Integrative roolit transformoivan kasvutekijä-α on solusuojaus mekanismeihin mahalaukun limakalvon vauriota

Integrative roolit transformoivan kasvutekijä-α on solusuojaus mekanismeihin mahalaukun limakalvon vauriota
tiivistelmä
tausta
Transforming kasvutekijä α (TGFa) suojaa mahalaukun limakalvon vauriota ja helpottaa haavan paranemista. Kuitenkin sen yliekspressio tiedetään aiheuttavan hypertrofinen gastropathy muistuttava Menetrier tauti siirtogeenisissä (TG) hiirillä koskevasta FVB pohjalla, yksi tekijöistä raportoitu aiemmin. Tutkimme toinen TGFa ilmentäviä hiiren linja on CD1 taustalla, jonka mahan limakalvon näyttää normaalilta. Koska tämä TG hiiri oli hyvä vastustuskyky etanolin aiheuttamia mahalaukun vamma, me pidetään pitkän aikavälin vaikutusta TGFa useaan mahalaukun suojamekanismit. Tool Menetelmät
TGFa-ilmentäviä siirtogeenisiä (TG) hiiren linjat, joilla on ihmisen TGFa cDNA valvonnassa hiiren metallotioneiini-geenin I promoottori kertyi on CD1 hiiren tausta, ja analysoidaan niiden etanoli vammoja kestävä fenotyypit tuottama TGFa.
tulokset
Vuonna TG limakalvon verenkiertoa oli hyvässä kunnossa jälkeen etanolin loukkaantumisen . Edelleen, hermo ja indusoituvia tyyppejä NO-syntaasin olivat johdonmukaisesti ja laajalti ilmaistu TG limakalvon, verrattuna rajoitettu jakelu hermo tyyppiä NO nopaliinisyntaasin luminaalisessa kuoppaan alueella villin tyypin (WT) limakalvolla. COX-2 ja sen alkupään transkriptiotekijä NFKB oli konstitutiivisesti koholla TG limakalvolla jo ennen etanolin antoa, kun taas ne indusoitiin samalla alueella WT limakalvon vasta etanolia loukkaantumisen. Kaksi anti-apoptoottiset proteiinit, HSP70 ja Bcl-2, ilmentyivät TG limakalvolla jo ennen etanolin antoa, vaikka niitä ei ole ilmaistu WT limakalvolla ennen vahinkoa. Lisäksi pro-kaspaasi 3 aktivaatio estyi TG limakalvolla, kun se muutettiin aktiiviseksi muodokseen WT limakalvon etanolin antamisen jälkeen.
Johtopäätös
Olemme päätellä, että TGFa ylläpitää mahalaukun limakalvon suojaa mahalaukun vahingon integrointi muihin soluja suojaava mekanismeja.
Tausta
Etanoli on pitkään käytetty tuottamaan aivoverenvuotoon mahalaukun limakalvon vauriota jyrsijöillä [1]. Suun kautta absoluuttinen tai suolahappoa-happamaksi etanoli, laaja aivoverenvuotoon vauriot voidaan tuottaa mahalaukun limakalvon. Tämä kokeellinen mahalaukun vahinko mallia on usein käytetty mahalaukun limakalvon suojan ja palauttamista tutkimuksia. Itse asiassa useat cytoprotective yhdisteitä on testattu arvioida niiden potenssia vastustavat mahalaukun vamma, mukaan lukien ruoansulatuskanavan hormonit, kasvutekijät, prostaglandiinit, bioaktiiviset amiineja, ja lievä ärsykkeet, kuten kapsaisiinia [2-5]. Näiden yhdisteiden joukossa, epidermaalinen kasvutekijä (EGF) kasvutekijöiden, erityisesti transformoiva kasvutekijä α (TGFa), on raportoitu voimakas soluja suojaavat yhdisteet vastaan ​​etanoli, etikka- happo- tai aspiriini aiheuttaman mahalaukun vahinkoa [2, 4].
TGFa ilmaistiin rotan mahalaukun limakalvon suun kautta happamaksi taurokolaatti tai suolahappoa, mikä viittaa sen reparative rooli mahan vahinkoa [6]. TGFa annettuna vatsaonteloon suojattu etanolin aiheuttamia maha- vamman kanssa kasvoi merkittävästi tarttuu mahan musiinia rotilla [7]. Soluja suojaava funktio TGFa näytti välittyvän aktivoinnin fosfolipaasi C-γ1, mutta ei prostaglandiinit, ja se oli riippumaton erityksen vastainen vaikutus TGFa [7]. Toisaalta, prostaglandiinit ja niiden synteettiset entsyymi, syklo-oksygenaasi (COX), on kauan ehdotettu cytoprotective tekijöitä vastaan ​​mahalaukun vahinkoa [5, 8]. EGR on osoitettu ilmaista indusoituvan COX isoformi, COX-2, on RGM1 rotan mahalaukun limakalvon solu- linjan kautta ERK MAP kinaasireitin [9] ja Swiss 3T3 fibloblasts, erityisesti stimuloimalla yhdessä gastriini [10]. Lisäksi COX-2-ekspressio hepariinia sitovat EGF: n kaltainen kasvutekijä, joka kuuluu EGF-perheen kasvutekijät, on estetty tiettyä EGF-reseptorin (EGF-R) estäjä rotan mahalaukun limakalvon [11]. Näin ollen EGF-R-signaali näyttää välittävän COX-2-induktion mahalaukun limakalvon.
Tärkein cytoprotective mekanismit ovat mahalaukun limakalvon verenkierto. EGF: n ja TGFa on osoitettu olevan soluja suojaavaa vaikutusta stimulaation kautta kapsaisiinia herkkiä neuronien vapautumista kalsitoniinin geenin liittyvän peptidin (CGRP) ja typpioksidin (NO) rotilla, jotka altistettiin orogastric etanolin antoa, mikä nostaa mahalaukun limakalvon veressä virtaus [11, 12]. Sen sijaan, Konturek et ai. minimoitu rooli CGRP-riippuvaisen nousu mahalaukun verenvirtauksen osoittamalla, että hallinnon NO: ta vapauttavan aspiriini tarjosi suojan absoluuttista etanolin aiheuttamia mahalaukun vammoja jopa kapsaisiinin denervated rottia, jolloin ylösajon lämpöshokkiproteiini 70 (HSP70 ) ilmaisun ja vaimennuksen oksidatiivisen vahinkoa vahvan säätelyä antioksidatiivisen geenien kuten sinkin kupari (SOD) ja glutationiperoksidaasi- [13].
TGFa immunovärjättiin pääasiassa GSM soluissa pitkin mahalaukun kuoppaan ihmisellä [14], intensiivisesti viskeraalipuolen limakalvojen (GSM) solujen päälle proliferatiivinen vyöhyke ja heikosti pitkin rauhas alueella alle proliferatiivinen vyöhyke rotilla [15], ja selvästi pitkin limakalvojen kaulan solun alueella FVB /N-kannan hiirillä [16]. Toisaalta, EGF-R immunovärjättiin GSM epiteelisoluihin foveolar kuoppaan ja limakalvojen kaulan solun alueella alempaan rauhas alueella ihmisellä [17]. Rotilla, EGF-R paikallistettiin yläreunasta kuoppaan alueen ja pääsolun klustereita alareunassa maharauhanen [15]. Vaikka TGFa tiedetään indusoivan solujen lisääntymistä in ensisijainen-viljellyissä rotan mahalaukun limakalvon soluista [18], ja hyperplastisessa leviämisen limakalvolla on TGFa-ilmentäviä siirtogeenisiä (TG) hiiri [19, 20], jakelu TGFa ja EGF-R in terminaalisesti erilaistuneita mahalaukun limakalvon soluissa viittaa siihen, että TGFa kiinnostavuus ei-proliferatiivinen toimintoja kuten antiapoptooppinen vaikutuksia ja mahalaukun epiteeliesteen muodostumista autokriini /parakriinisesti. Esimerkiksi TGFa inhiboi apoptoosia hiiren mahan limakalvon solulinja, GSM06, ilmaisemalla anti-apoptoottisten Bcl-2-perheen proteiinien kautta NF-KB-riippuvaisen reitin [21]. Mahalaukun apikaalisella ja basolateraaliseen EGF-R: n on osoitettu aiheuttavan vähenemistä parasellulaarista läpäisevyyttä hapon suojelemiseksi rauhasten solujen happamassa ympäristössä [18, 22]. Siten TGFa kykenee sekä proliferatiivista ja ei-proliferatiivinen vaikutus mahalaukun limakalvon toimintoihin, ja nämä erilaiset TGFa vaikutuksia olisi arvioitava uudelleen, ainakin suhteen, ovatko niiden tulokset on johdettu lyhytaikaisessa hoidossa käytetään kulttuurin solulinjoja tai pitkä- termi ilmaisu käyttämällä TGFa-siirtogeenin ilmentävien eläinten.
Kymmenen vuotta sitten, yksi kirjoittajista, H. Takagi, syntyy TGFa-ilmentävien TG hiirikantojen valvonnassa metallotioneiini-geenin promoottori, ja yksi näistä riviä (MT100) näytteillä hypertrofinen gastropathy muistuttava Menetrier tauti, kuten vastaavasti on esitetty toiset tutkijat [19, 20]. Sen sijaan toinen TG linja (MT42) näytetään normaali-esiintyy mahalaukun limakalvo, vaikka TGFa-siirtogeeni ilmentyi samassa määrin sekä TG linjat [20]. Koska MT42 viiva näkyy yllättävän kestävyyden tasoa etanolin aiheuttaman vahingon mahan limakalvon, katsoimme, että voisi olla hyödyllistä tutustua ei-proliferatiivisia vaikutuksia TGFa kuten limakalvojen vastustuskykyä etanolia vammoja. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet pitkän aikavälin vaikutuksia TGFa on etanolin aiheuttamia mahalaukun vahinkoa analysoimalla muutoksia soluja suojaavat ja anti-apoptoottiset sääntelyyn tekijöistä, mukaan lukien mahalaukun veren virtaus, NO-syntaasi, COX-2, ja apoptoosiin liittyvien proteiinien, kuten HSP70, Bcl-2, ja kaspaasi 3
menetelmät
TGFa-ilmentävien siirtogeenisten hiiren ja etanolin aiheuttamia mahalaukun vamman
TGFa-ilmentävien siirtogeenisten (TG) hiiren linjat, joilla on ihmisen TGFa cDNA: n valvonnassa hiiren metallotioneiini-geenin I-promoottorin tuotettiin on CD1 tai FVB hiiren tausta, kuten aiemmin on kuvattu [20]. Yksi TG linjat, MT100 koskevasta FVB hiiren tausta, näytetään hypertrofinen gastropathy muistuttava Menetrier tautiin [20], kun taas toinen linja, MT42 on CD1 hiiren tausta, näytetään normaali-näkymästä mahalaukun limakalvon. Fenotyypin TGFa-TG hiiri näytti riippuvat Hiirikanta koska sekä MT100 ja MT42 linjat ilmaisi samanlaisen tason TGFa siirtogeenin mahassa [20]. Tässä tutkimuksessa käytimme MT42 linja TGFa-ilmentävien TG uroshiirillä ja CD1 villityypin (WT) uroshiiriä iässä 6-8 viikkoa. Eläimiä pidettiin valvotuissa valoa (07:00-19:00) ruokaa ja vettä tarjotaan mielin määrin
.
Hiiriä, jotka painavat 30-35 g, pidettiin paastolla 24 tuntia ennen koetta, mutta saivat vapaasti vettä. Kaikki kokeelliset menettelyt vaikuttavat hiiret hyväksymän Animal Care ja käyttö arviointikomiteaan klo Gunma yliopistossa. Hiirille annettiin sitten orogastric happamaksi etanolilla (100 ui; 60% etanolia 0,15 mol /l HCl: a). Kolme, kuusi ja kaksitoista tuntia happamaksi etanoli hallinto hiiret tapettiin arvioimiseksi mahalaukun vahinkoa ja immunohistokemiallinen analyysit, ja RNA ja proteiini uuttamalla reaaliaikaiseen PCR, Northern ja Western blot-analyysit.
Fysiologiset tutkimukset
Mahahapon eritystä mitattiin kuten aiemmin on kuvattu [20, 23]. Lyhyesti, WT ja TG-hiiriä pidettiin paastolla 3 tuntia ja sitten nukutettiin eetterillä. Kun viiltäminen Vatsan pyrolus sidottiin, ja ommeltiin. Mahanesteen kerättiin 4 tunnin kuluttua pyrolus ligaatiolla. Maksimaalisen haponerityksen, eritykseen stimuloitiin ruiskuttamalla pentagastriinin ihon alle (500 ug /kg). Mahanesteen titrattiin 0,1 N NaOH: lla pH-arvoon 7,0, käyttäen microtitrator.
Mahalaukun limakalvon verenvirtaus mitattiin laser-Doppler-virtausmittaria (malli SFA211, Advance Co., Tokio) asettamalla koetin pinnalla mahalaukun limakalvon, kuten aiemmin on kuvattu [24]. Virtaus signaali seurattiin MacLab tallennus ohjelma. Veren virtaus on ilmaistu suhteessa perustasoon.
Morfologiset tutkimukset
paksuus mahalaukun limakalvon mitattiin korkeimman osan pohjaan rauhanen mikrometrillä. Samoin mahalaukun vahinko vauriot mitattiin (leveys ja pituusasteet) mikrometrillä laskea loukkaantui alueella.
Immuunivärjäystä saimme vasta seuraavasti. Polyklonaalinen vasta-H + /K + - ATPaasi saatiin ruiskuttamalla kani perietaalisolun-mikrosomaalifraktioilla hiiriin [25]. Kanin polyklonaalinen vasta metallotioneiinin oli ystävällinen lahjoitus tri Nagamine, Gunma University School of Health Sciences [26]. Olemme hankkineet vasta-aineita seuraavasti: kanin polyklonaalinen vasta-aine TGFa, kanin polyklonaalinen vasta-aineella EGF-R, vuohen polyklonaalinen vasta-aine COX-2, kanin polyklonaalinen vasta-aine NFKB, ja hiiren monoklonaalinen vasta-aine on nNOS: n ja iNOS Santa Cruz Biotech. (Santa Cruz, CA); Hiiren monoklonaalinen vasta-aine proliferatiivinen-solun tuma-antigeenin (PCNA) alkaen Zymedin Lab. (South San Francisco, CA); lampaan vasta-aine ihmisen pepsinogeeni II: Biopur AB (Bubendorf, Sveitsi), joka myös reagoi hiiren pepsinogeeni; kanin polyklonaalinen vasta-aine HSP70 alkaen Stressgen Biotech. (Victoria, BC, Kanada); ja hiiren monoklonaalinen vasta-aine ja Bcl-2-BD Biosciences (San Diego, CA).
varten piparjuuriperoksidaasi (HRP) -catalyzing immunohistokemiallisella värjäyksellä, jauhettu mahat vahvistettu neutraloitiin 10% formaliinilla 4 ° C: ssa 24 tuntia, ja sitten upotettu parafiiniin mikrotomi leikkuu. Parafiini kudosleikkeet rehydratoitiin ja inkuboitiin 3% vetyperoksidia ratkaisu estää endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus. Sitten leikkeitä inkuboitiin ensimmäisen vasta-aineen edellä kuvatun sopivan laimennuksen huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan. Toissijainen biotinyloitu vasta-aine valitaan perustuen ensimmäisen vasta-ainetta tuottavien eläinlajien, ja sitten käytettiin HRP-konjugoitua streptavidiinia. HRP Reaktio suoritettiin 3-amino-9-etyyli-karbatsoli ja vetyperoksidi ohjeiden mukana toimitettu streptavidiini-biotiini värjäys Vectastatin Elite Kit (vektorit Laboratories, Burlingame, CA). Positiivinen värjäykset ilmestyi ruskeaa.
Varten immunofluoresenssivärjäyksellä, jauhettu mahat fiksoitiin 4% paraformaldehydi 0,1 M fosfaattipuskurissa, pH 7,4 4 ° C: ssa 24 tuntia. Pieniä paloja jauhetun kudoksen tehtiin sakkaroosia korvaaminen ja upotettiin OCT-yhdiste valmisteltaessa jäädytetty osio käyttämällä mikrotomia. Ensisijaisen immunoreaktion, viipaloitu leikkeet tutkittiin ensimmäisen vasta-aineen, ja inkuboitiin sitten joko indodicarbocyanide (Cy3) -konjugoitu affiniteettipuhdistettua aasin anti-kani-anti-hiiri-IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), tai fluoreseiini isotiosyanaatti (FITC) -leimattua anti-kani-IgG: llä (Jackson Immuno- Research), toissijaisena vasta-aineena. Sekundaarinen vasta-aine IgG valittiin perustuen lajien, joista ensimmäinen vasta-aine on esitetty.
In situ havaitseminen apoptoottisten solujen suoritettiin käyttäen In Situ Apoptosis Detection Kit (TAKARA BIO INC. Tokio, Japani). Kitti sisälsi terminaalin deoksinukleotidyylitransferaasin välittämää deoksiuridiinista trifosfaatti biotiini nick end-merkintöjä (TUNEL) koejärjestelmässä. Vatsa leikkeitä läpäiseviksi proteinaasi K, ja 3'-OH-päät DNA-fragmenttien värjättiin sitten ohjeiden mukana sarjasta. Ytimet värjätty tummanruskea katsottiin apoptoottiset solut.
RNA-analyysi
Vatsa leikattiin ja koko RNA: t uutettiin käyttäen TRIzol (Gibco BRL, Tokio) protokollan mukaisesti valmistajan toimittamia. Northern blot, kokonais-RNA: lle tehtiin elektroforeesi 1,0% agaroosigeelillä ja siirrettiin nailonkalvolle (Amersham Pharmacia Biotech, Tokio). Hybridisaatio suoritettiin koettimella ihmisen TGFa cDNA (917 emäsparia) leimataan [α- 32P] deoksi-CTP. Tämä koetin tunnistaa ihmisen TGFa mRNA, mutta ei hiiren TGF mRNA.
Mouse TGFa mRNA taso mitattiin käyttämällä reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (PCR), jossa glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) sisäisenä kontrollina. Todellinen aika PCR suoritettiin käyttäen ABI Prism 7700 Sequence Detector ja pehmeä (Applied Biosystems, Foster City, CA) käyttäen DNA fluoresoiva väriaine SYBR Green havaitsemiseen. Alukkeet suunniteltiin käyttäen Primer Express suunnitteluohjelmistot (Applied Biosystems). Lopullinen tulos kukin näyte normalisoitiin kunkin GAPDH arvo. Alukesekvenssit ovat seuraavat: hiiren TGFa: 5'-CCTGAGCACCCGAAGAT-3 'ja 5'-CCTTCCCTCATGCCTTACT-3'; GAPDH: 5'-GTCGTGGATCTGACGTGCC-3 'ja 5'-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3'.
Western blot-analyysi
Mahalaukun kudosnäytteet leikattiin ja peräisin olevan proteiinin kokonaismäärän mahan limakalvon homogenisoitiin RIPA-puskurissa, joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita (fenyylimetyylisulfonyylifluoridi, pepstatiinia, leupeptiiniä ja aprotiniini) (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa). Supernatantti erotettiin SDS-PAGE-geeli, ja sen jälkeen blotattiin polyvinylideenidifluoridimembraanille kalvo. Membraani tutkittiin seuraavilla vasta-aineilla: vasta-iNOS, COX-1, COX-2, HSP70, ja Bcl-2, jotka olivat samoja, joita käytetään morfologiset tutkimukset; Hiiren monoklonaalinen vasta-aine Bax (Santa Cruz Biotech.); kanin polyklonaalinen vasta-aine kaspaasi 3 (Santa Cruz Biotech.); ja hiiren monoklonaalinen vasta-aine aktiinisäikeiden (Santa Cruz Biotech.). Vasta-aine-reagoimaan vyöhykkeet havaittiin käyttäen ECL-detektiojärjestelmässä (Amersham, Buckinghamshire, UK).
Mittaus gastriinin
Seerumin gastriini mitattiin käyttäen gastriinin radioimmuno- (gastriini RIA Kit, Dainabot, Tokio, Japani). Vasta-aine on spesifinen gastriini kanssa amidiryhmä sen karboksyylipäähän.
Mittaus Prostaglandiini E2
mahalaukun limakalvon homogenisoitiin 4 ° C: ssa lyysipuskuria. Homogenaatteja sentrifugoitiin 12000 rpm 20 minuutin ajan, ja supernatantit altistettiin prostaglandiini E 2 määrityksessä käyttämällä prostaglandiini E 2 Monoklonaaliset Enzyme Immunoassay Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), mukaisesti valmistajan ohjeiden .
tilastollinen analyysi
tilastollinen analyysi suoritettiin toistuvasti toimenpiteen varianssianalyysi (ANOVA) ja kokonaispituus mahalaukun vaurioiden parittomalla t-testi mahalaukun limakalvon verenvirtauksen väheneminen suhde. Kaikki arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SE. P < 0.05 hyväksyttiin tilastollisesti merkitsevä.
Tulokset
karakterisointi TGFa ilmentävien TG hiiren mahan limakalvon
WT CD1 rasitusta ja TGFa-siirtogeenin ilmentävien MT42 linjan hiirissä kasvoi samalla ja osoittanut mitään havaittavaa eroa niiden ominaisuuksia, käyttäytymistä, tai elinikä. Suurin paksuus havaittiin mahalaukun seinämän ja fundic rauhaset olivat 3,50 ± 0,18 mm ja 2,33 ± 0,20 mm, vastaavasti, WT hiirillä, ja 3,85 ± 0,24 mm ja 2,63 ± 0,16 mm, vastaavasti, TG hiirillä; ei ollut merkittäviä eroja muoto mahalaukun limakalvon ja rauhaset välillä WT ja TG hiirillä. Lisäksi normaalin ulkonäkö mahan limakalvon, tämä TG hiiren linja oli myös normaali-esiintyy maksan, haiman, ja muut elimet.
Sitten verrattuna erityksen kapasiteetin välillä WT ja TG hiirillä. Vuonna WT hiirillä, maksimaalinen hapon tuotanto lisääntyi merkittävästi lähtötasosta 25 ± 1,4 mmol /h 50 ± 5,8 mEq /h jälkeen pentagastriinin stimulaation. Sen sijaan, että TG hiirillä, maksimaalinen hapon tuotanto kasvoi vähemmässä määrin 30 ± 5,7 mEq /h pohjapinta tuotos 23 ± 0,7 mmol /h (n = 5 WT ja TG hiiret). Tylpistetty haponerityksen voi heijastaa pienentää parietaalisolun massa TG limakalvon (kuva 1e). Kuvio 1 karakterisointi TGFa-ilmentävien TG limakalvolle. Scale kussakin luku osoittaa 100 pm. (A) jakelu TGFa-ilmentävien solujen. Brown-värinen TGFa-positiiviset solut olivat nähtävissä pitkin luminaalinen kuoppaan alue WT limakalvon, pitkänomainen foveolar kuoppaan alueelle, ja alempi kolmannes rauhasten alue TG limakalvolla. (B) päällekkäisyys punaisen TGFa-positiivisten solujen ja vihreäsävyisenä H + /K + -ATPaasi-positiivisten parietaalisoluihin. Ala TGFa-positiivisten solujen klusterin ovat erillään vihreäsävyisenä parietaalisoluissa TG limakalvolla. (C) Northern blot ihmisen TGFa mRNA ja PCR-monistettiin hiiren TGFa mRNA. Ihmisen TGFa mRNA ilmentyy TG limakalvon yksinään (vasen paneeli), mutta PCR-monistettiin hiiren TGFa mRNA ilmentyy samalla sekä WT ja TG limakalvojen (oikea paneeli). (D) Western blot TGFa välimuotoja. TGFa esiaste (20 kDa) ja sen välimuotoja visualisoidaan intensiivisemmin TG limakalvon kuin WT limakalvolla. (E) lokalisaatio EGF reseptorin mahalaukun limakalvon. EGF-reseptorin (EGF-R) värjättiin Cy3 (punainen) ja H + /K + -ATPaasi-värjättiin FITC (vihreä). EGF-R immunovärjättiin maltillisesti ylemmässä kuoppaan alueella ja voimakkaasti alemmassa rauhas alueella samalla sekä WT ja TG limakalvojen. (F) jakautuminen metallotioneiinin mahalaukun limakalvon. Metallotioneiini on immuno- voimakkaasti alemmassa rauhas alueella, ja kohtuullisesti pitkin foveolar alueella. (G) venynyt mahalaukun kaivoon TG limakalvon. PCNA-positiivisten solujen jaetaan ylhäällä kolmas alue WT maharauhanen, kun taas ne jaetaan enemmän numerously ja laajasti keskellä rauhas alueella. (H) PAS värjäys osoittaa pitkänomainen kuoppaan TG limakalvolla.
Expression TGFa siirtogeenin
TGFa ilmentäviä solutyyppejä tunnistettiin perustuvat solu- tyyppikohtaisia ​​immunovärjäyksellä ja niiden limakalvojen sijainti. TGFa oli tiettävästi immuno- pitkin GSM solut mahalaukun kuoppaan ihmisellä [14] ja rotilla [15], ja pitkin limakalvojen kaulan solun alue FVB kannan hiiret [16]. Esillä olevassa tutkimuksessa, ruskea värinen TGFa-positiiviset solut jaettiin pitkin foveolar alueella sekä WT ja TG limakalvoja, ja pitkin alemman rauhasten alueen TG limakalvon (kuva 1a). TGFa-positiivisten solujen pitkin foveolar alue näytti olevan mahalaukun kuoppaan soluja, joka perustuu niiden sijainnin (kuvio 1 b, ylempi paneeli), ja ne pitkin alempaa rauhas alueella TG limakalvon ei päällekkäisiä vihreäsävyisenä H + /K + - ATPaasi-positiiviset parietaalisoluissa (kuvio 1 b, alempi paneeli), mutta ei päällekkäin pepsinogeeni-positiiviset pääsoluissa (tuloksia ei ole esitetty). Vasta-käytimme immuunivärjäykseen TGFa voinut erottaa ihmisen ja hiiren TGFa, mutta sen mRNA koetin voisi tehdä niin, että Northern blot-analyysi. Ihmisen TGFa-siirtogeeni ilmentyi TG limakalvolla kun taas mitään ilmentymistä havaittiin WT limakalvon (kuva 1c, vasen paneeli). Sen sijaan hiiren endogeenisen TGFa mRNA samalla ilmaistu sekä WT ja TG limakalvojen reaaliaikaisella PCR: llä (kuvio 1 c, oikea paneeli). TGFa on 50 aminohapon peptidi, joka on johdettu sen 160 aminohappoa, kalvon poikki ulottuvaa esiaste pilkotaan tuumorinekroositekijä-α-konvertoivan entsyymin (TACE) [27, 28]. Ylijäämää ilmentymistä ihmisen TGFa-siirtogeenin TG limakalvolla, noin 20 kDa: n TGFa edeltäjän ja sen välimuotoja lisättiin immunoblottauksella (kuvio 1 d).
Koska sekä edeltäjän ja prosessoituja muotoja olivat yhtä aktiivisia stimuloimiseksi EGF -R [28], me edelleen tutkittiin EGF-R lokalisointi limakalvolla. EGF-R paikallistettiin voimakkaasti alemmassa päätoimittaja soluklusterin alue ja maltillisesti limakalvojen kaulan solun alueella ja foveolar kuoppaan alueella sekä WT ja TG limakalvojen (kuvio 1 e), kuten on raportoitu aikaisemmin rotan mahalaukun limakalvon [15 ]. Koska TGFa siirtogeenin kontrolloitiin alle hiiren metallotioneiini-geeniä [20] ja metallotioneiinin on tiettävästi tuotettu mahalaukun limakalvon [29], tutkimme metallotioneiini-ilmentäviä solu- tyyppejä limakalvolla. Immunohistokemiallisesti, olemme huomanneet metallotioneiini värjäystä enimmäkseen pitkin alempaa rauhas alueella ja scatteringly pitkin kaivoon alueen valvontaa CD1-kannan mahalaukun limakalvon (kuva 1f). Siten jakelu TGFa-ilmentävien solujen tyypit on samanlainen kuin metallotioneiini-ilmentävien solujen TG mahalaukun limakalvon (kuviot 1 a ja 1 f).
Kun WT hiiren limakalvon, H + /K + - ATPaasi-positiiviset parietaalisoluissa oli laajalti eri puolilla rauhas alueella paitsi ylhäältä kuoppaan kerroksen, kun taas H + /K + - ATPaasi-positiivisten glandular alue pienennettiin korkeus TG limakalvo (Kuva 1e). Todellakin, kannaksella juuressa kuopan alueella, joka vahvistettiin PCNA värjäys, siirrettiin alas keskelle TG limakalvon (kuvio 1g). Lisäksi PCNA-positiivisia soluja oli paksusti jaettu keskellä limakalvon. Johdonmukaisesti, PAS-värjäys-positiivisten foveolar kuoppaan oli pitkänomainen TG limakalvon toisin lyhyellä kuoppa WT limakalvon (kuvio 1 h). Näin ollen, vaikka korkeus mahalaukun limakalvon oli samankaltainen WT ja TG limakalvojen, proliferatiivinen vyöhyke on siirretty alaspäin ja foveolar kuoppa alue oli enemmän pitkänomainen, jossa on alennettu rauhas alue TG mocosa. Koska kasvu kuopan solujen vahvasti edesauttavat gastriini [25, 30], vertasimme seerumin gastriinipitoisuuksille välillä WT ja TG hiirillä mutta ei löytänyt kasvua seerumin gastriinin TG hiiri (WT, 213 ± 41 pg /ml; TG, 263 ± 47 pg /ml, n = 5, p = 0,438).
etanoli aiheuttamaa mahalaukun vahinkoa WT ja TG hiiri limakalvojen
Orogastric anto happamaksi etanolin (100 ui) aiheutti aivoverenvuotoon vahinkoa TG limakalvon (kuva 2a, vasemmalla). Histologisesti vahinko kuorittu pois kuoppaan ja kannas alueita ja ulottui puoliväliin glandular alue (kuva 2b, vasemmalla). Sen sijaan tällainen vahingon TG hiiren limakalvo ollut merkittävä (kuva 2a, oikealla). Vahingon oli histologisesti rajoitettu luminaaliselle kuopan alueelle (kuva 2b, oikealla). Vuonna WT limakalvon loukkaantunut alue kasvoi nopeasti huipun ollessa 6 h kuluttua etanolin annon, kun taas TG limakalvon alueelle kasvoi hitaasti ja minimaalisesti ilman selvä huippu (kuvio 2c). Johdonmukaisesti, apoptoottiset solut osoittavat TUNEL värjäys jaetaan syvästi alempaan rauhas alueella 3 tunnin kuluttua etanolin antoa WT limakalvolla, kun taas apoptoottiset solut rajoittuivat kuopan alueella, mutta eivät ulotu rauhas alue TG limakalvon ( Kuvio 2d). Kuvio 2 Etanoli aiheuttamaa mahalaukun vamman mahan limakalvoja. (A) makroskooppinen näkymä mahalaukun limakalvon. Asteikko: 5 mm. Molemmat limakalvojen ovat 6 h kuluttua etanolia annon. Huomaa, että WT limakalvo näyttää laaja aivoverenvuotoon vaurioita, sitä vastoin TG limakalvon näyttää ehjä jälkeen etanolin annon. (B) hematoksyliinillä ja eosiinivärjäykset etanoli-loukkaantunut WT limakalvon (vasemmalla) ja TG limakalvo (oikealla). Huomaa syvä haava muodostumista WT limakalvolla. Mittakaava: 100 pm. (C) ajan kuluessa etanolin aiheuttamia mahalaukun vammoja. Loukkaantunut alue piirretään ajan funktiona enintään 12 tunnin kuluttua etanolin annon. Kukin piste edustaa keskimäärin viidestä hiirestä. p
< 0,05 (d) TUNEL värjäys WT limakalvon (vasemmalla) ja TG limakalvo (oikealla). Molemmat osat ovat peräkkäisiä kuin vuonna 2B
, vastaavasti. Apoptoottisia soluja ovat näkyvissä tummanruskean ytimiä. Lukuisat apoptoottiset solut todettiin WT limakalvolla. Kaikki kuvat olivat 6 tunnin kuluttua etanolin annon. Mittakaava: 100 pm.
Mahalaukun limakalvon verenkiertoa etanoli saaneilla limakalvon
Vaikka useat cytoprotective sääntelyn tekijöitä on raportoitu, mukaan lukien NO, CGRP, COX2, ja HSP70 [12, 13, 31, 32] , limakalvon verenkierto on ehdotettu ensisijainen tekijä suojelemiseksi ja palauttamista etanolin aiheuttamia maha- vamma [1, 33]. Mittasimme mahalaukun verenvirtauksen sijoittamalla koetin laserin Doppler virtausmittarin mahan limakalvon käsiksi alttiina vatsan nukutetulla hiiri. Mahalaukun verenvirtaus laski merkitty 43,5 ± 6.37%, kun etanolin annon mahan limakalvon WT hiiren (kuva 3). Sen sijaan se vain laski 17,2 ± 9,21%, kun etanolin hallinnon TG limakalvon (kuva 3). Siten mahalaukun verenkiertoa oli hyvässä kunnossa, että TG limakalvon jälkeenkin etanolia hoidon. Koska limakalvon iskemia on yksi tärkeimmistä ulcerogenic tekijät [33], ylläpito mahalaukun veren virtausta ei näytä olevan olennainen tekijä limakalvon suojaa. Kuvio 3 arviointi mahalaukun limakalvon verenkiertoa mahan limakalvoja. Mahalaukun limakalvon verenkierto arvioitiin vertaamalla verenkiertoa suhde ennen ja jälkeen etanoli hoidon. Suhde saatiin prosenttia vastaan ​​veren virtaus ennen käsittelyä, joka oli paljon suurempi WT limakalvon kuin TG limakalvolla. * P
< 0.03.
Expression solua suojaavien proteiinien: NO nopaliinisyntaasin, COX-2, ja HSP70
Tutkia mekanismi korkea veren virtauksen ylläpitoon TG limakalvolla, tutkimme ilmentymä NO-syntaasin, jolloin NO arginiinista, ja rentouttaa verisuonten sileän lihaksen kautta cGMP-riippuvaisen proteiinikinaasin [34]. On olemassa kolmenlaisia ​​NO nopaliinisyntaasin (NOS): hermo NOS (nNOS), indusoituva NOS (iNOS) ja endoteelin NOS (eNOS). nNOS ja eNOS ovat konstitutiivisesti, kun taas iNOS indusoituu mahalaukun vahinko [35]. nNOS jaettiin samalla tavalla PAS-värjäytyminen yli foveolar kuopan alueelle (kuvio 1 g); havaittiin pitkänomaisen kaivoon TG limakalvon ja rajoittui luminaaliselle kaivoon WT limakalvon (kuva 4a). eNOS oli heikosti hajallaan koko mahan limakalvon samalla sekä WT ja TG limakalvojen (tuloksia ei ole esitetty). INOS värjäytyminen oli merkityksetöntä WT limakalvolla, vaikka se oli erittäin aiheutettiin alemmalla rauhas alueella sen jälkeen, kun limakalvo altistettiin etanolin (kuva 4b). Vuonna TG limakalvo, iNOS oli konstitutiivisesti alemmalla rauhas alueella vastaavasti ennen ja jälkeen vamma (kuva 4b), joka näyttää edelleen edistää ylläpitoon korkea veren virtausta. Kuva 4 immunovärjäys NO-syntaasin mahalaukun limakalvon. Mittakaava: 100 pm. (A) nNOS immunovärjäyksellä. nNOS näkyi pitkin kuoppaan alueella, jolloin sen laajempaa levitystä pitkin pitkänomainen kuoppa TG limakalvolla. (B) iNOS immunovärjäyksellä. iNOS aiheutettiin alemmalla rauhas alueella jälkeen etanolin vammoja WT limakalvolla, kun taas se oli konstitutiivisesti samalla alueella TG limakalvon riippumatta etanolin vammoja.
Prostaglandiinit ehdotettiin merkittävänä cytoprotective tekijä yli kolme vuosikymmentä sitten [ ,,,0],8] ja niiden roolit on tutkittu laajasti [36, 37]. Rooli prostaglandiini muodostavien entsyymien, COX-1 ja COX-2, on ollut kiistanalainen limakalvon suojaa mahan ärsyttävät [7, 11, 32]. Tutkimme ilmaisua COX WT ja TG limakalvojen aikana etanolin vammoja. Ilmaisu COX-1 ei eroa WT ja TG limakalvojen, eikä ennen tai jälkeen etanolin vamma (kuva 5b). COX-2 ei ollut havaittavissa WT limakalvolla, mutta sen ilmentyminen tuli selväksi 6 h kuluttua etanolia loukkaantumisen, ja sen värjäys paikallistettiin alempaan rauhas alueella (kuva 5a ja 5b). Vuonna TG limakalvon, COX-2-immunovärjäys oli voimakasta samalla alueella jo ennen vahinkoa ja pysyi positiivisena loukkaantumisen jälkeen (kuvio 5a). Koska Coxs on osoitettu ilmaistaan ​​mesenkymaalisten solujen, kuten fibroblastien ja mononukleaaristen solujen mahalaukun limakalvon [38], ja streptavidiini /biotiini /HPR menetelmä joskus aiheuttaa vääriä positiivisia värjäys, teimme immunofluoresenssivärjäyksellä käyttäen jäädytetty osa, joka vahvisti COX ilmentymistä vastaavasti alemmalla rauhas alueella TG limakalvon (tuloksia ei ole esitetty). Immunoblottauksella, COX-2 lisääntyi loukkaantumisen jälkeen WT limakalvolla, kun taas se oli erittäin kohonnut samassa määrin ennen ja jälkeen vamma (kuva 5b). Johdonmukaisesti, prostaglandiini E 2 tasot olivat merkittävästi korkeammat TG limakalvon kuin WT limakalvon (kuva 5c).

• Genomin Helicobacter suis tukee sen rooli mahan pathology
• Up-regulation CLDN1 mahasyövän korreloi pienentää survival