papéis integrativos de factor de crescimento transformante-α nos mecanismos de citoprotecção de lesão da mucosa gástrica

papéis integrativos de factor de crescimento transformante-α nos mecanismos de citoprotecção de lesão da mucosa gástrica
Resumo
fundo
Transformando α do factor de crescimento (TGFa) protege contra a lesão da mucosa gástrica e facilita a cura de feridas. No entanto, a sua sobre-expressão é conhecida por induzir gastropatia hipertrófica assemelhando-se a doença de Menetrier em ratinhos transgénicos (TG) sobre um fundo FVB, como um dos autores anteriormente relatados. Nós estudamos uma outra linha do rato Fa-expressando em um fundo CD1, cuja mucosa gástrica parece normal. Desde este rato TG teve uma forte resistência a lesão gástrica induzida por etanol, foi considerado o efeito a longo prazo da Fa em vários mecanismos de proteção gástrica.
Métodos
Fa-expressando transgênicas (TG) mouse linhas de rolamento cDNA TGFa humana sob o controle do promotor da metalotioneína de ratinho gene I foram gerados em um fundo do rato CD1, e analisados ​​seus fenótipos lesão resistente etanol produzido pela Fa.
resultados
na mucosa TG, o fluxo sanguíneo foi bem conservados após a lesão de etanol . Além disso, os tipos neuronais e induzível do NO sintases foram consistentemente e amplamente expressa na mucosa TG, em comparação com a distribuição limitada do tipo NO sintase neuronal na região do poço luminal da mucosa do tipo selvagem (WT). seus NFkB factor de transcrição a montante da COX-2 e foram constitutivamente elevada na mucosa TG mesmo antes da administração de etanol, ao passo que foram induzidos na mesma região da mucosa WT somente após lesão etanol. Duas proteínas anti-apoptóticas, HSP70 e Bcl-2, estavam sobre-regulada na mucosa TG mesmo antes da administração de etanol, enquanto eles não foram expressos na mucosa WT antes da lesão. Além disso, pró-caspase 3 activação foi inibida na mucosa TG, enquanto que foi convertido na forma activa na mucosa WT após a administração de etanol.
Conclusão
Concluímos que TGFa mantém a defesa da mucosa gástrica contra lesões gástricas pela integrar outros mecanismos citoprotectores.
fundo
O etanol tem sido utilizado para gerar uma lesão da mucosa gástrica hemorrágica em roedores [1]. Com a administração oral de etanol acidificado com ácido clorídrico ou absoluto, lesões hemorrágicas extensas pode ser produzida na mucosa gástrica. Este modelo de lesão gástrica experimental tem sido frequentemente utilizado para estudos de proteção da mucosa e de restituição gástricas. Com efeito, um certo número de compostos citoprotectores foram testados para avaliar a sua potência na resistência à lesão gástrica, incluindo hormonas gastrointestinais, factores de crescimento, as prostaglandinas, as aminas bioactivos, e irritantes suaves tais como capsaicina [2-5]. Entre estes compostos, o factor de crescimento epidérmico (EGF), factores de crescimento da família, nomeadamente transformando α do factor de crescimento (TGFa), têm sido descritos como compostos potentes citoprotectores contra etanol- a ácido acético, ou lesão gástrica induzida pela aspirina [2, 4].
TGFa foi expressa na mucosa gástrica do rato após administração oral de taurocolato acidificado ou o ácido clorídrico, o que sugere o seu papel reparadora em lesão gástrica [6]. TGFa administrado intraperitonealmente protegido contra lesões gástricas induzidas por etanol com um aumento significativo em mucina gástrica aderentes em ratos [7]. A função citoprotectora de TGFa pareceu ser mediada pela activação de fosfolipase C-γ1, mas não por prostaglandinas, e era independente do efeito anti-secretor de TGFa [7]. Por outro lado, as prostaglandinas e sua enzima sintética, ciclo-oxigenase (COX), têm sido propostos como factores citoprotectores contra lesões gástricas [5, 8]. EGF foi mostrado para expressar uma isoforma induzível da COX, COX-2, na linha de células da mucosa gástrica RGM1 de rato através de uma via ERK MAP quinase [9] e em fibloblasts Swiss 3T3, especialmente por co-estimulação com gastrina [10]. Por outro lado, a COX-2 por expressão do factor de crescimento tipo EGF de ligação à heparina, um membro dos factores de crescimento da família EGF, foi bloqueado por um receptor do EGF específica (EGF-R) inibidor na mucosa gástrica do rato [11]. Assim, o sinal de EGF-R parece mediar a indução da COX-2 na mucosa gástrica.
Os mecanismos citoprotectores mais importantes incluem o fluxo de sangue na mucosa gástrica. EGF e TGFa demonstraram exercer efeitos citoprotectores através da estimulação de neurónios sensíveis à capsaicina com libertação de péptido calcitonina relacionado com o gene da calcitonina (CGRP) e óxido nítrico (NO) em ratos expostos à administração de etanol orogástrico, resultando num aumento no sangue da mucosa gástrica fluir [11, 12]. Em contraste, Konturek et ai. minimizado o papel do aumento dependente da CGRP no fluxo sanguíneo gástrico, demonstrando que a administração de NO-libertando aspirina ofereceu protecção contra lesões gástricas induzidas por etanol absoluto, mesmo em ratos capsaicin-desnervado, resultando na regulação positiva de proteínas de choque térmico 70 (HSP70 ) expressão e atenuação do dano oxidativo por uma forte sobre-regulação de genes de antioxidantes, tais como o cobre zinco superóxido dismutase (SOD) e da glutationa peroxidase [13].
TGFa foi predominantemente em células imunocoradas GSM ao longo do fundo gástrico nos seres humanos [14], intensivamente na superfície da mucosa gástrica (GSM) células através da zona proliferativa e fracamente ao longo da região glandular sob a zona proliferativa em ratos [15], e marcadamente ao longo da região pescoço de células mucosas em ratinhos da estirpe FVB /N [16]. Por outro lado, o EGF-R foi imunocoradas em células que revestem o GSM poço foveolar e região de células mucosas do colo para a região glandular mais baixo em seres humanos [17]. Em ratos, o EGF-R foi localizada na região do topo-poço e nos agregados de células principais na parte inferior das glândulas gástricas [15]. Embora TGFa é conhecida por induzir a proliferação de células em rato primário-cultivadas células da mucosa gástrica [18], e proliferação hiperplásico na mucosa na transgénico Fa-expressando (TG) de rato [19, 20], a distribuição de TGFa e EGF-R em células da mucosa gástrica terminalmente diferenciadas sugere que TGFa exerce funções não-proliferativos, incluindo efeitos anti-apoptóticos e a formação da barreira epitelial gástrica de uma maneira autócrino /parácrino. Por exemplo, TGFa inibiu a apoptose de uma linha de células da mucosa gástrica do rato, GSM06, expressando proteínas anti-apoptóticas da família Bcl-2 por meio de uma via de NF-kB-dependente [21]. Gástrico apical e basolateral de EGF-R tem sido mostrado induzir uma diminuição na permeabilidade paracelular de ácido para a protecção das células glandulares em um ambiente ácido [18, 22]. Assim, TGFa exerce tanto efeitos proliferativos e não-proliferativa sobre as funções da mucosa gástrica, e esses efeitos diversos Fa devem ser reavaliados, pelo menos em termos de saber se os seus resultados são derivados de tratamento a curto prazo utilizando linhas celulares de cultura ou de longo termo expressão usando Fa-expressando-transgene animais.
Uma década atrás, um dos autores, H. Takagi, gerado Fa-expressando mouse linhas TG sob o controle do promotor do gene de metalotioneína, e uma dessas linhas (MT100) gastropatia hipertrófica exibiram semelhante a doença de ménétrier, como semelhante mostrado por outros investigadores [19, 20]. Em contraste, uma outra linha de TG (MT42) exibida uma mucosa gástrica com aparência normal, embora TGFa transgene foi expresso a um nível semelhante em ambas as linhas de TG [20]. Uma vez que a linha MT42 exibido um nível surpreendente de resistência a lesão induzida pelo etanol na mucosa gástrica, considerou-se que poderia ser útil para explorar os efeitos não-proliferativas de TGFa, tais como a resistência da mucosa a lesão etanol. No presente estudo, foram investigados os efeitos a longo prazo de Fa sobre o prejuízo gástrica induzida por etanol através da análise de mudanças nos fatores regulatórios citoprotectores e anti-apoptóticos, incluindo o fluxo gástrico sangue, sintase, COX-2, e proteínas associadas à apoptose tais como HSP70, Bcl-2, e caspase 3. Métodos

Fa-ratinho transgénico que expressa e lesão gástrica induzida por etanol
Fa-expressando transgénicos (TG) linhas de ratinhos portadores de ADNc TGFa humano sob o controle do rato eu promotor do gene da metalotioneína foram obtidos num fundo CD1 ou FVB rato, como descrito previamente [20]. Uma das linhas de TG, MT100 sobre um fundo FVB rato, apresentada gastropatia hipertrófica assemelhando-se a doença de Menetrier [20], enquanto que a outra linha, MT42 num fundo CD1 rato, apresentada uma mucosa gástrica com aparência normal. O fenótipo do rato Fa-TG apareceu a depender da estirpe de ratinho, porque tanto o MT100 e MT42 linhas expressaram um nível semelhante do transgene TGFa no estômago [20]. No presente estudo, foi utilizada a linha de MT42 de Fa-expressando camundongos machos TG e CD1 tipo selvagem (WT) ratos do sexo masculino com idades de 6 a 8 semanas. Os animais foram mantidos sob luz controlada (07h00 - 19:00) com comida e água fornecidas ad libitum
.
Os ratos, pesando 30-35 g, foram mantidos em jejum por 24 horas antes do experimento, mas foi permitido o acesso livre à água. Todos os procedimentos experimentais que afetam os ratos foram aprovados pelo Animal Care e Use Review Committee da Universidade Gunma. Os ratinhos foram, em seguida, dada etanol acidificado orogástrico (100 ul; etanol 60% em 0,15 mol /L de HCl). Três, seis e doze horas após a administração do etanol acidificado os ratos foram sacrificados para a avaliação de análises de lesões e de imunohistoquímica gástricos, e por RNA e extração de proteínas para a PCR em tempo real, do Norte e análises de Western blot. Estudos fisiológicos

secreção de ácido gástrico foi medida como descrito anteriormente [20, 23]. Resumidamente, os ratinhos WT e TG foram mantidos em jejum durante 3 h e depois anestesiados com éter. Após a incisão da parede abdominal, o pyrolus foi ligado, e a incisão suturada. O fluido gástrico foi recolhido 4 h após a ligadura pyrolus. Para a produção de ácido máxima, a secreção ácida foi estimulada por pentagastrina injectar por via subcutânea (500 ug /kg de peso corporal). O fluido gástrico foi titulada com NaOH 0,1 N para pH 7,0 usando uma microtitrator.
Fluxo de sangue na mucosa gástrica foi medida com um medidor de fluxo de laser Doppler (modelo SFA211, Avanço Co., Tóquio), colocando uma sonda na superfície do gástrica mucosa, tal como descrito anteriormente [24]. O sinal de fluxo foi monitorada com o programa de gravação MacLab. O fluxo sanguíneo foi expressa em relação ao nível basal.
Estudos morfológicos
A espessura da mucosa gástrica foi medida a partir da parte mais alta para o fundo do bucim com um micrómetro. Da mesma forma, as lesões gástricas lesões foram medidos (largura e longitude) com um micrómetro para calcular a área lesada.
Para a imunocoloração, obteve-se anticorpos como se segue. anticorpo policlonal para H + /K + - ATPase foi obtido através da injecção de fracções de células microssomal-parietal de coelho em ratos [25]. anticorpo policlonal de coelho para metalotioneína era uma simpática oferta do Dr. Nagamine, University School Gunma de Ciências da Saúde [26]. Nós adquiridos anticorpos como se segue: anticorpo policlonal de coelho para TGFa, anticorpo policlonal de coelho para EGF-R, anticorpo policlonal de cabra para a COX-2, anticorpo policlonal de coelho para NFkB, e o anticorpo monoclonal de ratinho para nNOS e iNOS de Santa Cruz Biotech. (Santa Cruz, CA); anticorpo monoclonal de ratinho para proliferativa de células antígeno nuclear (PCNA) de Zymed Lab. (South San Francisco, CA); anticorpo de ovelha para pepsinogénios II humana a partir de biopur AB (Bubendorf, Suíça), que também reage de pepsinogénios do rato; anticorpo policlonal de coelho a HSP70 de Stressgen Biotech. (Victoria, BC, Canadá); e anticorpo monoclonal de rato para Bcl-2 a partir de BD Biosciences (San Diego, CA). Compra de peroxidase de rábano (HRP) -catalyzing coloração imuno-histoquímica, os estômagos picados foram fixados em formalina a 10% neutralizada a 4 ° C durante 24 h, e foi, em seguida, embebidas em parafina para seccionamento micrótomo. As secções de tecido desparaf inadas foram reidratadas e incubadas em solução de peróxido de hidrogénio a 3%, para inibir a actividade da peroxidase endógena. Em seguida, as secções foram incubadas com um primeiro anticorpo descrito acima, com uma diluição adequada, à temperatura ambiente durante 30 min. Um anticorpo secundário biotinilado foi seleccionado com base nos primeiros espécies animais produtoras de anticorpos, e foi, em seguida, utilizado com estreptavidina conjugada com HRP. A reacção HRP foi realizada com 3-amino-9-etil-carbazole e de peróxido de hidrogénio de acordo com as instruções fornecidas com a coloração com estreptavidina-biotina Vectastatin Elite Kit (vectores Laboratories, Burlingame, CA). colorações positivas apareceu de cor castanha. Compra de coloração de imunofluorescência, os estômagos picados foram fixadas em 4% de paraformaldeído em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4 a 4 ° C durante 24 h. Pequenos pedaços de tecido picada foram submetidos a substituição de sacarose e foram embebidos em OCT-composto, em preparação para uma seção congelada usando um micrótomo. Para a imunorreacção primário, as secções cortadas foram sondadas com um primeiro anticorpo, e em seguida, foram incubadas quer com indodicarbocyanide (Cy3) -conjugated purificado por afinidade de burro anti-coelho, anti-IgG de ratinho (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), ou fluoresceína isotiocianato (FITC) marcado com anti-IgG de coelho (Jackson ImmunoResearch), como um anticorpo secundário. A IgG de anticorpo secundário foi seleccionado com base nas espécies em que foi levantado o primeiro anticorpo.
A detecção in situ de células apoptóticas foi realizada utilizando a detecção in situ de apoptose Kit (TAKARA BIO INC. Tóquio, Japão). O kit continha um sistema de ensaio desoxinucleotidilo terminal transferase mediada desoxiuridina trifosfato biotina nick end-rotulagem (TUNEL). secções de estômago foram permeabilizadas com proteinase K, e o 3'-OH do ADN termina fragmentos foram então coradas seguindo as instruções fornecidas com o kit. Os núcleos corados castanho escuro foram consideradas como células apoptóticas. Análise de RNA
estômagos foram aparadas e os ARNs totais foram extraídos utilizando Trizol (Gibco BRL, Tokyo) de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. Para transferência de Northern, o ARN total foi submetido a electroforese num gel de agarose a 1,0% e foi transferido para uma membrana de nylon (Amersham Pharmacia Biotech, Tóquio). A hibridação foi realizada com uma sonda de ADNc do TGFa humano (917 pb) marcados com [α- 32P] -desoxi-CTP. Esta sonda reconhece mRNA TGFa humano, mas não do rato nível de TGF ARNm.
Rato TGFa ARNm foi medido utilizando uma reacção em cadeia da polimerase em tempo real (PCR) com gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) como um controlo interno. O PCR em tempo real foi realizado utilizando o Detector de ABI Prism 7700 Sequence e moles (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando o ADN fluorescente de detecção verde corante SYBR. Os iniciadores foram concebidos utilizando o software de design Primer Express (Applied Biosystems). O resultado final para cada amostra foi normalizada pelo respectivo valor de GAPDH. As sequências dos iniciadores são como se segue: TGFa rato: 5'-CCTGAGCACCCGAAGAT-3 'e 5'-CCTTCCCTCATGCCTTACT-3'; GAPDH: 5'-GTCGTGGATCTGACGTGCC-3
análise de Western blot
amostras de tecido gástrico foram aparadas e proteína total a partir da mucosa gástrica '5'-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3 e' foi homogeneizado em tampão RIPA contendo um cocktail de inibidores de protease. (fluoreto de fenilmetilsulfonilo, pepstatina, leupeptina e aprotinina) (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha). O sobrenadante foi separado num gel de SDS-PAGE, e foi, em seguida, transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno. A membrana foi sondada com os anticorpos seguintes: anticorpos para iNOS, COX-1, COX-2, HSP70, e Bcl-2, que foram os mesmos utilizados para estudos morfológicos; anticorpo monoclonal mouse para Bax (Santa Cruz Biotech.); anticorpo policlonal de coelho para a caspase 3 (Santa Cruz Biotech.); e anticorpo monoclonal de ratinho para actina filamentos (Santa Cruz Biotech.). bandas reagiram com o anticorpo foram detectados utilizando um sistema de detecção ECL (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido).
Medição da gastrina
gastrina no soro foi medido utilizando um kit de radioimunoensaio de gastrina (kit de RIA de gastrina, Dainabot, Tóquio, Japão). O anticorpo é específico para gastrina com uma porção amida no seu terminal carboxilo.
Medição de prostaglandina E2
A mucosa gástrica foi homogeneizado a 4 ° C em tampão de lise. Os homogenatos foram centrifugados a 12000 rpm durante 20 min, e os sobrenadantes foram sujeitos a prostaglandina E 2 ensaio usando uma prostaglandina E 2 Kit Monoclonal imunoensaio enzimático (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), de acordo com as instruções do fabricante .
análise estatística
análise estatística foi realizada por meio de análise de medidas repetidas de variância (ANOVA) para o comprimento total das lesões gástricas pelo teste t não pareado para o rácio diminuição do fluxo sanguíneo da mucosa gástrica. Todos os valores são expressos como a média ± SE. P < 0,05 foi aceito como estatisticamente significativo.

Resultados Caracterização da mucosa gástrica do rato TG Fa-expressando
A estirpe WT CD1 e Fa-transgene expressando ratos linha MT42 cresceu de forma semelhante e não mostrou nenhuma diferença notável em suas características, comportamentos ou expectativa de vida. A maior espessura da observada para a parede gástrica e glândulas fúndicas foram 3,50 ± 0,18 mm e 2,33 ± 0,20 mM, respectivamente, nos ratinhos WT, e 3,85 ± 0,24 mm e 2,63 ± 0,16 mM, respectivamente, nos ratinhos Tg; não foram observadas diferenças significativas na forma das mucosas gástricas e glândulas entre os ratinhos WT e TG. Em adição à aparência normal da mucosa gástrica, esta linha de ratinhos TG também tinha uma aparência normal do fígado, pâncreas e outros órgãos.
Em seguida, em comparação capacidade de secreção de ácido entre os ratinhos WT e TG. Nos ratinhos WT, a produção de ácido máxima aumentou significativamente a partir do nível basal de 25 ± 1,4 mEq /h para 50 ± 5,8 mEq /h após a estimulação pentagastrina. Por contraste, nos ratos TG, a produção de ácido máxima aumentou para um menor grau de 30 ± 5,7 mEq /h a partir da saída da base de 23 ± 0,7 mEq /h (n = 5 em WT e ratinhos Tg). A produção de ácido embotada pode refletir a massa de células parietais reduzida no TG mucosa (Figura 1e). Figura 1 Caracterização do Fa-expressando mucosa TG. Escala em cada figura indica 100 mm. (A) Distribuição de células que expressam-TGFa. células de cor castanha Fa-positivos eram visíveis ao longo da região poço luminal da mucosa WT, a região poço foveolar alongada, e o terço inferior da região glandular da mucosa TG. (B) sobreposição de células Fa-positivos de cor vermelha e as células parietais H + /K + -ATPase-positivos de cor verde. células Fa-positivos mais baixos em conjunto são distintas das células parietais de cor verde na mucosa TG. (C) transferência de Northern de ARNm de TGFa humano e amplificado por PCR TGFa ARNm de rato. ARNm TGFa humano é expresso na mucosa TG sozinho (painel esquerdo), mas amplificado por PCR TGFa ARNm de rato é expresso de forma semelhante em ambos WT e TG mucosas (painel da direita). (D) transferência de Western de formas intermediárias Fa. precursor de TGFa (20 kDa) e as suas formas intermédias são visualizados de forma mais intensa na mucosa TG do que na mucosa WT. (E) A localização do receptor de EGF na mucosa gástrica. receptor de EGF (EGF-R) foi corado com Cy3 (vermelho) e H + /K + -ATPase foi corado com FITC (verde). EGF-R foi imunocoradas moderadamente na região pit superior e fortemente na região glandular inferior semelhante tanto no WT e TG mucosas. (F) Distribuição de metalotioneína na mucosa gástrica. A metalotioneína é imunocoradas fortemente na região glandular inferior, e moderadamente ao longo da região foveolar. (G) o alongamento do fundo gástrico da mucosa TG. células PCNA-positivas são distribuídos na região superior terço nas glândulas gástricas WT, enquanto eles são distribuídos mais numerosa e amplamente na região glandular meio. (H) mostra a coloração PAS impressão alongada na mucosa TG.
Expressão do transgene TGFa
Fa-expressam tipos celulares foram identificados com base em células de tipo específico imunocoloração e a sua localização da mucosa. TGFa foi alegadamente imunocoradas ao longo das células GSM no fundo gástrico nos seres humanos [14] e ratos [15], e ao longo da região pescoço de células mucosas em ratinhos da estirpe FVB [16]. No presente estudo, as células de cor castanha Fa-positivos foram distribuídos ao longo da região de foveolar tanto a WT e TG mucosas, e ao longo da região inferior glandular da mucosa TG (Figura 1a). As células Fa-positivas ao longo da região foveolar parecia ser células pit gástricos, com base pela sua localização (Figura 1b, painel superior), e aqueles ao longo da região inferior glandular da mucosa TG não se sobrepõem com a cor verde H + /K + - ATPase células parietais-positivas (figura 1b, painel inferior), mas que se sobrepõem com as células principais pepsinogênio-positivos (dados não mostrados). O anticorpo foi utilizado para a imunocoloração para TGFa não conseguia distinguir entre o ser humano e do rato Fa, mas a sua sonda de mRNA poderia fazê-lo para a análise Northern blot. O Fa-transgene humano foi expresso na mucosa TG, enquanto a expressão não foi observada na mucosa WT (Figura 1C, painel esquerdo). Em contraste, rato endógena TGFa ARNm foi expressa de forma semelhante em ambos o WT e TG mucosas por PCR em tempo real (Figura 1C, painel direito). TGFa é um péptido de 50 aminoácidos de ácido, derivados a partir do seu precursor que atravessa a membrana 160 aminoácidos clivada por factor de necrose tumoral-a conversão enzima α (TACE) [27, 28]. Com a expressão excedente do Fa-transgene humano na mucosa TG, um precursor de cerca de 20 kDa, TGFa e as suas formas intermédias foram aumentadas por imunotransferência (Figura 1D).
Uma vez que tanto o precursor e formas processadas foram igualmente activa para a estimulação EGF -R [28], examinámos ainda EGF-R localização na mucosa. EGF-R foi localizada fortemente na região principal inferior aglomerado de células e moderadamente na região de células mucosas do colo e na região poço foveolar em ambos o WT e TG mucosas (Figura 1E), como foi reportado anteriormente para a mucosa gástrica do rato [15 ]. Uma vez que o transgene TGFa foi controlada sob o gene metalotioneína do rato [20] e metalotioneína teria sido produzida na mucosa gástrica [29], foram examinados os tipos de células que expressam de metalotioneína na mucosa. Na análise imunohistoquímica, observamos coloração metalotioneína principalmente ao longo da região glandular inferior e scatteringly ao longo da região do poço da mucosa gástrica controle CD1-deformação (Figura 1F). Assim, a distribuição de TGFa que expressam tipos de células é semelhante à da metalotioneína-expressando células na mucosa gástrica TG (Figuras 1a e 1f).
Na mucosa do rato WT, o H + /K + - células parietais ATPase-positivos foram amplamente difundidos sobre a região glandular, exceto para a camada superior-pit, enquanto o H + /K + - ATPase positivo região glandular foi reduzida em altura na TG mucosa (Figura 1e). Com efeito, o istmo na base da região do poço, o que foi confirmado por coloração com PCNA, foi movido para baixo para o meio da mucosa TG (Figura 1g). Além disso, as células PCNA positivas foram densamente distribuídos no meio da mucosa. Consistentemente, o poço foveolar-PAS-coloração positiva foi alongada na mucosa TG em contraste com a curto poço na mucosa WT (Figura 1H). Assim, embora a altura da mucosa gástrica foi semelhante entre o WT e TG mucosas, a zona proliferativa foi movido para baixo e a região poço foveolar foi mais alongado com uma região glandular reduzida na mocosa TG. Uma vez que o crescimento de células pit é fortemente reforçada por gastrina [25, 30], foram comparados os níveis séricos de gastrina entre os ratinhos WT e TG mas não encontrou nenhum aumento nos níveis de gastrina sérica do rato TG (WT, 213 ± 41 pg /ml;. TG, 263 ± 47 pg /ml, n = 5, p = 0,438) lesões gástricas induzidas por etanol em
o WT e TG rato mucosas
administração orogástrico de etanol acidificado (100 mL) causou hemorrágica lesão na mucosa TG (Figura 2a, à esquerda). Histologicamente a lesão tirou as regiões do poço e do istmo e chegou à região mid-glandular (Figura 2b, à esquerda). Por outro lado, este tipo de lesão na mucosa do mouse TG não era notável (Figura 2a, à direita). A lesão foi histologicamente limitada à região do luminal poço (Figura 2b, à direita). Na mucosa WT, a área ferida aumentou rapidamente com um pico às 6 h após a administração de etanol, ao passo que na mucosa TG área aumentada lentamente e minimamente sem um pico acentuado (Figura 2c). Consistentemente, as células apoptóticas mostrados pela coloração TUNEL distribuído profundamente para o inferior glandular região 3 h após a administração de etanol na mucosa WT, enquanto que as células apoptóticas foram confinados à região do poço, mas não se estendem para a região glandular da mucosa TG ( Figura 2d). Figura 2 Etanol induzida por lesão gástrica na mucosa gástrica. (A) vista macroscópico da mucosa gástrica. Escala: 5 mm. Ambas as mucosas são 6 h após a administração de etanol. Note-se que o WT mucosa apresenta extensas lesões hemorrágicas, em contraste, a mucosa TG parece intacto após a administração de etanol. (B) de hematoxilina e eosina de feridos-etanol WT mucosa (esquerda) e TG mucosa (direita). Note-se a formação de úlcera profunda na mucosa WT. Escala: 100 um. (C) Curso de tempo de lesão gástrica induzida por etanol. área lesada é plotado contra o tempo até 12 h após a administração de etanol. Cada ponto representa a média de cinco ratinhos. p Art < coloração 0,05 (d) TUNEL de WT mucosa (esquerda) e TG mucosa (direita). Ambas as seções são consecutivas aos da 2B
, respectivamente. células em apoptose são visíveis com núcleos castanho-escuros. células em apoptose numerosos são anotadas na mucosa WT. Todas as fotos foram 6 h após a administração de etanol. Escala:. 100 um
fluxo de sangue na mucosa gástrica na mucosa tratados com etanol
Embora um certo número de factores reguladores citoprotectores têm sido relatados, incluindo NO, CGRP, COX2, e HSP70 [12, 13, 31, 32] , o fluxo sanguíneo da mucosa tem sido proposta como um fator primordial para a proteção e restituição de lesão gástrica induzida por etanol [1, 33]. Nós medimos o fluxo sanguíneo gástrico, colocando uma sonda do medidor de vazão Doppler laser na mucosa gástrica acessado através de uma parede abdominal exposta no rato anestesiado. fluxo sanguíneo gástrico diminuição marcada de 43,5 ± 6,37% após a administração de etanol na mucosa gástrica do rato WT (Figura 3). Em contraste, só diminuiu em 17,2 ± 9,21% após a administração de etanol na mucosa TG (Figura 3). Assim, o fluxo de sangue gástrico estava bem conservado na mucosa TG mesmo depois do tratamento com etanol. Desde mucosa isquemia é um dos factores mais importantes ulcerosas [33], a manutenção do fluxo sanguíneo gástrico parece ser um factor essencial para a protecção da mucosa. Figura 3 Avaliação do fluxo de sangue na mucosa gástrica na mucosa gástrica. o fluxo de sangue na mucosa gástrica foi avaliada por comparação da razão de fluxo de sangue antes e após o tratamento com etanol. A relação foi obtido como uma percentagem contra o fluxo de sangue antes do tratamento, o que era muito maior na mucosa WT do que na mucosa TG. * P Art < . 0,03
Expressão de proteínas citoprotetores: sintase, COX-2, e HSP70
Para explorar o mecanismo de manutenção do fluxo arterial elevada na mucosa TG, examinamos a expressão de NO sintases, que não faz a partir da arginina, e relaxa os músculos lisos vasculares via a proteína quinase dependente de GMPc [34]. Existem três tipos de sintase (NOS): NOS neuronal (nNOS), NOS induzível (iNOS) e NOS endotelial (eNOS). nNOS e eNOS estão constitutivamente expresso, enquanto iNOS é induzida após lesão gástrica [35]. nNOS foi distribuído de forma semelhante ao PAS-coloração sobre a região pit foveolar (Figura 1 g); observou-se sobre a impressão alongada da mucosa TG e estava limitado à cova luminal da mucosa WT (Figura 4a). eNOS foi fracamente dispersos por toda a mucosa gástrica de modo semelhante, tanto a WT e TG mucosas (dados não mostrados). A coloração de iNOS foi insignificante na mucosa WT, embora tenha sido altamente induzida na região glandular inferior após a mucosa foi exposta a etanol (Figura 4b). Na mucosa TG, iNOS foi expresso constitutivamente na região glandular inferior semelhante antes e após a lesão (Figura 4b), o que parece contribuir ainda mais para a manutenção do fluxo sanguíneo elevado. Figura 4 imunocoramento NO sintases na mucosa gástrica. Escala: 100 um. imunocoloração (a) nNOS. nNOS foi visível ao longo da região do poço, resultando na sua distribuição mais ampla ao longo da impressão alongada na mucosa TG. imunocoloração (b) iNOS. iNOS foi induzida na região inferior glandular após a lesão etanol na mucosa WT, ao passo que foi expresso constitutivamente na mesma região da mucosa TG independentemente da lesão de etanol.
As prostaglandinas foram propostos como um importante fator de citoprotector mais de três décadas atrás [ ,,,0],8] e seus papéis têm sido extensivamente estudados [36, 37]. O papel das enzimas de formação de prostaglandina, a COX-1 e COX-2, tem sido controverso na protecção da mucosa gástrica contra substâncias irritantes [7, 11, 32]. Foi examinada a expressão da COX no WT e TG mucosas durante a lesão etanol. A expressão de COX-1 não diferiu entre o WT e TG mucosas, nem antes ou após a lesão etanol (Figura 5b). A COX-2 não foi detectável na mucosa WT, mas a sua expressão se tornou evidente 6 h após a lesão de etanol, e a sua coloração foi localizada na região glandular inferior (figura 5a e 5b). Na mucosa TG, a imunocoloração de COX-2 foi intensa na mesma região, mesmo antes da lesão e permaneceu positivo após a lesão (Figura 5a). Desde COXs foram mostrados para ser expresso em células mesenquimais, tais como fibroblastos e as células mononucleares na mucosa gástrica [38], e o método estreptoavidina /biotina /HPR vezes apresenta coloração falso-positivo, foi realizada coloração de imunofluorescência usando uma secção congelada que confirmou expressão de COX semelhante na região inferior glandular da mucosa TG (dados não mostrados). Por imunotransferência, a COX-2 aumentada, após a lesão na mucosa WT, enquanto ele estava bastante elevada a um nível semelhante antes e após a lesão (Figura 5b). Consistentemente, prostaglandina E 2 foi significativamente maior na mucosa TG do que na mucosa WT (Figura 5c).

• sequência do genoma de suis Helicobacter suporta seu papel na sequência pathology
• -Regulação de CLDN1 no câncer gástrico está correlacionada com a sobrevivência reduzida