Integrative Rollen der transformierenden Wachstumsfaktor-α in den Zytoprotektion Mechanismen der Magenschleimhaut injury

Integrative Rollen der transformierenden Wachstumsfaktor-α in den Zytoprotektion Mechanismen der Schädigung der Magenschleimhaut
Zusammenfassung
Hintergrund
Transforming growth factor α (TGF α) schützt vor Verletzungen der Magenschleimhaut und die Wundheilung erleichtert. Allerdings ist seine Überexpression zuvor hypertrophe Gastropathie ähnelt Ménétrier-Syndrom in transgenen (TG) -Mäusen auf einem FVB Hintergrund, als einer der Autoren berichteten zu induzieren bekannt. Wir untersuchten eine andere TGFa-exprimierenden Mauslinie auf einem CD1 Hintergrund, deren Magenschleimhaut erscheint normal. Da diese TG Maus eine starke Resistenz gegen Ethanol-induzierten Magen-Schädigung hatte, betrachteten wir die langfristige Wirkung von TGF α auf mehreren Magenschutzmechanismen.
Methoden
TGFa-exprimierenden transgenen (TG) Mauslinien tragende humane TGF α cDNA unter der Kontrolle des Gens I-Promotor der Maus-Metallothionein wurden auf einem CD1-Maus-Hintergrund erzeugt und analysiert, um ihre ethanol Verletzungsresistente Phänotypen von TGF α hergestellt.
Ergebnisse In der TG mucosa
wurde Blutfluß auch nach ethanol Verletzung aufrechterhalten . Ferner wurden neuronale und induzierbare Arten von NO-Synthasen konsequent und weit verbreitet in der TG Schleimhaut ausgedrückt, verglichen mit der begrenzten Verteilung neuronaler Typ Schleimhaut NO-Synthase in der luminalen Pit-Bereich der Wildtyp (WT). COX-2 und seinem stromaufwärtigen Transkriptionsfaktor NFkB wurden konstitutiv in der TG-Schleimhaut erhöht noch vor ethanol Verabreichung, während sie erst nach ethanol Schädigung in der gleichen Region der WT mucosa induziert wurden. Zwei anti-apoptotische Proteine, HSP70 und Bcl-2 wurden in der TG mucosa aufreguliert noch bevor ethanol Verabreichung, während sie nicht in der WT Mukosa vor der Verletzung exprimiert wurden. Weiterhin pro-Caspase-3-Aktivierung wurde in der TG Schleimhaut gehemmt, während es in die aktive Form in der WT-Schleimhaut folgende Ethanol Verabreichung umgewandelt wurde.
Fazit
Wir schließen daraus, dass TGF α die Magenschleimhaut Verteidigung gegen Magen-Schädigung unterhält durch Integration weiterer zytoprotektive Mechanismen.
Hintergrund
Ethanol ist seit langem verwendet worden, bei Nagetieren [1] eine hämorrhagische Schädigung der Magenschleimhaut zu erzeugen. Bei der oralen Verabreichung von absolute oder Salzsäure angesäuerten Ethanol, können umfangreiche hämorrhagische Läsionen in der Magenschleimhaut hergestellt werden. Diese experimentelle Magen-Schädigung Modell für Magenschleimhaut Schutz und Restitution Studien häufig verwendet wurde. Tatsächlich sind eine Anzahl von zytoprotektive Verbindungen wurden getestet, um ihre Wirksamkeit im Widerstand gegen Magenverletzung zu bewerten, einschließlich gastrointestinaler Hormone, Wachstumsfaktoren, Prostaglandinen, bioaktive Amine und mild Reizstoffe wie Capsaicin [2-5]. Unter diesen Verbindungen, epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) Faktoren Familie Wachstum, insbesondere Wachstumsfaktor α (TGF α) Transformieren, wurden als potente zytoprotektive Verbindungen gegen Ethanol-, Essig- säure- oder Aspirin-induzierte Magenverletzungen berichtet [2, 4].
TGFa wurde bei der Ratte Magenschleimhaut nach oraler Verabreichung von angesäuerten taurocholate oder Salzsäure, was darauf hindeutet, seine reparative Rolle bei der Schädigung des Magens [6] zum Ausdruck gebracht. TGF α intraperitoneal geschützt gegen Ethanol-induzierte Magenverletzungen mit einer signifikanten Erhöhung der anhaftenden Magen Mucin in Ratten [7]. Die zytoprotektive Funktion der TGF α erschien durch Aktivierung von Phospholipase C-γ1 vermittelt zu werden, aber nicht von Prostaglandinen und war unabhängig von der antisekretorischen Wirkung von TGF α [7]. Auf der anderen Seite, Prostaglandine und deren synthetische Enzym Cyclooxygenase (COX), sind seit langem als zytoprotektive Faktoren gegen Magenverletzungen vorgeschlagen worden [5, 8]. EGF wurde eine induzierbare COX-Isoform, COX-2, in der RGM1 Ratte Magenschleimhaut Zelllinie durch eine ERK MAP-Kinase-Weg [9] und in Swiss 3T3 fibloblasts, insbesondere durch Co-Stimulation mit Gastrin [10] zum Ausdruck gezeigt. Weiterhin COX-2-Expression durch Heparin-bindenden EGF-like growth factor, ein Mitglied der EGF-Familie Wachstumsfaktoren wurde durch eine spezifische EGF-Rezeptor (EGF-R) Inhibitors in der Ratte Magenschleimhaut [11] blockiert. Somit scheint der EGF-R-Signal COX-2-Induktion in der Magenschleimhaut zu vermitteln.
Die wichtigsten zytoprotektive Mechanismen Durchblutung der Magenschleimhaut umfassen. EGF und TGF α wurden unter Freisetzung von Calcitonin-Gen-verwandtes Peptid (CGRP) und Stickstoffmonoxid (NO) in Ratten ausgesetzt orogastric ethanol Verabreichung, was zu einem Anstieg in der Magenschleimhaut Blut zytoprotektive Wirkungen über eine Stimulation von Capsaicin-sensitiven Neuronen ausüben gezeigt Durchfluss [11, 12]. Im Gegensatz dazu Konturek et al. die Rolle der CGRP-abhängige Zunahme der Durchblutung des Magens minimiert durch den Nachweis, dass die Verabreichung von NO-freisetz Aspirin gebotene Schutz gegen absolute Ethanol-induzierten Magen-Schädigung auch in Capsaicin-denervierten Ratten, was zur Hochregulation von Hitzeschockprotein 70 (HSP70 ) expression und Dämpfung der oxidativen Schädigung durch starke Hochregulierung von Genen antioxidative wie Zink Kupfer Superoxid-Dismutase (SOD) und Glutathion-Peroxidase [13].
TGF α wurde in Menschen [14] überwiegend in GSM-Zellen entlang der Magengrube immunhistochemisch, intensiv in Magenfläche Schleimhaut (GSM) Zellen über die proliferative Zone und schwach entlang der Drüsenbereich unter der proliferative Zone in Ratten [15], und deutlich auf der Schleimhaut Hals Zellenbereich in FVB /N-Mäuse-Stamm [16]. Auf der anderen Seite, EGF-R wurde in GSM-Zellen entlang der Becherzellhyperplasie Grube und Schleimhäute Hals Zellbereich mit dem unteren Drüsen Region beim Menschen [17] immunhistochemisch. Bei Ratten wurde ein EGF-R in der oberen Pit-Bereich und in den Hauptzellhaufen an der Unterseite der Magendrüsen lokalisiert [15]. Obwohl TGF- &agr; ist bekannt, die Zellproliferation in primär kultivierte Ratten-Magenschleimhaut-Zellen [18] und hyperplastische Proliferation in der Schleimhaut auf der TGF α-exprimierenden transgenen (TG) Maus [19, 20], die Verteilung von TGF α und EGF-R zu induzieren, in terminal differenzierten schlägt Zellen der Magenschleimhaut, dass TGF &alpha übt nichtproliferativ Funktionen, einschließlich anti-apoptotische Wirkung und Magenepithelzellen Barriere Bildung in einer autokrinen /parakrinen Weise. Zum Beispiel inhibiert TGFa Apoptose einer Maus Magenschleimhaut Zellinie GSM06, durch Exprimieren anti-apoptotische Bcl-2-Familie-Proteine ​​durch eine NF-kappaB-abhängigen Weg [21]. Gastric apikalen und basolateralen EGF-R wurde für den Schutz von Drüsenzellen in einer sauren Umgebung [18, 22] eine Abnahme der parazelluläre Permeabilität zu Säure zu induzieren. Somit übt TGFa sowohl proliferative und nicht-proliferative Effekte auf der Magenschleimhaut Funktionen, und diese verschiedenen TGFa Effekte sollten, zumindest in Bezug auf die neu bewertet werden, ob ihre Ergebnisse aus der Behandlung kurzfristigen abgeleitet werden unter Verwendung von Kulturzelllinien oder von langfris TG Mauslinien unter der Kontrolle des Metallothionein-Gen-Promotor Begriff Ausdruck TGF α Transgen-exprimierenden Tieren. vor einem Jahrzehnt
, einer der Autoren, H. Takagi, erzeugt TGFa-exprimierenden, und eine dieser Linien (MT100) ausgestellter hypertrophe Gastropathie Ménétrier-Syndrom ähnelt, wie in ähnlicher Weise von anderen Forschern gezeigt [19, 20]. Magenschleimhaut dagegen angezeigt TG eine andere Leitung (Truck MT42) einen normal erscheinenden, obwohl TGF- &agr; Transgen in einem ähnlichen Ausmaß in beiden TG Linien exprimiert wurde [20]. Da die Truck MT42 Linie einen überraschenden Grad an Widerstand gegen Ethanol-induzierte Schädigung der Magenschleimhaut angezeigt, als wir, dass es für die Erkundung der nicht-proliferative Wirkung von TGF α wie Schleimhaut Widerstand gegen Ethanol Verletzungen nützlich sein könnte. Magen-Schädigung durch die Analyse von Veränderungen in zytoprotektive und anti-apoptotische regulatorischen Faktoren in der vorliegenden Studie untersuchten wir die langfristigen Wirkungen von TGF α auf Ethanol-induzierten, einschließlich Magenblutung, NO-Synthase, COX-2 und Apoptose-assoziierte Proteine, wie HSP70, Bcl-2 und Caspase 3.
Methods
TGFa-exprimierenden transgenen Maus und Magenverletzung Ethanol-induzierten
TGFa-exprimierenden transgenen (TG) Mauslinien menschlichen TGF- α cDNA unter der Kontrolle des Lagers Maus-Metallothionein-Gen-Promotor I wurden auf einem CD1 oder FVB-Maus-Hintergrund erzeugt wird, wie zuvor beschrieben [20]. Einer der TG Linien, MT100 auf einer FVB-Maus-Hintergrund angezeigt hypertrophe Gastropathie Ménétrier-Syndrom ähnelt [20], während die andere Leitung, Truck MT42 auf einem CD1-Maus-Hintergrund, einen normal erscheine Magenschleimhaut angezeigt. Der Phänotyp der TGF α TG Maus erschien auf dem Mausstamm zu hängen, weil sowohl die MT100 und Truck MT42 Linien ein ähnliches Niveau des TGF α Transgen im Magen exprimiert [20]. In der vorliegenden Studie verwendeten wir die Truck MT42 Linie von TGF &alpha-exprimierenden TG männlichen Mäusen und CD1 Wildtyp (WT) männliche Mäuse im Alter von 6 bis 8 Wochen. Die Tiere wurden unter kontrollierten Licht (7.00 bis 19.00 Uhr) mit Futter und Wasser gehalten versehen ad libitum
., Die Mäuse mit einem Gewicht von 30-35 g, wurden 24 Stunden vor dem Experiment gefastet, aber hatten freien Zugang zu Wasser gelassen. Alle experimentellen Verfahren, um die Mäuse zu beeinflussen wurden von der Animal Care und Verwenden Review Committee an der Gunma-Universität genehmigt. (; 60% Ethanol in 0,15 mol /L HCl 100 ul) Die Mäuse wurden dann orogastric angesäuerten Ethanol. Drei, sechs und zwölf Stunden nach dem angesäuerten Ethanol Verabreichung werden die Mäuse für die Beurteilung der Magenschäden und immunhistochemische Analysen geopfert wurden, und für RNA und Proteinextraktion für Echtzeit-PCR, Northern und Western-Blot-Analysen.
Physiologische Untersuchungen
Magensäuresekretion wurde gemessen, wie zuvor beschrieben [20, 23]. Kurz gesagt, wurden WT und TG Mäusen für 3 h gefastet und dann mit Ether betäubt. Nach dem Anschneiden der Bauchdecke wurde die pyrolus ligiert und wurde der Schnitt vernäht. Der Magensaft wurde 4 h nach der Ligatur pyrolus gesammelt. Für maximale Säure-Ausgang wurde die Säuresekretion durch die Injektion von Pentagastrin subkutan stimuliert (500 ug /kg Körpergewicht). Der Magensaft wurde mit 0,1 N NaOH auf pH 7,0 unter Verwendung eines microtitrator titriert.
Durchblutung der Magenschleimhaut wurde mit einem Laser Doppler Flowmeter (Modell SFA211 Advance Co., Tokyo), gemessen mit einer Sonde auf der Oberfläche des Magen Platzierung mucosa, wie zuvor beschrieben [24]. Das Stromsignal wurde mit dem MacLab Aufnahmeprogramm überwacht. Der Blutfluss wurde auf das Grundniveau ausgedrückt relativ.
Morphologische Untersuchungen Die Dicke der Magenschleimhaut
vom höchsten Teil an der Unterseite der Drüse mit einem Mikrometer gemessen. In ähnlicher Weise wurden die Magen-Schädigung Läsionen gemessen (Breite und Länge) mit einem Mikrometer den verletzten Bereich zu berechnen.
Für die Immunfärbung, erhalten wir Antikörper wie folgt. Polyklonalen Antikörper gegen H + /K + - ATPase wurde durch Injektion von Kaninchen Belegzellen-Mikrosomen-Fraktionen in Mäusen [25] erhalten. Kaninchen polyklonalen Antikörper gegen Metallothionein war ein freundliches Geschenk von Dr. Nagamine, Gunma University School of Health Sciences [26]. Wir kauften Antikörper wie folgt: Kaninchen polyklonalen Antikörper gegen TGF α, Kaninchen polyklonalen Antikörper gegen EGF-R, Ziegen polyklonalen Antikörper gegen COX-2, Kaninchen polyklonalen Antikörper gegen NFkB und monoklonalen Maus-Antikörper zu nNOS und iNOS von Santa Cruz Biotech. (Santa Cruz, CA); monoklonalen Maus-Antikörper nuclear antigen (PCNA) von Zymed Lab in proliferative-Zelle. (South San Francisco, CA); Schaf-Antikörper gegen menschliches Pepsinogen II von BioPur AB (Bubendorf, Schweiz), die mit Maus-Pepsinogen reagiert auch; Kaninchen-polyklonalen Antikörpers gegen HSP70 von Stressgen Biotech. (Victoria, BC, Kanada); und Maus-monoklonalen Antikörper gegen Bcl-2 von BD Biosciences (San Diego, CA). Hüllen für Meerrettich-Peroxidase (HRP) -catalyzing immunhistochemische Färbung, zerhackt Mägen wurden für 24 h in 10% neutralisiert Formalin bei 4 ° C fixiert und dann wurde Mikrotom Sektionieren in Paraffin eingebettet. Die entparaffinierten Gewebeschnitte wurden in 3% iger Wasserstoffperoxidlösung rehydratisiert und inkubiert, um endogene Peroxidase-Aktivität zu hemmen. Dann wurden die Schnitte für 30 min mit einem ersten Antikörper oben beschrieben, mit einer geeigneten Verdünnung bei Raumtemperatur inkubiert. Eine sekundäre biotinylierte Antikörper wurde auf der Basis der ersten Antikörper-produzierende Tierspezies ausgewählt ist, und wurde dann mit HRP-konjugiertem Streptavidin verwendet. Die HRP-Reaktion wurde mit 3-Amino-9-Ethyl-Carbazol und Wasserstoffperoxid erfolgt nach den Anweisungen, die mit dem Streptavidin-Biotin-Färbung Vectastatin Elite Kit geliefert (Vektoren Laboratories, Burlingame, CA). Positive Anfärbungen erschien in der Farbe braun.
Für Immunfluoreszenzfärbung, zerhackt Mägen wurden 24 h in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4 bei 4 ° C in 4% Paraformaldehyd fixiert. Kleine Stücke von zerkleinertem Gewebe unterzog Saccharose Ersatz und wurden in OCT-Verbindung in der Vorbereitung für einen Gefrierschnitt mit einem Mikrotom eingebettet. Für die primäre Immunreaktion wurden geschnitten Abschnitte mit einem ersten Antikörper sondiert, und wurden dann inkubiert mit entweder indodicarbocyanide (Cy3) -konjugierte affinitätsgereinigtem Esel-anti-Kaninchen-anti-Maus-IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) oder Fluorescein -Isothiocyanat (FITC) -markiertem anti-Kaninchen-IgG (Jackson ImmunoResearch) als sekundärem Antikörper. Der sekundäre Antikörper IgG wurde der erste Antikörper auf der Basis der Arten, auf denen ausgewählt wurde, erhöht.
In-situ-Nachweis apoptotischer Zellen wurde unter Verwendung des In Situ Apoptosis Detection Kit (TAKARA BIO INC. Tokyo, Japan) durchgeführt. Das Kit enthält eine Desoxyribonukleotidyltransferase-vermittelte Desoxyuridintriphosphat Biotin nick End-Markierung (TUNEL) Testsystem. Stomach Schnitte wurden mit Proteinase K permeabilisiert, und die 3'-OH-Enden der DNA-Fragmente wurden dann mit dem Kit gelieferten nach den Anweisungen gefärbt. Die Kerne dunkelbraun gefärbt wurden als apoptotischen Zellen.
RNA-Analyse
Mägen wurden beschnitten und die Gesamt-RNAs wurden unter Verwendung von TRIzol (Gibco BRL, Tokyo) nach dem Protokoll des Herstellers extrahiert. Für Northern-Blot wurde die Gesamt-RNA auf einem 1,0% Agarosegel elektrophoretisiert und auf eine Nylonmembran (Amersham Pharmacia Biotech, Tokyo) übertragen. Die Hybridisierung wurde mit einer Sonde des humanen TGF α cDNA (917 bp) mit [α- 32P] Desoxy-CTP durchgeführt. Diese Sonde erkennt menschliche TGF α mRNA, aber nicht Maus TGF mRNA.
Maus TGF α mRNA-Ebene wurde mit einem Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) als interne Kontrolle verwendet wird. Die Echtzeit-PCR wurde mit dem ABI Prism 7700 Sequence Detector unter Verwendung und weichen (Applied Biosystems, Foster City, CA) durchgeführt, unter Verwendung der DNA fluoreszierenden Farbstoff SYBR Green Detektion. Primer wurden entworfen, um die Primer Express-Design-Software (Applied Biosystems) verwendet. Das Endergebnis für jede Probe wurde durch den jeweiligen GAPDH Wert normalisiert. Primersequenzen sind wie folgt: Maus-TGF α: 5'-CCTGAGCACCCGAAGAT-3 'und 5'-CCTTCCCTCATGCCTTACT-3'; GAPDH: 5'-GTCGTGGATCTGACGTGCC-3 'und 5'-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3'
Western blot analysis
Gastric Gewebeproben wurden geschnitten und Gesamtprotein aus der Magenschleimhaut wurde in RIPA-Puffer, der einen Cocktail von Protease-Inhibitoren homogenisiert. (Phenylmethylsulfonylfluorid, Pepstatin, Leupeptin und Aprotinin) (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland). Der Überstand wurde auf ein SDS-PAGE-Gel aufgetrennt, und wurde dann auf eine Polyvinylidendifluorid-Membran geblottet. Die Membran wurde mit den folgenden Antikörpern sondiert: Antikörper gegen iNOS, COX-1, COX-2, HSP70 und Bcl-2, die die gleichen, die für die morphologischen Untersuchungen verwendet wurden; Maus monoklonaler Antikörper gegen Bax (Santa Cruz Biotech.); Kaninchen polyklonalen Antikörper gegen Caspase-3 (Santa Cruz Biotech.); und monoklonalen Maus-Antikörper an Aktinfilamente (Santa Cruz Biotech.). Antikörper-Reaktion gebracht Banden wurden erfasst, um ein ECL-Nachweissystem verwendet (Amersham, Buckinghamshire, UK).
Messung von Gastrin
Gastrin Serum wurde unter Verwendung eines Gastrin Radioimmunoassaykits (Gastrin RIA-Kit, Dainabot, Tokyo, Japan). Der Antikörper für Gastrin mit einem Amid-Rest an seinem Carboxy-Terminus spezifisch.
Messung von Prostaglandin E2
der Magenschleimhaut bei 4 ° C in Lysepuffer homogenisiert. Homogenate wurden für 20 min bei 12000 rpm zentrifugiert und die Überstände wurden in Prostaglandin E unterworfen 2-Test ein Prostaglandin E 2 Monoklonale Enzymimmunoassay-Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) unter Verwendung, gemäß den Anweisungen des Herstellers .
Statistische Analyse
die statistische Analyse wurde durch wiederholte Messung der Varianzanalyse (ANOVA) für die Gesamtlänge der Läsionen des Magens durch ungepaarten t-Test für Durchblutung der Magenschleimhaut Abnahme-Verhältnis durchgeführt. Alle Werte sind als Mittelwert ± SE ausgedrückt. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angenommen.
Ergebnisse | Charakterisierung des TGF &alpha-exprimierenden TG Maus Magenschleimhaut
Der Stamm WT CD1 und TGF α Transgen exprimieren Truck MT42 Linie Mäuse wuchsen ähnlich und zeigte keinen spürbaren Unterschied in ihren Eigenschaften, Verhaltensweisen oder Lebensdauern. Die größte Dicke der Magenwand beobachtet und Fundusdrüsen waren 3,50 ± 0,18 mm und 2,33 ± 0,20 mm bzw. in den WT-Mäuse, und 3,85 ± 0,24 mm und 2,63 ± 0,16 mm bzw. in den TG-Mäusen; es gab keine signifikanten Unterschiede in der Form der Magenschleimhäuten und Drüsen zwischen den WT und TG Mäusen. Zusätzlich zu dem normalen Erscheinungsbild der Magenschleimhaut, diese Linie TG Maus auch einen normal erscheine Leber hatte, Pankreas und anderen Organen. Kaufen Wir dann Säuresekretion Kapazität zwischen den WT und TG-Mäusen verglichen. In den WT-Mäusen erhöhte maximale Säure-Ausgang signifikant von Grundniveau von 25 ± 1,4 mmol /h auf 50 ± 5,8 mmol /h nach Pentagastrin Stimulation. Hingegen in den TG-Mäuse erhöhte maximale Säure-Ausgang zu einem geringeren Ausmaß auf 30 ± 5,7 mEq /h aus dem basalen Ausgang von 23 ± 0,7 mEq /h (n = 5 in WT und TG-Mäuse). Die Säure abgestumpft Ausgang kann die reduzierte Belegzellen Masse in der TG-Schleimhaut (Abbildung 1e) zu reflektieren. Abbildung 1: Charakterisierung der TGF &agr; exprimierende TG Schleimhaut. Maßstab in jeder Figur zeigt 100 &mgr; m. (A) Verteilung von TGF α exprimierenden Zellen. Braun gefärbtes TGFa-positive Zellen wurden entlang der luminalen Pitbereichs in der WT mucosa sichtbar, die längliche Becherzellhyperplasie Pitbereich und dem unteren Drittel des Drüsenbereich in der TG-Schleimhaut. (B) Overlap von rot gefärbten TGFa-positive Zellen und grün gefärbte H + /K + -ATPase-positive Belegzellen. Lower TGFa-positiven Zellen in Cluster unterscheiden sich von den grün gefärbten Belegzellen in der TG-Schleimhaut. (C) Northern-Blot von menschlichem TGF- α mRNA und PCR-amplifiziert Maus TGF α mRNA. Menschliche TGF α mRNA wird allein in der TG Schleimhaut ausgedrückt (linkes Bild), aber PCR-amplifizierte Maus TGF α mRNA wird in ähnlicher Weise sowohl in WT und TG Schleimhäuten (rechtes Bild) ausgedrückt. (D) Western-Blot von TGF &alpha Zwischenformen. TGFa Vorläufer (20 kDa) und ihre Zwischenformen werden verstärkt in der TG Schleimhaut sichtbar gemacht als in der Schleimhaut WT. (E) Lokalisierung von EGF-Rezeptor in der Magenschleimhaut. EGF-Rezeptor (EGF-R) wurde mit Cy3 (rot) gefärbt und H + /K + -ATPase wurde mit FITC (grün) gefärbt. EGF-R wurde mäßig im oberen Pit-Bereich und stark in der unteren Drüsenregion in ähnlicher Weise sowohl in der WT und TG Schleimhäuten immunhistochemisch. (F) Verteilung von Metallothionein in der Magenschleimhaut. Metallothionein ist stark in der unteren Drüsenregion und mäßig entlang der Becherzellhyperplasie Region immunhistochemisch. (G) Dehnung der Magengrube der TG Schleimhaut. PCNA-positive Zellen in der oberen dritten Bereich in den Magendrüsen WT verteilt, während sie verteilt sind zahlreich und allgemein in der Mitte Drüsenbereich. (H) PAS-Färbung zeigt längliche pit in der TG-Schleimhaut.
Expression von TGF α Transgen
TGFa-exprimierenden Zelltypen wurden auf die Zelltyp-spezifischen Immunfärbung und deren mukosalen Stelle identifiziert basiert. TGF α wurde Berichten zufolge an den GSM-Zellen in der Magengrube in Menschen [14] und Ratten [15], und entlang der Schleimhaut Hals Zellenbereich in den FVB-Stamm-Mäusen [16] immunogefärbt. In der vorliegenden Studie, braun gefärbtes TGFa-positive Zellen wurden entlang der Becherzellhyperplasie Region sowohl der WT und TG mucosae und entlang der unteren Drüsenbereich des TG mucosa (1a) verteilt sind. Die TGF α positive Zellen entlang der Becherzellhyperplasie Region erschien Magengrube Zellen zu sein, anhand von deren Standort (1b, oberes Feld), und die entlang der unteren Drüsenbereich der TG Schleimhaut nicht mit dem grün gefärbten H überlappen + /K + - ATPase-positive Belegzellen (Abbildung 1b, unteres Bild), aber mit den Pepsin-positiven Hauptzellen hat sich überlappen (Daten nicht gezeigt). Der Antikörper wir für Immunfärbung für TGF &agr; verwendet wird, könnte nicht zwischen Mensch und Maus TGFa unterscheiden, aber seine mRNA-Sonde konnte so für die Northern-Blot-Analyse zu tun. Der menschliche TGF α Transgen wurde in der TG Schleimhaut ausgedrückt, während kein Ausdruck in der WT-Schleimhaut (Abbildung 1c, linke Tafel) festgestellt wurde. Im Gegensatz dazu wurde die endogene Maus TGF α mRNA in ähnlicher Weise sowohl in der WT und TG Schleimhäuten durch Echtzeit-PCR (Abbildung 1c, rechts) ausgedrückt. TGF α ist eine 50-Aminosäuren-Peptid, abgeleitet von seinem 160 Aminosäuretransmembranvorläufer gespalten durch Tumornekrosefaktor-α-umwandelndes Enzym (TACE) [27, 28]. Mit dem Überschuss-Expression des humanen TGF α Transgen in der TG-Schleimhaut, einer etwa 20 kDa TGF- &agr; Vorläufers und dessen Zwischenformen wurden durch Immunoblotting (Figur 1d) erhöht.
Da sowohl der Vorläufer und prozessierten Formen EGF gleich aktiv waren zum Stimulieren -R [28], untersuchten wir ferner EGF-R-Lokalisierung in der Schleimhaut. EGF-R wurde in der unteren Hauptzellenclusterregion und mäßig in der Schleimhaut Hals Zellenbereich und in der Becherzellhyperplasie Pitbereichs in sowohl dem WT und TG mucosae (Figur 1e), die stark lokalisiert, wie zuvor für die Ratten-Magenschleimhaut wurde berichtet [15 ]. Da das TGF α Transgen unter der Maus-Metallothionein-Gen kontrolliert wurde [20] und Metallothionein in der Magenschleimhaut [29], wurde berichtet, wir hergestellt suchte die Metallothionein-exprimierenden Zelltypen in der Schleimhaut. Immunhistochemisch wir festgestellt, Metallothionein Färbung meist entlang der unteren Drüsenregion und streuend entlang der Pit-Bereich der Steuerung CD1-Stamm Magenschleimhaut (Abbildung 1f). Somit ist die Verteilung von TGF α-exprimierenden Zelltypen ähnlich der Metallothionein-exprimierenden Zellen in der TG Magenschleimhaut (1a und 1f).
In der Maus mucosa WT, die H + /K + - ATPase-positive Belegzellen wurden weit über die Drüsen-Region verbreitet mit Ausnahme der oberen-Pit-Schicht, während die H + /K + - ATPase-positive Drüsenregion wurde in der Höhe in der TG reduziert Schleimhaut (Abbildung 1e). Tatsächlich ist der Isthmus an der Basis des Pit-Bereich, der von PCNA-Färbung bestätigt wurde, wurde in die Mitte der TG mucosa (1g) nach unten bewegt. Außerdem waren dicht PCNA-positive Zellen in der Mitte der Schleimhaut verteilt. Konsequent wurde in der TG-Schleimhaut im Gegensatz zu der kurzen Grube in der WT-Schleimhaut (Abbildung 1h) verlängert die PAS-Färbung-positive Becherzellhyperplasie Grube. Somit kann, obwohl die Höhe der Magenschleimhaut zwischen dem WT und TG mucosae ähnlich war, die proliferative Zone wurde nach unten bewegt, und die Becherzellhyperplasie Pitbereichs war gestreckter mit einer reduzierten Drüsenbereich in der TG Mocosa. Da das Wachstum der Grube Zellen stark von Gastrin verstärkt wird [25, 30], verglichen wir die Serum-Gastrin Ebenen zwischen den WT und TG Mäusen, aber keine Erhöhung der Serumspiegel von Gastrin in der TG-Maus gefunden (WT, 213 ± 41 pg /ml;. TG, 263 ± 47 pg /ml, n = 5, p = 0,438)
Ethanol-induzierte Magen verursachte Verletzung im WT und TG Maus mucosae
Eine Sonden Verabreichung von angesäuertem Ethanol (100 ul) hämorrhagischen Verletzungen in der TG-Schleimhaut (2a, links). Histologisch geschält die Verletzung der Grube und Isthmus Regionen ab und erreicht bis zur Mitte des Drüsenbereich (2b, links). Im Gegensatz dazu war diese Art der Verletzung in der TG-Maus Schleimhaut nicht bemerkenswert (2a, rechts). Die Verletzung wurde histologisch beschränkt auf die luminale Pit-Bereich (2b, rechts). In der WT-Schleimhaut erhöht den verletzten Bereich schnell mit einem Peak bei 6 h nach der Verabreichung ethanol, während in der TG Schleimhaut der Bereich langsam und minimal ohne deutlichen Peak (Abbildung 2c) erhöht. Konsequent, durch die TUNEL-Färbung gezeigt apoptotischen Zellen tief in die untere Drüsenbereich 3 h nach der Ethanol-Verabreichung in der WT-Schleimhaut verteilt, während die apoptotischen Zellen in den Pit-Bereich beschränkt waren, sondern auf die Drüsen-Region in der TG-Schleimhaut nicht verlängern ( 2d). Abbildung 2 Magen-Schädigung in der Magenschleimhäuten Ethanol-induzierte. (A) Die makroskopische Ansicht der Magenschleimhaut. Maßstab: 5 mm. Beide Schleimhäuten sind 6 Stunden nach Ethanol Verwaltung. Beachten Sie, dass die Displays WT-Schleimhaut-Läsionen umfangreiche hämorrhagischen, im Gegensatz dazu die TG Schleimhaut nach Ethanol Verwaltung unbeschädigt aussieht. (B) Hämatoxylin und Eosin-Färbung von Ethanol-verletzten WT Schleimhaut (links) und TG Schleimhaut (rechts). Notieren Sie sich die tiefe Geschwürbildung in der WT-Schleimhaut. Maßstab: 100 &mgr; m. (C) Zeitverlauf der Schädigung des Magens Ethanol-induzierten. Verletzten Bereich gegen die Zeit aufgetragen bis zu 12 h nach der Verabreichung ethanol. Jeder Punkt stellt einen Mittelwert von fünf Mäusen. p
< 0,05 (d) TUNEL-Färbung von WT-Schleimhaut (links) und TG Schleimhaut (rechts). Beide Abschnitte sind in Folge auf die in 2B
, respectively. Apoptotischen Zellen sichtbar sind mit dunkelbraunen Kernen. Zahlreiche apoptotische Zellen sind in der WT Schleimhaut festgestellt. Alle Fotos wurden 6 Stunden nach der Ethanol Verwaltung. Maßstab:. 100 &mgr; m
Blutung der Magenschleimhaut in der mit Ethanol behandelten mucosa
Obwohl eine Reihe von zytoprotektive regulatorischen Faktoren berichtet worden, einschließlich NO, CGRP, COX2 und HSP70 [12, 13, 31, 32] , Blutung der Schleimhaut wurde als Hauptfaktor für den Schutz und die Wiederherstellung von Ethanol-induzierten Magen-Schädigung [1, 33] vorgeschlagen. Wir maßen Magenblutung durch eine Sonde des Laser-Doppler-Durchflussmesser auf die Magenschleimhaut über einer freiliegenden Bauchwand in der anästhesierten Maus zugegriffen platzieren. Magenblutung verringerte sich um 43,5 ± 6,37% nach der Ethanol-Verabreichung auf die Magenschleimhaut des WT-Maus (Abbildung 3) gekennzeichnet. Im Gegensatz dazu ist es nur um 17,2 ± 9,21% nach der Ethanol Verabreichung auf der TG mucosa (Figur 3) verringert. Somit wurde der Magendurchblutung auch in der TG mucosa auch nach Ethanolbehandlung gehalten. Da Ischämie mukosalen einer der wichtigsten Faktoren ist ulcerogene [33], wird die Aufrechterhaltung der Durchblutung des Magens erscheinen ein wesentlicher Faktor für Schleimhautschutz sein. Abbildung 3 Beurteilung der Durchblutung der Magenschleimhaut im Magenschleimhäuten. Durchblutung der Magenschleimhaut wurde durch Vergleich der Blutfluss-Verhältnis vor und nach der Ethanol-Behandlung bewertet. Das Verhältnis wurde als Prozent gegenüber dem Blutfluss vor der Behandlung erhalten wird, die viel größer in der WT Schleimhaut war als in der TG-Schleimhaut. * P
< . 0,03
Expression von Proteinen cytoprotective: NO-Synthase, COX-2 und HSP70
Um den Mechanismus der hohen Blutfluss Wartung in der TG Schleimhaut erforschen, untersuchten wir die Expression von NO-Synthasen, die NO aus Arginin macht, und entspannt die glatte Gefäßmuskulatur über cGMP-abhängige Proteinkinase [34]. Es gibt drei Arten von NO-Synthase (NOS): neuronale NOS (nNOS), induzierbare NOS (iNOS) und endotheliale NOS (eNOS). nNOS und eNOS sind konstitutiv exprimiert, während iNOS bei Magen-Schädigung induziert wird [35]. nNOS wurde in ähnlicher Weise auf die PAS-Färbung über den Becherzellhyperplasie Pit-Bereich (Abbildung 1 g) verteilt; es wurde über die längliche Grube der TG Schleimhaut beobachtet und wurde auf die luminale Grube der WT-Schleimhaut (4a) begrenzt. eNOS wurde in ähnlicher Weise über die gesamte Magenschleimhaut schwach gestreute sowohl im WT und TG mucosae (Daten nicht gezeigt). Die iNOS-Färbung war vernachlässigbar in der WT mucosa, obwohl es sehr in der unteren Drüsenbereich induziert wurde, nachdem die Schleimhaut ethanol (4b) ausgesetzt war. In der TG-Schleimhaut wurde iNOS konstitutiv in der unteren Drüsenbereich ausgedrückt ähnlich vor und nach der Verletzung (Abbildung 4b), die zur Aufrechterhaltung eines hohen Blutfluss weiter beizutragen scheint. Figur 4 Immunostaining von NO-Synthasen in der Magenschleimhaut. Maßstab: 100 &mgr; m. (A) nNOS Immunofärbung. nNOS war sichtbar entlang der Pit-Bereich, die sich in ihrer breiteren Verteilung entlang der länglichen Grube in der TG-Schleimhaut. (B) iNOS-Immunfärbung. iNOS wurde im unteren Drüsen Region nach der Ethanol Verletzung in der WT-Schleimhaut induziert, während sie konstitutiv in der gleichen Region der TG Schleimhaut unabhängig von Ethanol Verletzung exprimiert wurde.
Prostaglandine wurden als wichtiger Faktor cytoprotective Vor über drei Jahrzehnten vorgeschlagen [ ,,,0],8] und ihre Rollen intensiv untersucht worden [36, 37]. Die Rolle der Prostaglandin-bildenden Enzyme, COX-1 und COX-2 wurde in der Schleimhaut Schutz gegen gastrischen Reiz umstritten [7, 11, 32]. Wir untersuchten die Expression von COX im WT und TG Schleimhäuten während Ethanol Verletzungen. Die Expression von COX-1 nicht zwischen dem WT und TG mucosae, noch vor oder nach der Schädigung ethanol (5b) unterschieden. COX-2 wurde in der WT-Schleimhaut nicht nachweisbar, aber seine Expression wurde 6 h nach der Verletzung offensichtlich ethanol und dessen Färbung wurde mit dem unteren Drüsen Region lokalisiert (5a und 5b). In der TG-Schleimhaut war der COX-2-Immunfärbung intensiv an der gleichen Region noch vor der Verletzung und blieb positiv nach der Verletzung (Figur 5a). Da COXs in mesenchymalen Zellen, wie Fibroblasten und mononukleären Zellen in der Magenschleimhaut [38] und das Streptavidin /Biotin /HPR Verfahren manchmal falsch-positive Anfärbung zeigt gezeigt wurde, exprimiert zu werden, führten wir Immunofluoreszenzfärbung einen Gefrierschnitt verwendet, die bestätigt, COX-Expression in ähnlicher Weise in der unteren Drüsenbereich der TG mucosa (Daten nicht gezeigt). Durch Immunoblotting, COX-2 erhöht nach der Verletzung in der WT mucosa, während sie hoch in einem ähnlichen Ausmaß erhöht wurde vor und nach der Verletzung (Figur 5b).

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