de slijmvliezen nek cel regio en in de foveolar pit gebied in zowel de WT en TG slijmvliezen (Figuur 1e), zoals eerder werd gemeld voor de rat maagslijmvlies [15 ]. Aangezien de TGFa transgen onder de muizen metallothioneïne-gen [20] werd gecontroleerd en metallothioneïne is naar verluidt geproduceerd in het maagslijmvlies [29], onderzochten we de metallothioneïne expressie brengende cel-soorten van het slijmvlies. Immunohistochemisch, merkte we metallothioneïne kleuring meestal langs de onderste klieren regio en scatteringly langs de put gebied van de controle CD1-stam maagslijmvlies (figuur 1f). Zo is de verdeling van TGFa-expressie celtypen is vergelijkbaar met die van metallothioneïne expressie brengende cellen in de TG maagslijmvlies (figuren 1a en 1f).
In de WT muis mucosa, de H + /K + - ATPase-positieve pariëtale cellen werden wijd verspreid over de klier-regio met uitzondering van de top-pit laag, terwijl de H + /K + - ATPase-positieve klieren gebied werd verminderd in hoogte in de TG mucosa (figuur 1e). Inderdaad, de isthmus aan de basis van de put regio, die werd bevestigd door PCNA-kleuring, werd beneden verplaatst naar het midden van de TG mucosa (figuur 1G). Bovendien waren PCNA-positieve cellen dik verdeeld in het midden van de mucosa. Consequent, was de PAS-kleuring-positieve foveolar put langwerpig in de TG mucosa in tegenstelling tot de korte put in de WT mucosa (Figuur 1H). Ofschoon de hoogte van het maagslijmvlies vergelijkbaar tussen de WT en TG slijmvliezen, werd de proliferatieve zone naar beneden verplaatst en de foveolar kuilgebied was langwerpig met een verminderde klier regio in de TG mocosa. Aangezien de groei pitcellen sterk verhoogd door gastrine [25, 30], vergeleken we de serumgastrinespiegels tussen WT- en TG muizen maar vond geen toename van het serum gastrine in de TG muizen (WT, 213 ± 41 pg /ml;. TG, 263 ± 47 pg /ml, n = 5, p = 0,438)
-ethanol geïnduceerde maag letsel bij de WT en TG muis slijmvliezen
Orogastric toediening van aangezuurd ethanol (100 ui) veroorzaakt hemorragische letsel bij TG mucosa (figuur 2a, links). Histologisch de schade afgepeld de put en de landengte regio's en bereikt om de mid-glandulaire regio (Figuur 2b, links). In tegenstelling tot dit soort schade in de TG muis slijmvlies was niet opvallend (figuur 2a, rechts). De schade werd histologisch beperkt tot de luminale pit regio (Figuur 2b, rechts). In de WT mucosa, de gewonde gebied snel toe met een piek bij 6 uur na toediening van ethanol, terwijl de TG mucosa gebied langzaam en minimaal verhoogd zonder een duidelijke piek (figuur 2c). Consequent, apoptotische cellen getoond door de TUNEL kleuring diep verdeeld over de onderste klieren regio 3 uur na de ethanol toediening in de WT slijmvlies, terwijl de apoptotische cellen beperkt waren tot de put regio, maar niet uit te breiden tot de klier regio in de TG slijmvlies ( Figuur 2d). Figuur 2 Ethanol-geïnduceerde maag letsel in de maag slijmvliezen. (A) Macroscopisch aanzicht van het maagslijmvlies. Schaal: 5 mm. Beide slijmvliezen worden 6 uur na toediening ethanol. Merk op dat de WT mucosa vertoont een uitgebreide hemorrhagische laesies daarentegen de TG mucosa lijkt onbeschadigd ethanol na toediening. (B) hematoxyline en eosine kleuring van ethanol gewonden WT mucosa (links) en TG mucosa (rechts). Let op de diepe zweervorming in de WT mucosa. Schaal: 100 urn. (C) Time loop van ethanol-geïnduceerde maag letsel. Gewonde gebied wordt uitgezet tegen de tijd tot 12 uur na de toediening ethanol. Elk punt vertegenwoordigt een gemiddelde van vijf muizen. p
< 0,05 (d) TUNEL kleuring van WT mucosa (links) en TG mucosa (rechts). Beide secties opeenvolgend met die in
2B, respectievelijk. Apoptotische cellen zijn zichtbaar met donkerbruine kernen. Talrijke apoptotische cellen worden aangegeven in de WT mucosa. Alle foto's waren 6 uur na de toediening van ethanol. Schaal:. 100 urn
Maagslijmvlies bloedstroom in de ethanol-behandelde mucosa
Hoewel een aantal cytoprotective regulerende factoren gerapporteerd, waaronder NO, CGRP, COX2 en HSP70 [12, 13, 31, 32] , mucosale doorbloeding is voorgesteld als een primaire factor voor de bescherming en teruggave van ethanol-geïnduceerde maag letsel [1, 33]. We maten gastrische bloedstroom door een sonde van de laser Doppler flowmeter op het maagslijmvlies toegankelijk via een blootgestelde buikwand in de verdoofde muis. Gastrische bloedstroom afgenomen teken van 43,5 ± 6,37% ethanol na toediening op de gastrische mucosa van de WT muis (Figuur 3). Daarentegen alleen daalde 17,2 ± 9,21% ethanol na toediening aan de mucosa TG (figuur 3). Aldus werd de maag bloedstroom Onderhouden in de TG mucosa zelfs na behandeling met ethanol. Aangezien mucosale ischemie is een van de belangrijkste factoren ulcerogene [33], is de handhaving van gastrische bloedstroom blijken een essentiële factor voor mucosale bescherming zijn. Figuur 3 Beoordeling van maagslijmvlies bloedstroom in de maag slijmvliezen. Maagslijmvlies bloedstroming werd beoordeeld door de bloedstroom verhouding voor en na de behandeling met ethanol. De verhouding werd verkregen als percentage ten opzichte van de bloedstroom voor de behandeling, die veel groter in de WT mucosa dan in de TG slijmvlies was. * P
< . 0,03
Expressie van cytoprotectieve eiwit: NO synthase, COX-2, en HSP70 Belgique Om het mechanisme van hoge bloedstroom onderhoud in de TG mucosa onderzoeken, onderzochten we de expressie van NO synthase, waarbij NO maakt uit arginine, en ontspant gladde spieren via cGMP-afhankelijke eiwitkinase [34]. Er zijn drie typen NO synthase (NOS): neurale NOS (nNOS), induceerbaar NOS (iNOS) en endotheliaal NOS (eNOS). nNOS en eNOS worden constitutief tot expressie, terwijl iNOS wordt geïnduceerd op de maag letsel [35]. nNOS werd op dezelfde wijze verdeeld over de PAS-kleuring over de foveolar put regio (figuur 1 g); Het waargenomen over de langwerpige schacht van de TG mucosa en is beperkt tot de luminale put van de WT mucosa (figuur 4a). eNOS werd zwak verspreid over de gehele maagslijmvlies eveneens in zowel WT en TG slijmvliezen (gegevens niet getoond). De iNOS kleuring was verwaarloosbaar in de WT mucosa, maar deze zijn sterk werd geïnduceerd in de onderste glandulaire gebied na het slijmvlies blootgesteld aan ethanol (figuur 4b). In de TG mucosa werd iNOS constitutief tot expressie gebracht in het onderste gebied glandular eveneens vóór en na de verwonding (figuur 4b), die lijkt verder bij te dragen tot de handhaving van hoge bloedstroom. Figuur 4 Immunokleuring NO synthases in het maagslijmvlies. Schaal: 100 urn. (A) nNOS immunokleuring. nNOS was zichtbaar langs de pit regio, wat resulteert in haar bredere distributie langs de langwerpige kuil in de TG slijmvlies. (B) iNOS immunokleuring. iNOS werd geïnduceerd in de onderste klieren regio na ethanol letsel bij de WT slijmvlies, terwijl het constitutief werd uitgedrukt in dezelfde regio van de TG slijmvlies ongeacht ethanol letsel.
Prostaglandinen werden voorgesteld als een belangrijke factor cytoprotectieve meer dan drie decennia geleden [ ,,,0],8] en de rollen zijn uitvoerig bestudeerd [36, 37]. De rol van de prostaglandine-vormende enzymen, COX-1 en COX-2, is controversieel in de mucosale bescherming tegen maag- irriterende [7, 11, 32] is. We hebben gekeken naar de expressie van COX in de WT en TG slijmvliezen tijdens ethanol letsel. De expressie van COX-1 verschilde niet tussen de WT en TG slijmvliezen, of vóór of na de verwonding ethanol (figuur 5b). COX-2 was niet detecteerbaar in de WT mucosa, maar de expressie bleek 6 uur na letsel ethanol en de kleuring was gelokaliseerd in het onderste glandulaire regio (figuur 5a en 5b). In de TG slijmvlies, de COX-2 immunokleuring was intens op hetzelfde gebied nog voordat de blessure en bleef positief na het letsel (figuur 5a). Aangezien Coxs is aangetoond dat expressie worden gebracht in mesenchymale cellen zoals fibroblasten en mononucleaire cellen in het maagslijmvlies [38] en de streptoavidine /biotine /HPR werkwijze weer soms fout-positieve kleuring, voerden we immunofluorescentiekleuring met een bevroren sectie die bevestigd COX expressie eveneens in het onderste gebied van de glandulaire mucosa TG (gegevens niet getoond). Door immunoblotting, COX-2 verhoogd na het letsel in de WT mucosa, dat het uiterst voordat werd tot een vergelijkbare mate en na de verwonding (figuur 5b). Consequent, prostaglandine E 2 niveaus waren significant hoger in de TG mucosa dan in de WT mucosa (figuur 5c).

• Genoomsequentie van Helicobacter suis ondersteunt haar rol in de maag pathologie
• Up-regulatie van CLDN1 bij maagkanker is gecorreleerd met een verminderde survival