Integračné role transformujúci rastový faktor-alfa v cytoprotekci mechanizmov žalúdočnej sliznice

Integračné role transformujúci rastový faktor-alfa v cytoprotekci mechanizmy zmeny žalúdočnej sliznice
abstraktné
pozadia
transformujúci rastový faktor a (TGFa) chráni pred žalúdočnej sliznice a uľahčuje hojenie rán. Avšak, jeho nadmerná expresia je známe, že indukuje hypertrofická gastropatia sa podobá Menetrier choroby na transgénnych (TG) u myší na FVB pozadí, ako jeden z autorov hlásených skôr. Študovali sme ďalšie TGFa-vyjadrujúce myši linku na CD1 pozadí, ktorého žalúdočnej sliznice sa zobrazí normálne. Vzhľadom k tomu, TG myš mala vysokú odolnosť voči žalúdočným zranenia etanolom vyvolaného sme zvažovali dlhodobý účinok TGFa na niekoľkých mechanizmy žalúdočných ochrany.
Metódy
TGFa-exprimujúcich transgénnych (TG) myší línie nesúce ľudský TGFa cDNA pod kontrolou promótorom génu aj myšieho metalotioneínu boli generované na CD1 myší pozadí, a analyzuje ich etanol zranenia rezistentný fenotyp produkovaný TGFa.
Výsledky
V TG sliznicu, prietok krvi bol dobre udržiavaná po zranení etanole , Ďalej, nervové a inducibilní NO syntázy typy boli dôsledne a široko exprimovaný v TG sliznici, v porovnaní s obmedzenou distribúciou neurónové typu NO syntázy v luminální jamy oblasti divokého typu (WT) sliznice. COX-2 a jeho upstream transkripčný faktor NFkB boli konštitutívne vyššie v TG sliznici ešte pred podaním etanolu, vzhľadom k tomu, že sa indukujú v rovnakej oblasti WT sliznice až po poranení etanolu. Dve anti-apoptotické proteíny HSP70 a Bcl-2, bola up-regulované v TG sliznici ešte pred podaním etanolu, pričom neboli vyjadrené v sliznici WT pred zranením. Okrem toho, pre-kaspázy 3 aktivácia bola inhibovaná v TG sliznici, zatiaľ čo bol premenený na aktívnu formu v WT sliznice po podaní etanolu.
Záver
Došli sme k záveru, že TGFa udržiava žalúdočnej sliznice žalúdka obranu proti úrazu integrácia ďalších cytoprotektívny mechanizmy.
pozadí
etanol už dlho používa pre generovanie hemoragická poranenia žalúdočnej sliznice u hlodavcov [1]. Perorálnym podaním absolútneho etanolu alebo chlorovodíkovej kyseliny sa okyslí, rozsiahle hemoragické lézie môžu byť vyrobené v žalúdočnej sliznici. Toto experimentálne žalúdočné modelu bola ujma často používa pre ochranu slizníc a reštitučné štúdií žalúdočných. V skutočnosti rad cytoprotektívnych zlúčenín boli testované na vyhodnotenie ich efektívnosti v odpore voči žalúdočnej zranenia, vrátane gastrointestinálnych hormónov, rastových faktorov, prostaglandíny, biologicky aktívne amíny, a mierne dráždivé látky, ako je kapsaicín [2-5]. Medzi týmito zlúčeninami, epidermálny rastový faktor (EGF), rastové faktory, najmä pre rodinné transformujúci rastový faktor a (TGFa), bola označená ako účinných zlúčenín proti cytoprotektívny etanol, octová kyselinám alebo indukovaného aspirínom žalúdočné zranenia [2, 4].
TGFa bol vyjadrený v potkania žalúdočnej sliznice perorálna acidofilného taurocholátu alebo kyseliny chlorovodíkovej, čo svedčí o jeho reparatívne úlohu v žalúdočnej zranenia [6]. TGFa podané intraperitoneálne chránené proti žalúdočnej zranenia etanolom indukovanej s významným zvýšením priľahlou žalúdočného hlienu u potkanov [7]. Cytoprotektívny funkcie TGFa sa zdá byť sprostredkovaný aktiváciou fosfolipasy C-γ1, ale nie prostaglandíny, a bol nezávislý na anti-sekrečnú účinok TGFa [7]. Na druhej strane, prostaglandínov a ich syntetického enzýmu cyklooxygenázy (COX), sa už dlho navrhnutá ako cytoprotektívny faktory proti žalúdočnej zraneniu [5, 8]. EGF bolo preukázané, že exprimujú indukovatelnou COX izoformy, COX-2, v RGM1 potkania žalúdočnej sliznice bunkové línie cez EKR cesty kinázy MAP [9] a v Swiss 3T3 fibloblasts, najmä ko-stimulácia gastrín [10]. Okrem toho, COX-2 expresie EGF podobný rastový faktor viažuci heparín, členom rodiny rastových faktorov EGF, bola zablokovaná špecifickým receptorom EGF (EGF-R), inhibítor v potkania žalúdočnej sliznice [11]. Takto sa objaví signál EGF-R sprostredkovať indukciu COX-2 v žalúdočnej sliznici.
Najdôležitejšie cytoprotektívny mechanizmy zahŕňajú žalúdočnej sliznice prietok krvi. EGF a TGFa bolo preukázané, že vyvíjanie cytoprotektívny účinky cez stimuláciu kapsaicín citlivých neurónov s uvoľňovaním peptidu kalcitonínu génov súvisiacich s (CGRP) a oxidu dusnatého (NO) u potkanov vystavených orogastric podávanie etanolu, čo vedie k zvýšeniu žalúdočnej sliznice krvi prietok [11, 12]. Na rozdiel od toho kontúrok et al. minimalizuje úlohu zvýšenie CGRP závislé v žalúdku prietoku krvi tým, že demonštruje, že podávanie NO-uvoľňujúce aspirín poskytovala ochranu proti absolútnej žalúdočným zraneniu etanolom indukované aj v kapsaicín denervovaný potkanov, čo vedie k up-reguláciu proteínu tepelného šoku 70 (Hsp70 ) expresie a útlm oxidačné zranenia silným upregulací antioxidačných génov, ako je napríklad zinok meď superoxiddismutázy (SOD) a glutatión peroxidázy [13].
TGFa bola imunologicky prevažne v GSM buniek pozdĺž žalúdočnej jamy u ľudí [14], intenzívne v žalúdočnej sliznici (GSM) buniek počas proliferačnej zóne a slabo pozdĺž glandulární oblasti pod proliferačnej zóne Potkan [15], a výrazne pozdĺž sliznice oblasti krku buniek v FVB /N kmeňa myší [16]. Na druhej strane, EGF-R bol imunologicky v GSM bunky lemujúce foveolární jamy a slizničnej bunky krčnej oblasti k dolnej glandulární oblasti u ľudí [17]. U potkanov, EGF-R bol lokalizovaný v oblasti hornej povrchovo a v hlavných zhlukov buniek v dolnej časti žalúdočných žliaz [15]. Aj keď TGFa je známe, že indukuje proliferáciu buniek v primárnych kultivovaných potkaních žalúdočnej sliznice buniek [18], a hyperplastickú proliferácia v sliznici na TGFa-exprimujúcich transgénnych (TG), myší [19, 20], distribúcia TGFa a EGF-R v terminálne diferencovaných buniek žalúdočnej sliznice naznačuje, že TGFa vyvíja neproliferatívne funkcií, vrátane anti-apoptotické účinky a žalúdočné epiteliálne bariéry tvorby v autokrinný /parakrinný spôsobom. Napríklad, TGFa inhibuje apoptózu u myší žalúdočnej sliznice bunkové línie, GSM06, expresiou antiapoptotické rodiny Bcl-2 proteínov cez NF-kB-dependentný dráhy [21]. Žalúdočné apikálnej a bazolaterální EGF-R bolo preukázané, že indukuje pokles paracelulární priepustnosť pre kyseliny za účelom ochrany žľazových buniek v kyslom prostredí [18, 22]. Tak, TGFa pôsobí ako proliferácia a non-proliferačnej účinky na žalúdočnej sliznice funkcie, a tieto rôzne efekty TGFa by sa mal znovu vyhodnotiť, aspoň pokiaľ ide o tom, či sú ich výsledky odvodené z krátkodobej liečby s použitím kultúry bunkové línie alebo od dlhodobej termín expresie pomocou TGFa-transgén exprimujúci zvierat.
pred desiatimi rokmi, jeden z autorov, H. Takagi, generované TGFa exprimujúcich TG myší línie pod kontrolou promótorom génu metalotioneínu, a jeden z týchto liniek (MT100) vystavoval hypertrofická gastropatia pripomínajúce Menetrier chorobu, ako je obdobne znázornené inými výskumníkmi [19, 20]. Na rozdiel od toho ďalšie TG línie (MT42) zobrazí normálny-objaviť žalúdočnú sliznicu, aj keď TGFa transgén bola vyjadrená v podobnej miere v oboch líniách TG [20]. Vzhľadom k tomu, MT42 línia zobrazená prekvapujúce úroveň odolnosti proti poraneniu etanolom indukované na žalúdočnú sliznicu, máme za to, že by mohli byť užitočné pre skúmanie non-proliferačnej účinky TGFa, ako je slizničnej odolnosť proti poraneniu etanolu. V tejto štúdii sme skúmali dlhodobé účinky TGFa na žalúdočné zranenia etanolom vyvolaného na základe analýzy zmien v cytoprotektívny a anti-apoptotických regulačných faktorov, vrátane žalúdočné prekrvenie, NO syntázy, COX-2, a apoptóze spojené s proteínmi takými ako HSP70, Bcl-2, a kaspázy 3.
metódy
TGFa expresiou transgénne myši a žalúdočné zranenia etanol-indukovanej
TGFa exprimujúcich transgénnych (TG) myší línie nesúce ľudský TGFa cDNA pod kontrolou z myšou metalothioneín génu Aj promótor boli generované na CD1 alebo FVB myši pozadia, ako bolo opísané skôr [20]. Jedna z liniek TG, MT100 na FVB myši pozadí, zobrazí sa hypertrofická gastropatia sa podobá Menetrier choroby [20], zatiaľ čo druhá línia, MT42 na CD1 myší pozadí, zobrazí sa normálne vyzerajúci žalúdočnú sliznicu. Fenotyp TGFa-TG myší preukázalo, že sú závislé na kmeni myší, pretože ako MT100 a MT42 čiary vyjadrené podobnú úroveň TGFa transgénu v žalúdku [20]. V tejto štúdii sme použili na MT42 línii TGFa exprimujúcich TG samcov myší CD1 a divokého typu (WT) samcov myší vo veku 6 až 8 týždňov. Zvieratá bola udržiavaná pod kontrolovanou svetla (07:00 až 7:00 hodín) s jedlom a za predpokladu vodou ad libitum
.
Myší, s hmotnosťou 30-35 g, boli kŕmené 24 hodín pred pokusom, ale bol ponechaný voľný prístup k vode. Všetky experimentálne postupy, ktoré ovplyvňujú myši boli schválené starostlivosti o zvieratá a používanie revíznej komisie na Gunma univerzite. Myši potom boli uvedené orogastric kyslý, etanol (100 ul, 60% etanol v 0,15 mol /l HCl). Tri, šesť, a dvanásť hodín po podaní acidofilné etanole boli myši usmrtené pre vyhodnotenie žalúdočných zranenia a imunohistochemických analýz, a pre RNA a extrakcie bielkovín pre real time PCR, Northern a Western blot analýzy.
Fyziologické štúdie
sekrécie žalúdočnej kyseliny bola meraná, ako bolo opísané skôr [20, 23]. Stručne, WT a transgénnych myší hladovali počas 3 hodín a potom sa anestetizují éterom. Po narezaní brušnej steny, pyrolus bol naviazaný, a incízie bola prišitá. Žalúdočné tekutine bola odobratá 4 h po pyrolus ligácia. Pre výstup kyseliny maximálnu sekréciu kyseliny bola stimulovaná nástrekom pentagastrínom podkožne (500 ug /kg telesnej hmotnosti). Žalúdočné tekutine sa titruje 0,1 N roztokom hydroxidu sodného na pH 7,0 za použitia microtitrator.
Žalúdočnej sliznice prietok krvi bol meraný pomocou laserového dopplerovského prietokomeru (model SFA211, Advance Co., Tokyo) umiestnením sondy na povrchu žalúdočnej sliznice, ako bolo opísané skôr [24]. Signál prietoku bola sledovaná s programom nahrávania MacLab. Prietok krvi bola vyjadrená vzhľadom k bazálnej úroveň.
Morfologické štúdie
hrúbka žalúdočnej sliznice sa meria od najvyššej časti do spodnej časti žľazy s mikrometrom. Rovnako tak žalúdočné lézie ujmy boli merané (šírka a dĺžka) s mikrometrom pre výpočet poranenej oblasti. Apartmán V immunostaining sme získali protilátky takto. Polyklonálne protilátky H + /K + - ATPázy bol získaný vstrekovaním králičie parietálnej bunky-mikrozomálne frakcie myšiam [25]. Králičie polyklonálne protilátka proti metalotioneínu bol láskavý dar od Dr. Nagamine, Gunma University School of Health Sciences [26]. zakúpené sme protilátky takto: králičie polyklonálne protilátky proti TGFa, králičie polyklonálne protilátky k EGF-R, kozie polyklonálne protilátka proti COX-2, králičie polyklonálne protilátka proti NFkB, a myší monoklonálne protilátky pre nNOS a INOS od Santa Cruz Biotech. (Santa Cruz, CA); myšou monoklonálna protilátka proti proliferačnej-bunky nukleárna antigén (PCNA) od Zymed Lab. (South San Francisco, CA); ovčej protilátky proti ľudskému pepsinogénu II z biopur AB (Bubendorf, Švajčiarsko), ktorý tiež reaguje na myší pepsinogénu; králičie polyklonálne protilátka proti HSP70 z Stressgen Biotech. (Victoria, BC, Kanada); a myšou monoklonálna protilátka proti Bcl-2 od BD Biosciences (San Diego, CA).
pre chrenovou peroxidázou (HRP) -catalyzing imunohistochemického farbenia, mleté ​​žalúdky boli fixované v 10% formalínu neutralizované pri teplote 4 ° C počas 24 hodín, a bol potom vložený do parafínu pre krájanie mikrotómy. Rezy boli zbavené parafínu tkaniva rehydratuje a inkubované v 3% roztoku peroxidu vodíka k inhibíciu endogénnej peroxidázy. Potom boli rezy inkubované s prvou protilátkou je popísané vyššie s vhodným riedením pri teplote miestnosti po dobu 30 minút. Sekundárne biotinylizované protilátky bola vybraná na základe prvých druhov zvierat produkujúcich protilátku, a potom bol použitý s HRP-konjugovaným streptavidínom. HRP reakcia bola vykonaná s 3-amino-9-etyl-karbazolu a peroxidu vodíka podľa pokynov dodaných s streptavidín-biotín farbenie Vectastatin Elite Kit (vektory Laboratories, Burlingame, CA). Pozitívne farbenie sa objavili hnedej farby.
Pre imunofluorescenčné farbenie, mleté ​​žalúdky boli fixované v 4% paraformaldehydu v 0,1 M fosfátovom pufri, pH 7,4 pri teplote 4 ° C počas 24 hodín. Malé kúsky mletého tkaniva prešiel sacharózy výmenu a boli zakotvené v OCT-zlúčeniny v príprave na zamrznutom úseku s použitím mikrotómy. Pre primárne Imunoreakce, nakrájané rezy boli sondovania s prvou protilátkou, a potom boli inkubované buď s indodicarbocyanide (Cy3) konjugovaným afinitnej čistenej oslie anti-králičie, anti-myší IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), alebo fluoresceín izotiokyanát (FITC) značená anti-králičie IgG (Jackson ImmunoResearch), ako sekundárnej protilátky. Sekundárne IgG protilátka bola vybraná na základe druhu, na ktorých sa zabezpečili prvá protilátka. Br &situ detekcie apoptotických buniek bola vykonávaná s použitím in situ apoptózy Detection Kit (TAKARA BIO INC. Tokyo, Japonsko). Súprava obsahoval terminálne deoxynukleotidyltransferáza sprostredkované deoxyuridín trifosfátu biotín nick end-značenie (TUNEL) testovacieho systému. Žalúdočné sekcie boli permeabilizovány proteinázy K a 3'-OH konca DNA fragmenty boli potom sa zafarbia podľa pokynov dodaných so súpravou. Jadrá zafarbené tmavo hnedá, boli považované za apoptotické bunky.
Analýza RNA
žalúdky boli upravené a celková RNA bola extrahovaná za použitia TRIzolu (Gibco BRL, Tokio), podľa protokolu dodaného výrobcom. Pre Northern blot, celková RNA sa podrobí elektroforéze na 1,0% agarosovém gélu a bola prenesená na nylonovú membránu (Amersham Pharmacia Biotech, Tokyo). Hybridizácia bola vykonávaná so sondou ľudského TGFa cDNA (917 bp), ktoré majú [a- 32P] deoxy-CTP. Táto sonda rozpoznáva ľudský TGFa mRNA, ale nie myš úroveň TGF mRNA.
Mouse TGFa mRNA sa merala pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) s glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázy (GAPDH) ako vnútorná kontrola. PCR v reálnom čase bola vykonaná za použitia ABI Prism 7700 Sequence Detector a mäkké (Applied Biosystems, Foster City, CA) za použitia DNA fluorescenčného farbiva SYBR Green detekciu. Primery boli navrhnuté za použitia softvéru pre navrhovanie Primer Express (Applied Biosystems). Konečný výsledok pre každú vzorku bola normalizovaná príslušné hodnoty GAPDH. Sekvencie primérov sú nasledovné: myši TGFa: 5'-CCTGAGCACCCGAAGAT-3 'a 5'-CCTTCCCTCATGCCTTACT-3'; GAPDH: 5'-GTCGTGGATCTGACGTGCC-3 'a 5'-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3'
analýza Western blot
vzoriek žalúdočnej tkaniva boli upravené a celkové množstvo bielkovín z žalúdočnej sliznice sa homogenizuje v RIPA pufri, ktorý obsahuje koktail inhibítorov proteázy. (fenylmetylsulfonyl fluorid, pepstatin, leupeptinu, aprotinínu a) (Roche Diagnostics, Mannheim, Nemecko). Supernatant sa oddelí na SDS-PAGE gélu, a potom bol blot na polyvinylidendifluoridovou membránu. Membrána bola sondovania s nasledujúcimi protilátkami: protilátky proti INOS, COX-1, COX-2, HSP70, a Bcl-2, ktoré boli rovnaké ako tie použité pre morfologické štúdie; myšou monoklonálna protilátka proti Bax (Santa Cruz Biotech.); králičie polyklonálne protilátka proti kaspázy 3 (Santa Cruz Biotech.); a myší monoklonálne protilátky pre aktínu vlákien (Santa Cruz Biotech.). boli detekované pruhy protilátky reagovali s použitím detekčného systému ECL (Amersham, Buckinghamshire, UK).
Meranie gastrín
sérového gastrínu sa merala pomocou gastrín radioimunotest kitu (gastrín RIA súpravy, Dainabot, Tokyo, Japonsko). Protilátka je špecifická pre gastrín s amidovou skupinou na svojom uhlíkovom zakončení.
Meranie prostaglandínu E2
žalúdočnú sliznicu bola homogenizované pri teplote 4 ° C v lyzačním pufri. Homogenát boli centrifugovány pri 12000 otáčkach za minútu po dobu 20 minút a supernatanty boli podrobené prostaglandínu E 2 testu za použitia prostaglandínu E 2 Monoclonal Enzymatická imunoanalýza Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), podľa inštrukcií výrobcu .
Štatistická analýza
Štatistická analýza bola vykonaná pomocou opakovanou analýzou opatrení rozptylu (ANOVA) pre celkové dĺžky žalúdočných lézií pomocou nepárového t-testu pre žalúdočnej sliznice pomer zníženie prietoku krvi. Všetky hodnoty sú vyjadrené ako priemer ± SE. P < 0.05 bola prijatá ako štatisticky významné.
Výsledky
charakterizácia TGFa-vyjadrujúcim TG myší žalúdočnej sliznice
WT CD1 kmeň a TGFa-transgénu vyjadrujúce MT42 línie myší rástli podobne a nevykazovali znateľný rozdiel vo svojich funkciách, správanie, alebo dĺžky života. Najväčšia hrúbka je pozorovaný pri stene žalúdka a fundic žľazy boli 3,50 ± 0,18 mm a 2,33 ± 0,20 mm, v danom poradí, u myší WT a 3,85 ± 0,24 mm a 2,63 ± 0,16 mm, v danom poradí, u myší TG; neboli žiadne významné rozdiely v tvare žalúdočných slizníc a žliaz medzi myšou WT a TG. Okrem normálneho vzhľadu žalúdočnej sliznice, táto myš linka TG tiež mal normálne vyzerajúci pečene, pankreasu, a ďalšie orgány.
Sme potom porovnajú sekrécie kyseliny kapacitu medzi myšou WT a TG. U myší WT, výstup kyselina maximálny významne zvýšil zo základnej hodnoty 25 ± 1,4 mmol /h na 50 ± 5,8 mmol /h po stimulácii pentagastrínom. Naproti tomu u myší, TG, výstup kyselina kapacita vzrástla v menšej miere na 30 ± 5,7 mmol /h od bazálnej výstupu 23 ± 0,7 mmol /h (n = 5 v WT a transgénnych myší). Zaoblené Výstup kyseliny môže odrážať znížená hmotnosť parietálnych buniek v TG sliznice (obrázok 1E). Obrázok 1 Charakterizácia TGFa exprimujúce TG sliznice. Mierka v každom obrázku označuje 100 um. (A) Rozdelenie TGFa-exprimujúcich buniek. Hnedo sfarbených TGFa-pozitívne bunky boli vidieť pozdĺž boxovej oblasti luminální v WT sliznici, podlhovastého foveolární jamy oblasti a spodnej tretine žľazovej oblasti v TG sliznici. (B) Presah červeno sfarbený TGFa-pozitívnych buniek a zelenej farby-H + /K + -ATPázu-pozitívnych parietálnych bunkách. Nižšia TGFa-pozitívnych buniek v klastri sú odlišné od zelenej sfarbenej parietálnych buniek TG sliznice. (C) Northern blot mRNA ľudského TGFa a PCR-amplifikovaného myši TGFa mRNA. Ľudský TGFa mRNA je exprimovaný v sliznici TG sama (ľavý panel), ale PCR-amplifikovanej myší TGFa mRNA je exprimovaný podobne ako WT a TG sliznice (pravý panel). (D) Western blot TGFa prechodné formy. TGFa prekurzor (20 kDa) a jeho prechodné formy sú zobrazené intenzívnejšie v TG sliznici, ako v WT sliznici. (E) Lokalizácia receptora EGF v žalúdočnej sliznici. receptor EGF (EGF-R), bolo ofarbené Cy3 (červené) a H + /K + -ATPázu sa farbí FITC (zelená). EGF-R bol imunologicky mierne v hornej oblasti jamy a silne v spodnej žľazovej oblasti podobne ako v WT a TG sliznice. (F) Distribúcia metalotioneínu v žalúdočnej sliznici. Metalothioneín je silne imunologicky v spodnej oblasti glandulární a mierne pozdĺž foveolární oblasti. (G) predĺženie žalúdočnej jamy TG sliznice. PCNA-pozitívne bunky sú rozdelené na hornú tretina oblasti v žalúdočných žľazách WT, vzhľadom k tomu, že sú distribuované viac početne a všeobecne v strednej žľazovej oblasti. (H) PAS farbenie ukazuje pretiahnutý jamu v TG sliznici.
Expresia transgénu TGFa
TGFa-exprimujúcich bunkových typov boli identifikované na základe bunkovej špecifické pre konkrétny typ immunostaining a ich umiestnenia slizničnej. TGFa bol údajne imunologicky pozdĺž bunky GSM v žalúdku jamy u ľudí [14] a krýs [15], a pozdĺž sliznice oblasti krku buniek v FVB kmeňa myší [16]. V tejto štúdii, hnedo sfarbených TGFa-pozitívne bunky boli rozdelené pozdĺž foveolární oblasti oboch WT a TG sliznice, a pozdĺž spodného žľazovej oblasti TG sliznice (obrázok 1a). Tieto TGFa-pozitívnych buniek pozdĺž foveolární oblasti sa zdá byť žalúdočné jama bunky, ktoré sú založené podľa ich umiestnenia (obrázok 1b, horný panel), a tie, ktoré sa pozdĺž dolnej žľazovej oblasti TG sliznice neprekrýva s zelenej farby H + /k + - ATPázy pozitívna parietálnych buniek (obrázok 1B, dolný panel), ale prekrývajú s pepsinogén-pozitívnych hlavných buniek (dáta nie sú ukázaná). Protilátka sme použili pre immunostaining pre TGFa nemohli rozlišovať medzi človekom a myšou TGFa, ale jeho mRNA sonda mohla urobiť pre Northern blot analýzu. Ľudský TGFa-transgén bol vyjadrený v TG sliznici, zatiaľ čo žiadna expresia bola zaznamenaná na sliznicu WT (obrázok 1c, ľavý panel). Na rozdiel od toho endogénne myší TGFa mRNA bola podobne exprimovaný ako v WT a TG sliznice pomocou PCR v reálnom čase (obrázok 1c, pravý panel). TGFa je kyselina 50 amino peptid, odvodený od jeho membráne klenout prekurzora 160 aminokyselín štiepiť TNF-alfa-konvertujúceho enzýmu (TACE) [27, 28]. S prebytkom expresiu ľudského TGFa-transgénu v TG sliznicu, čo je približne 20 kDa TGFa prekurzora a jeho prechodné formy boli zvýšené imuno-blottingom (Obrázok 1d). Vzhľadom k tomu, ako
predchodca a spracované formy sú rovnako účinné pre stimuláciu EGF -R [28], sme ďalej skúmalo EGF-R lokalizáciu v sliznici. EGF-R bol lokalizovaný ťažko v dolnej hlavné oblasti klastrov buniek a mierne v mukóznej oblasti krku buniek a v foveolární oblasti jamy v oboch WT a TG sliznice (obrázok 1E), ako bolo uvedené skôr pre potkania žalúdočnej sliznice [15 ]. Vzhľadom k tomu, TGFa transgén bola riadená na základe myšieho metalotioneínu génu [20], a metalotioneínu bol údajne vyrobený v žalúdočnej sliznici [29], sme sa zaoberali metalothioneín-exprimujúcich bunkových typov v sliznici. Imunohistochemicky, sme zaznamenali metalotioneínu škvŕn väčšinou pozdĺž dolného kraja glandulární a scatteringly pozdĺž boxovej oblasti ovládacieho CD1-kmeňa žalúdočnej sliznice (obrázok 1F). To znamená, že distribúcia TGFa exprimujúcich bunkových typov, je podobný ako u metalotioneínu-exprimujúcich buniek v žalúdočnej sliznici (TG obrázkoch 1A a 1 f). Br &WT myší sliznice, H + /K + - ATPázy pozitívny parietálnej bunky boli široko rozprestretý medzi žliaz regiónu s výnimkou top-boxov vrstvy, zatiaľ čo H + /k + - ATPázy-pozitívne žliaz región bol znížený na výšku v TG sliznice (obrázok 1e). V skutočnosti je isthmus na základni jamy oblasti, ktorá bola potvrdená farbením PCNA, bola presunutá dole do stredu TG sliznice (obrázok 1 g). Okrem toho, PCNA-pozitívne bunky boli husto distribuovaný v stredu sliznice. Dôsledne, PAS-farbenie-pozitívny foveolární pit bol pretiahnutý TG sliznicu na rozdiel od krátkej jamy v WT sliznici (obrázok 1 H). Takto, aj keď výška žalúdočnej sliznice bola podobná medzi WT a TG sliznice, proliferačnej zóna bola presunutá dole a foveolární jama región bol pretiahnutejšie so zníženou glandulární oblasti v TG mocosa. Vzhľadom na to, že rast povrchových buniek je silne zvýšená gastrínu [25, 30], sme porovnali hladiny sérového gastrínu medzi myšou WT a TG, ale zistené žiadne zvýšenie hladiny sérového gastrínu v myší TG (WT, 213 ± 41 pg /ml ,. TG, 263 ± 47 pg /ml, n = 5, p = 0,438)
etanol vyvolanej gastrickej poškodenie v WT a TG myš sliznice
Orogastric podania okysleného etanolu (100 ul) spôsobil hemoragický poranenia v TG sliznicu (2a, vľavo). Histologicky zranenia olúpané jamy a šiju regióny a dosiahol až do polovice žliaz regiónu (obrázok 2b, vľavo). Na rozdiel od toho tento druh zranenia v TG myší sliznici nebol významný (2a, vpravo). Zranenie bola histologicky obmedzená na oblasť luminální jamy (obrázok 2b, vpravo). V WT sliznice, poškodená oblasť rýchlo rastie s vrcholom na 6 hodín po podaní etanolu, zatiaľ čo v TG sliznici oblasť pomaly a minimálne zvýšiť bez výrazného vrcholu (obrázok 2c). Dôsledne, apoptotické bunky, ktoré podľa farbenie TUNEL hlboko rozdelené na spodnej glandulární región 3 hodiny po podaní etanolu v WT sliznici, zatiaľ čo apoptotické bunky boli obmedzené na oblasti jamy, ale sa nevzťahuje na žľazovej oblasti v TG sliznici ( obrázok 2d). Obrázok 2 Etanol indukovanej žalúdočnej zranenia v žalúdočnej sliznici. (A) makroskopicky pohľad na žalúdočnej sliznice. Mierka: 5 mm. Obe sliznice 6 h po podaní etanolu. Všimnite si, že WT sliznice zobrazuje rozsiahle hemoragické lézie, v kontraste, TG sliznice vyzerá nepoškodená po podaní etanolu. (B) hematoxylínom a eosínu etanolu poranením WT sliznice (vľavo) a TG sliznice (vpravo). Poznámka: hlboké tvorbu vredov u WT sliznicu. Mierka: 100 um. (C) Časový priebeh žalúdočné zranenia etanolom indukovanej. Zranenie oblasť je v závislosti na čase až do 12 hodín po podaní etanolu. Každý bod predstavuje priemer z piatich myší. p Hotel < 0,05 (d) TUNEL farbenie WT sliznice (vľavo) a TG sliznice (vpravo). Obe sekcie sú za sebou, ktoré sú v 2B
, resp. Apoptotické bunky sú viditeľné s tmavo hnedou jadier. Početné apoptotické bunky sú uvedené v WT sliznici. Všetky fotografie boli 6 hodín po podaní etanolu. Mierka :. 100 um
žalúdočnej sliznice prietok krvi v etanole liečených sliznice
Hoci boli popísané rad cytoprotektívnych regulačných faktorov, vrátane NO, CGRP, COX2 a HSP70 [12, 13, 31, 32] , slizničnej prietok krvi bol navrhnutý ako primárny faktor pre ochranu a navrátenie etanolom indukovanej žalúdočnej zranenia [1, 33]. Merali sme žalúdočné prietok krvi umiestnením sondy laserového Dopplerovho prietokomeru na žalúdočnú sliznicu dostať cez exponované brušnej steny v anestetizovaných myší. Žalúdočné prietok krvi sa znížil po podaní etanolu na žalúdočnú sliznicu WT myší (obrázok 3), označené tým, 43,5 ± 6,37%. Na rozdiel od toho len to po podaní etanolu na TG sliznicu (obrázok 3) sa znížil o 17,2 ± 9,21%. To znamená, že prietok krvi žalúdka bol dobre udržiavaná v TG sliznicu a to aj po spracovaní etanolom. Vzhľadom k tomu, mukóznej ischémia je jedným z najdôležitejších faktorov, ulcerogénne [33], udržiavanie žalúdočné prietoku krvi sa zdá byť zásadným faktorom pre ochranu sliznice. Obrázok 3 Stanovenie žalúdočnej sliznice prietoku krvi v žalúdočnej sliznici. Žalúdočnej sliznice prietok krvi bola hodnotená porovnaním pomeru krvného toku pred a po liečbe etanolu. Pomer bol získaný ako percento proti prietoku krvi pred liečbou, ktorý bol v WT sliznici oveľa väčšie ako v TG sliznici. * P Hotel < 0.03.
Vyjadrenie cytoprotektívnych proteínov: NO syntázy, COX-2, a HSP70
Ak chcete preskúmať mechanizmus udržanie vysokého krvného prietoku v TG sliznici, sme skúmali expresiu NO syntázy, čo nedáva žiadny z arginínu, a uvoľňuje hladké svalstvo cievach prostredníctvom cGMP-dependentný proteínkinázy [34]. Existujú tri typy NO syntázy (NOS): neurálnej NOS (nNOS), inducibilní NOS (INOS), a endoteliálny NOS (Enos). nNOS a Enos sú konštitutívne exprimovaných, vzhľadom k tomu, INOS je indukovaná na žalúdočné poranenia [35]. nNOS bol rozdelený podobne ako PAS farbenie cez foveolární jamy oblasti (obrázok 1 g); bolo pozorované v priebehu predĺženého jamy TG sliznice a bol obmedzený na luminální jamy sliznice WT (obrázok 4a). Enos sa slabo rozptýlené cez celú žalúdočnej sliznice podobne ako v WT a TG sliznice (dáta nie sú uvedené). Farbiace INOS bol zanedbateľný v WT sliznici, hoci to bolo vysoko indukovaná v spodnej oblasti žliaz po sliznice bola vystavená etanolu (obrázok 4b). V TG sliznice, INOS bol konštitutívne exprimovaný v dolnej žľazovej oblasti podobne ako pred a po poranení (obrázok 4b), ktorý sa objaví, aby ďalej prispieva k udržaniu vysokej prietoku krvi. Obrázok 4 imunologické z NO syntázy v žalúdočnej sliznici. Mierka: 100 um. (A) nNOS imunologické. nNOS bol viditeľný pozdĺž oblasti jamy, čo vedie k jeho širšej distribúcii pozdĺž podlhovastého jamy v TG sliznici. (B) INOS imunologické. INOS bola indukovaná v dolnej oblasti žliaz po poranení etanolu v WT sliznici, vzhľadom k tomu, že bol konštitutívne exprimovaný v rovnakej oblasti TG sliznice bez ohľadu na zranenia etanolu.
Prostaglandíny boli navrhnuté ako hlavný faktor cytoprotektivním pred viac ako tridsiatimi rokmi [ ,,,0],8] a ich úlohy boli značne študoval [36, 37]. Úloha enzýmov prostaglandíny tvárnenie, COX-1 a COX-2, bola sporná v ochrane sliznice žalúdka pred dráždivými [7, 11, 32]. Skúmali sme expresiu COX v WT a TG sliznice pri poranení etanolu. Expresie COX-1 sa nelíšila medzi WT a TG sliznice, ani pred alebo po zranení etanol (obrázok 5b). COX-2 nebola detekovateľná v WT sliznicu, ale jeho expresie sa ukázalo, 6 h po poranení etanolu, a jeho farbenie bol lokalizovaný na spodnej glandulární oblasti (obrázok 5a a 5b). V TG sliznice sa imunologické COX-2 bola intenzívna pri rovnakom regióne ešte pred zranením a zostal kladný po zranení (obrázok 5a). Vzhľadom k tomu, Coxs Ukázalo sa, že sa vyjadrí v mezenchymálnych bunkách, ako sú fibroblasty a mononukleárnych buniek v žalúdočnej sliznici [38], a spôsob streptoavidin /biotín /HPR niekedy predstavuje falošne pozitívne farbenie, sme vykonali imunofluorescenčný farbenie za použitia zmrazeného časť, ktorá potvrdila, COX expresia podobne v spodnej žľazovej oblasti TG sliznice (dáta nie sú uvedené). Imuno-blottingom, COX-2 zvyšuje po zranení v WT sliznici, vzhľadom k tomu, že sa veľmi zvýši na podobnom rozsahu pred a po poranení (obrázok 5b). Dôsledne, prostaglandín E 2 hladiny boli významne vyššie v sliznici TG ako v WT sliznici (obrázok 5c).

• Sekvencia genómu Helicobacter suis podporuje jej úlohu v žalúdku pathology
• Up-regulácia CLDN1 v karcinómu žalúdka je v korelácii sa zníži survival