Integrerende roller transformerende vekstfaktor-α i cytobeskyttelse mekanismer mage mucosal skade

Integrerende roller transformerende vekstfaktor-α i cytobeskyttelse mekanismer mage mucosal skade
Abstract
Bakgrunn
transformerende vekstfaktor α (TGFa) beskytter mot mage mucosal skade og letter sårheling. Imidlertid er dets overekspresjon kjent for å indusere hypertrofisk gastropati likner Menetrier sykdom hos transgene (Tg) mus på en FVB bakgrunn, som en av forfatterne er rapportert tidligere. Vi studerte en annen TGFa-uttrykke musen linje på en CD1 bakgrunn, hvis mageslimhinnen vises normalt. Etter denne TG mus hadde en sterk motstand mot etanol-indusert gastrisk skade, vurderte vi langtidseffekten av TGFa på flere mage beskyttelsesmekanismer.
Methods
TGFa-uttrykkende transgene (TG) mus linjer som bærer human-cDNA TGFa under kontroll av muse-metallothionein-i-gen promotoren ble generert på en CD1 bakgrunn mus, og analyserte deres etanol skadebestandig fenotyper produsert av TGFa.
Resultater
i TG mucosa, ble blodstrømmen godt vedlikeholdt etter ethanol skade . Videre, neurale og induserbare typer av NO synthases var konsekvent og vidt uttrykt i TG slimhinnen, sammenlignet med den begrensede fordeling av nevral typen NO-syntase i luminal grop region av villtype (WT) mucosa. COX-2 og dets oppstrømstranskripsjonsfaktor NFkB ble konstitutivt forhøyet i TG mukosa allerede før administrering ethanol, mens de ble indusert i den samme regionen av WT slimhinne bare etter ethanol skade. To anti-apoptotiske proteiner, HSP70 og BCL-2, ble oppregulert i TG slimhinnen selv før etanol administrasjon, mens de ikke ble uttrykt i WT slimhinnen før skaden. Videre ble pro-kaspase 3 aktiveringen hemmet i TG-mucosa, mens den ble omdannet til aktiv form i WT mucosa følgende etanol administrering.
Konklusjon
Vi konkluderer med at TGFa opprettholder den gastriske slimhinne forsvar mot gastrisk skade etter integrere andre cellebeskyttende mekanismer.
Bakgrunn
etanol har lenge vært brukt til å generere en hemoragisk mage mucosal skade hos gnagere [1]. Ved oral administrering av absolutt eller saltsyre-surgjort etanol, kan omfattende hemoragisk lesjoner fremstilles i mageslimhinnen. Dette eksperimentell mageskade modellen har blitt hyppig brukt for mage mucosal beskyttelse og hvile studier. Faktisk en rekke cellebeskyttende forbindelser har blitt testet for å evaluere sin styrke i å motstå mage skade, inkludert gastrointestinale hormoner, vekstfaktorer, prostaglandiner, bioaktive aminer, og milde irritanter som capsaicin [2-5]. Blant disse forbindelser, epidermal vekstfaktor (EGF) familie vekstfaktorer, særlig transformerende vekstfaktor α (TGFa), har blitt rapportert som potente cytobeskyttende forbindelser mot etanol-, eddik- syre- eller aspirin-indusert gastrisk skade [2, 4].
TGFa ble uttrykt i rotte mageslimhinnen etter oral administrering av surgjort taurocholat eller saltsyre, noe som tyder på sin reparerende rolle i gastrisk skade [6]. TGFa gitt intraperitonealt beskyttet mot etanol-indusert gastrisk skade med en betydelig økning i vedheftende gastrisk mucin i rotter [7]. Den cytobeskyttende funksjon av TGFa syntes å være mediert av aktivering av fosfolipase C-γ1, men ikke av prostaglandiner, og var uavhengig av den anti-sekretoriske virkning av TGFa [7]. På den annen side, prostaglandiner og deres syntetiske enzymet, cyklooksygenase (COX), har lenge vært foreslått som cellebeskyttende faktorer mot gastrisk skade [5, 8]. EGF er vist å uttrykke en induserbar isoform COX, COX-2, i det RGM1 rotte gastrisk mucosal cellelinje gjennom en ERK MAP-kinase pathway [9] og i Swiss 3T3 fibloblasts, spesielt ved ko-stimulering med gastrin [10]. Videre er COX-2 ekspresjon av heparin-bindende EGF-lignende vekstfaktor, et medlem av EGF-familien vekstfaktorene, ble blokkert av en spesifikk EGF-reseptor (EGF-R) inhibitor i rottemageslimhinnen [11]. Således synes den EGF-R-signal for å mediere COX-2-induksjon i mageslimhinnen.
De viktigste cytobeskyttende mekanismer omfatter gastrisk mucosal blodstrømning. EGF og TGFa er blitt vist å utøve cytobeskyttende virkninger via stimulering av capsaicin-sensitive neuroner med frigjøring av kalsitonin gen-relatert peptid (CGRP) og nitrogenoksid (NO) i rotter eksponert for orogastric etanol administrering, noe som resulterer i en økning av gastrisk mucosal blod flyte [11, 12]. I motsetning til dette, Konturek et al. minimert rollen til CGRP-avhengige økning av gastrisk blodstrømmen ved å demonstrere at administreringen av NO-frigjørende aspirin ga beskyttelse mot absolutt etanol-indusert gastrisk skade selv i capsaicin-denerveres rotter, noe som resulterer i oppregulering av varmesjokkprotein 70 (HSP70 ) ekspresjon og dempning av oksidativ skade ved sterk oppregulering av antioksidative gener som sink kobber superoksid dismutase (SOD) og glutationperoksidase [13].
TGFa ble immunofarget hovedsakelig i GSM-dekningsområder langs den gastriske grop i mennesker [14], intensivt i gastrisk mukosal overflate (GSM) celler over proliferative sonen og svakt langs den kjertel område under den proliferative sone i rotter [15], og markert langs den slimete halscellen region i FVB /N stammen mus [16]. På den annen side ble EGF-R immunostained i GSM-cellene som omgir foveolar gropen og slimete nakke celle-regionen til den nedre region kjertel hos mennesker [17]. Hos rotter ble EGF-R lokalisert øverst pit-regionen og i de øverste cellegruppene i bunnen av mage kjertler [15]. Selv TGFa er kjent for å indusere celleproliferasjon i primær-dyrkede rottemageslimhinneceller [18], og hyperplastisk spredning i slimhinnene i TGFa-uttrykkende transgene (Tg) mus [19, 20], fordeling av TGFa og EGF-R- i terminalt differensiert mageslimhinneceller tyder på at TGFa utøver ikke-former funksjoner, inkludert anti-apoptotiske effekter og mage epitelial barriere dannelse i en autokrint /parakrint måte. For eksempel, TGFa hemmet apoptose av en mus gastrisk mucosal cellelinje, GSM06, ved ekspresjon av anti-apoptotiske Bcl-2-familieproteiner gjennom en NF-kB-avhengige reaksjonsveien [21]. Gastrisk apikale og basolateral EGF-R har vist seg å indusere en reduksjon i paracellulære permeabilitet for syre for beskyttelse av kjertelceller i et surt miljø [18, 22]. Dermed utøver TGFa både proliferativ og ikke-former effekter på mage slimhinne funksjoner, og disse ulike TGFa effekter bør revurderes, i hvert fall når det gjelder hvorvidt resultatene er hentet fra korttidsbehandling ved hjelp av kultur cellelinjer eller fra lang- uttrykket ekspresjon ved hjelp av TGFa-transgene-uttrykkende dyr., En tiår siden, en av forfatterne, H. Takagi, genereres TGFa-uttrykk TG mus linjer under kontroll av metallotionein-gen-promotoren, og en av disse linjene (MT100) utstilt hypertrofisk gastropati likner Menetrier sykdom, som på samme måte er vist av andre forskere [19, 20]. I motsetning til dette viste, annen TG linje (MT42) en normal-vises gastrisk mucosa, selv om TGFa transgenet ble uttrykt til en tilsvarende utstrekning på begge TG-linjer [20]. Siden MT42 linje viste en overraskende grad av resistens til etanol-indusert skade på maveslimhinnen, betraktet vi at det kunne være nyttig for å utforske de ikke-proliferative effekter av TGFa slik som mucosal motstand mot skade etanol. I denne studien undersøkte vi de langsiktige effektene av TGFa på etanol-indusert gastrisk skade ved å analysere endringer i cellebeskyttende og anti-apoptotiske regulatoriske forhold, blant annet mage blodstrøm, NO syntase, COX-2, og apoptose-assosierte proteiner slike som HSP70, Bcl-2, og caspase 3.
Methods
TGFa-uttrykkende transgene mus og etanol-indusert gastrisk skade
TGFa-uttrykkende transgene (TG) mus linjer som bærer human TGFa-cDNA under kontroll av mus metallotionein-gen i-promotoren ble samlet på en CD1 bakgrunn eller FVB mus, som tidligere beskrevet [20]. En av de TG linjer, MT100 på en FVB mus bakgrunn, viste hypertrofisk gastropati likner Menetrier sykdom [20], mens den andre linje, MT42 på en CD1 bakgrunn mus, viste en normal-vises gastrisk mucosa. Fenotypen av TGFa-TG mus så ut til å være avhengig av musestammen, fordi både MT100 og MT42 linjer uttrykte et lignende nivå av TGFa transgenet i magen [20]. I denne studien har vi brukt MT42 linje av TGFa-uttrykke TG hannmus og CD1 villtype (WT) hannmus i alderen 6 til 8 uker. Dyrene ble holdt under kontrollert lys (07:00 til 07:00) med mat og vann tilgjengelig ad libitum
.
Musene, veier 30-35 g, ble fastet i 24 timer før forsøket, men fikk fri tilgang til vann. Alle eksperimentelle prosedyrer som påvirker musene ble godkjent av Animal Care og bruk Review Committee i Gunma University. Musene ble så gitt orogastric surgjort etanol (100 ul; 60% etanol i 0,15 mol /l HCI). Tre, seks og tolv timer etter syrnet etanol administrasjon musene ble ofret for evaluering av mage skade- og immunhistokjemiske analyser, og for RNA og protein utvinning for real time PCR, Northern og Western blot analyser.
Fysiologiske studier
utskillelsen av magesyre ble målt som beskrevet tidligere [20, 23]. Kort sagt ble WT og TG-mus fastet i 3 timer og deretter bedøvet med eter. Etter snittet av bukveggen ble pyrolus ligert, og snittet ble sydd. Den magesaft ble samlet 4 t etter pyrolus ligering. For maksimal syreproduksjonen ble syresekresjon stimuleres ved å injisere pentagastrin subkutant (500 ug /kg kroppsvekt). Den magesaft ble titrert med 0,1 N NaOH til pH 7,0 ved hjelp av en microtitrator.
Gastrisk mucosal blodstrømning ble målt med en laser-Doppler strømningsmåler (modell SFA211, Advance Co., Tokyo) ved å plassere en sonde på overflaten av den gastriske slimhinner, som tidligere beskrevet [24]. Strømningssignalet ble overvåket med den MacLab opptak program. Blodstrømmen ble uttrykt relativt til basalnivået.
Morfologiske studier
Tykkelsen av mageslimhinnen ble målt fra den høyeste delen til bunnen av pakkboksen med et mikrometer. Tilsvarende ble mage skader lesjoner målt (bredde og lengde) med et mikrometer for å beregne det skadde området.
For farging, fikk vi antistoffer som følger. Polyklonale antistoff til H + /K + - ATPase ble oppnådd ved å injisere kanin parietalcellen-mikrosomale fraksjoner i mus [25]. Kanin polyklonale antistoff mot metallothionein var en slags gave fra Dr. Nagamine, Gunma University School of Health Sciences [26]. Vi har kjøpt antistoffer som følger: kaninpolyklonalt antistoff til TGFa, kaninpolyklonalt antistoff til EGF-R, geit polyklonalt antistoff til COX-2, kanin polyklonalt antistoff til NFkB, og monoklonalt antistoff fra mus til nNOS og iNOS fra Santa Cruz Biotech. (Santa Cruz, CA); mus monoklonalt antistoff til proliferativ-cell nuclear antigen (PCNA) fra Zymed Lab. (South San Francisco, CA); sau antistoff mot humant pepsinogen II fra biopur AB (Bubendorf, Sveits), som også reagerer på mus pepsinogen; kanin polyklonale antistoff mot HSP70 fra Stressgen Biotech. (Victoria, BC, Canada); og monoklonalt antistoff fra mus til Bcl-2 fra BD Biosciences (San Diego, CA).
For pepperrot-peroksidase (HRP) -catalyzing immunhistokjemisk farging, hakket magene ble fiksert i 10% formalin nøytralisert ved 4 ° C i 24 timer, og ble deretter dyppet i parafin for mikrotom seksjonering. De deparaffinized vevssnitt ble rehydratisert og inkubert i 3% hydrogenperoksid-løsning for å inhibere endogen peroksidaseaktivitet. Deretter ble seksjonene inkubert med et første antistoff som er beskrevet ovenfor med en passende fortynning ved romtemperatur i 30 min. Et sekundært biotinylert antistoff ble valgt basert på de første antistoffproduserende dyrearter, og ble deretter anvendt sammen med HRP-konjugert streptavidin. HRP reaksjonen ble utført med 3-amino-9-etyl-karbazol og hydrogen peroxide i henhold til instruksjonene som følger med streptavidin-biotin flekker Vectastatin Elite Kit (vektorer Laboratories, Burlingame, California). Positive stainings viste brun i fargen.
For immunofluorescerende farging ble hakket mager fiksert i 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffer, pH 7,4 ved 4 ° C i 24 timer. Små biter av hakket vev gikk sakkarose erstatning og ble forankret i oktober-forbindelsen i forberedelse til en frossen seksjon ved hjelp av en mikrotom. For den primære immunologiske reaksjons, ble skiver seksjoner probet med et første antistoff, og ble deretter inkubert enten med indodicarbocyanide (Cy3) -konjugert affinitetsrenset esel-anti-kanin anti-mus-IgG (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA), eller fluorescein isotiocyanat (FITC) -merket anti-kanin-IgG (Jackson Immunoresearch), som et sekundært antistoff. Det sekundære antistoffet IgG ble valgt basert på de artene som det første antistoffet ble hevet.
In situ deteksjon av apoptotiske celler ble utført ved hjelp av In Situ apoptose Detection Kit (TAKARA BIO Tokyo, Japan INC.). Settet inneholder en terminal deoksynukleotidyl-transferase-mediert deoksyuridin trifosfat biotin nick ende-merking (TUNEL) analysesystemet. Mage seksjonene ble permeabilized med proteinase K, og 3'-OH ender av DNA-fragmenter ble deretter farget følge instruksjonene som følger med settet. Kjernene farget mørk brun ble ansett for å være apoptotiske celler.
RNA analyse
magene var trimmet og de totale RNA ble ekstrahert ved bruk av TRIzol (Gibco BRL, Tokyo) i henhold til protokollen fra produsenten. For Northern blot, ble det totale RNA underkastet elektroforese på en 1,0% agarosegel og overført til en nylonmembran (Amersham Pharmacia Biotech, Tokyo). Hybridisering ble utført med en probe av den humane cDNA TGFa (917 bp) merket med [α- 32P] -deoksy-CTP. Denne sonden gjenkjenner humant TGFa-mRNA, men ikke mus TGF mRNA.
Mus TGFa mRNA-nivået ble målt ved anvendelse av en sanntids polymerase kjedereaksjon (PCR) med glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) som en intern kontroll. Den sanntids-PCR ble utført ved anvendelse av ABI Prism 7700 Sequence Detector og myke (Applied Biosystems, Foster City, CA) ved anvendelse av DNA-fluorescerende fargestoff SYBR grønn deteksjon. Primere ble utformet ved hjelp Primer Express design software (Applied Biosystems) den. Det endelige resultat for hver prøve ble normalisert med den respektive verdien GAPDH. Primersekvenser er som følger: mus TGFa: 5'-CCTGAGCACCCGAAGAT-3 'og 5'-CCTTCCCTCATGCCTTACT-3'; GAPDH: 5'-GTCGTGGATCTGACGTGCC-3 'og 5'-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3'
Western blot-analyse
Gastriske vevsprøver ble trimmet og totalt protein fra gastrisk mucosa ble homogenisert i RIPA-buffer inneholdende en cocktail av proteaseinhibitorer. (phenylmethylsulphonyl fluor, pepstatin, leupeptin og aprotinin) (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland). Supernatanten ble separert på en SDS-PAGE-gel, og ble deretter blottet på en membran polyvinylidendifluorid. Membranen ble probet med de følgende antistoffer: antistoffer mot iNOS, COX-1, COX-2, HSP70, og bcl-2, som var de samme som brukes for morfologiske studier; mus monoklonalt antistoff mot Bax (Santa Cruz Biotech.); kanin polyklonale antistoff mot caspase 3 (Santa Cruz Biotech.); og mus monoklonalt antistoff mot aktin filamenter (Santa Cruz Biotech.). Antistoff-omsatt båndene ble detektert ved anvendelse av en ECL deteksjonssystem (Amersham, Buckinghamshire, UK).
Måling av gastrin
Serum gastrin ble målt ved anvendelse av en gastrin radioimmunoassaysett (gastrin RIA kit, Dainabot, Tokyo, Japan). Antistoffet er spesifikk for gastrin med en amidgruppen ved sin karboksylterminalen.
Måling av Prostaglandin E2
mageslimhinnen ble homogenisert ved 4 ° C i lyseringsbuffer. Homogenatene ble sentrifugert ved 12000 rpm i 20 minutter, og supernatantene ble utsatt for prostaglandin E 2-assay ved å bruke en Prostaglandin E 2 Monoklonalt enzymimmunanalysesett (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), i henhold til produsentens instruksjon .
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved gjentatt måling variansanalyser (ANOVA) for den totale lengden av de gastriske lesjoner ved uparet t-test for gastrisk mucosal blodstrømning reduksjon forhold. Alle verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SE. P < 0,05 ble akseptert som statistisk signifikant
. Resultater
Karakterisering av TGFa-uttrykke TG mus mageslimhinnen
WT CD1 belastning og TGFa-transgen uttrykker MT42 linje mus vokste på samme måte, og viste ingen merkbar forskjell i sine funksjoner, atferd, eller lifespans. Den største tykkelse observert for den gastriske vegg og fundisk kjertlene var 3,50 ± 0,18 mm og 2,33 ± 0,20 mm, henholdsvis i WT mus, og 3,85 ± 0,24 mm og 2,63 ± 0,16 mm, henholdsvis i TG-mus; Det var ingen signifikante forskjeller i formen av de gastriske slimhinner og kjertler mellom WT og TG mus. I tillegg til den normale utseende av gastrisk mucosa, denne TG mus linje hadde også en normal-vises leveren, bukspyttkjertelen, og andre organer.
Vi deretter sammenlignet syresekresjon kapasitet mellom WT og TG mus. I WT mus, økte maksimal syreproduksjon betydelig fra basalnivå på 25 ± 1,4 mmol /h til 50 ± 5,8 mekv /t etter stimulering pentagastrin. I motsetning til dette, i TG mus, økte maksimal syreproduksjon i en mindre grad til 30 ± 5.7 mmol /h fra den basale utgangen fra 23 ± 0,7 mmol /h (n = 5 i WT og TG mus). Den avstumpet syreproduksjonen kan gjenspeile den reduserte parietalcellenes masse i TG slimhinnen (figur 1e). Figur 1 Karakterisering av det TGFa-uttrykk TG mucosa. Skala i hver figur viser 100 mikrometer. (A) Fordeling av TGFa-uttrykkende celler. Brunfarget TGFa-positive celler var synlige langs den luminale grop region i WT mucosa, den langstrakte foveolar gropen region, og den nedre en-tredjedel av kjertelregionen i TG mucosa. (B) Overlapping av rød-farget TGFa-positive celler og grønnfarget H + /K + -ATPase-positive parietalceller. Lavere TGFa-positive celler i gruppen er forskjellig fra den grønn-farget parietalceller i TG mucosa. (C) Northern blot av mRNA human TGFa og PCR-amplifisert mus TGFa mRNA. Humant TGFa mRNA er uttrykt i TG slimhinnen alene (venstre panel), men PCR-amplifisert mus TGFa mRNA er uttrykt på samme måte i begge WT og TG slimhinner (høyre panel). (D) Western blot av TGFa mellomformer. TGFa-forløper (20 kDa) og dens mellomformer er visualisert mer intensivt i TG-mucosa enn i WT mucosa. (E) lokalisering av EGF reseptoren i mageslimhinnen. EGF-reseptoren (EGF-R) ble farget med Cy3 (rød) og H + /K + -ATPase ble farget med FITC (grønn). EGF-R ble immunofarget moderat i det øvre område gropen og sterkt i den nedre kjertel region på samme måte i både WT og TG slimhinner. (F) Fordeling av metallothioneinet i mageslimhinnen. Metallothionein er immunostained sterkt i den nedre kjertel region, og moderat langs foveolar regionen. (G) Forlengelse av gastrisk gropen av TG-mucosa. PCNA-positive celler er fordelt på øvre tredjedel regionen i WT mage kjertler, mens de er fordelt mer numerously og bredt i midten kjertel regionen. (H) PAS farging viser avlang grop i TG slimhinnen.
Uttrykk av TGFa transgen
TGFa-uttrykker celletyper ble identifisert basert på celle-type-spesifikk farging og deres slimhinnene plassering. TGFa ble angivelig immunostained langs GSM celler i mage pit hos mennesker [14] og rotter [15], og langs den slimete hals cellen region i FVB strekk mus [16]. I den foreliggende studien ble brunfarget TGFa-positive celler fordelt langs foveolar område av både WT og TG slimhinner, og langs den nedre kjertelområdet av TG slimhinnen (Figur 1a). De TGFa-positive celler langs foveolar region som syntes å være gastriske gropen celler, basert etter deres plassering (figur 1b, øvre panel), og de som er langs den nedre kjertelområdet av TG mucosa ikke overlapper med den grønn-farget H + /K + - ATPase-positive parietalceller (Figur 1b, nedre panel), men fikk overlapper med pepsinogen-positive sjef celler (data ikke vist). Antistoffet vi brukte for farging for TGFa ikke kunne skille mellom menneske og mus TGFa, men dens mRNA sonde kunne gjøre det for Northern blot analyse. Den menneskelige TGFa-transgenet ble uttrykt i TG slimhinnene mens ingen uttrykk ble notert i WT slimhinnen (figur 1c, venstre panel). I motsetning til dette ble endogen mus TGFa mRNA likeledes uttrykt i både WT og TG slimhinner ved sanntids-PCR (figur 1c, høyre panel). TGFa er et 50 aminosyrepeptid avledet fra den 160 aminosyre membran-dekkende forløper spaltes av tumor nekrose faktor-α-omdannende enzym (TACE) [27, 28]. Med overskudd ekspresjon av det humane TGFa-transgenet i TG mucosa, en tilnærmet 20 kDa TGFa-forløperen og dens mellomformer ble øket ved immunblotting (figur 1d).
Siden både forløperen og bearbeidede former var like aktive for stimulering av EGF R [28], vi videre undersøkt EGF-R lokalisering i slimhinnen. EGF-R var lokalisert tungt i den nedre sjefscelleklase region og moderat i den mukøse halscellen region og i foveolar grop region i både WT og TG slimhinner (figur 1E), som ble rapportert tidligere for rottemageslimhinnen [15 ]. Siden TGFa transgenet ble regulert under musemetallotionein-genet [20] og metallothionein ble angivelig fremstilt i mageslimhinnen [29], undersøkte vi metalltioneinsystemene-uttrykkende celletyper i slimhinnen. Immunhistokjemisk, noterte vi metallothionein farging stort sett langs den nedre kjertelområdet og scatteringly langs gropen regionen av styre CD1-stamme mageslimhinne (figur 1f). Således,-uttrykk TGFa celletyper er fordelingen av lik den til metallotionein-uttrykkende celler i TG gastriske slimhinne (figurene 1a og 1f).
I WT mus mucosa, H + /K + - ATPase-positive parietalceller ble spredt over hele kjertel regionen med unntak av topp-pit lag, mens H + /K + - ATPase-positive kjertel regionen ble redusert i høyden i TG slimhinnen (figur 1e). Faktisk, eidet ved bunnen av gropen-regionen, noe som ble bekreftet av PCNA-farging, ble flyttet ned til midten av TG slimhinnen (figur 1 g). Videre PCNA-positive celler ble tett fordelt i midten av slimhinnen. Konsekvent, ble det PAS-farging-positive foveolar grop langstrakt i TG mucosa i motsetning til den korte grop i WT slimhinnen (figur 1 H). Således, selv om høyden på mageslimhinnen var lik WT og TG slimhinner, ble den proliferative sonen beveget seg ned og den foveolar gropen regionen var mer langstrakt med en redusert kjertel region i TG mocosa. Etter veksten av gropen celler er sterkt forbedret med gastrin [25, 30], har vi sammenlignet serumgastrinnivåene mellom WT og TG-mus, men fant ingen økning i nivåene av serum-gastrin i TG-mus (WT, 213 ± 41 pg /ml;. TG, 263 ± 47 pg /ml, n = 5, p = 0,438)
etanol-indusert gastrisk skade i WT og TG mus slimhinner
Orogastric administrering av surgjort etanol (100 ul) forårsaket hemoragisk skade på TG slimhinnen (figur 2a, venstre). Histologisk skaden skrelles av pit og Isthmus regioner og nådde til midten av kjertel regionen (figur 2b, venstre). I kontrast til denne typen skade på TG mus slimhinnen var ikke merkbar (figur 2a, høyre). Skaden ble histologisk begrenset til luminal pit regionen (figur 2b, høyre). I WT mucosa, økte den skadde området hurtig med en topp ved 6 timer etter administrering etanol, mens i TG mucosa området økes langsomt og minimalt uten en markert topp (figur 2c). Konsekvent, apoptotiske celler vist ved tunel farging distribuert dypt til nedre kjertel region 3 t etter etanol administrasjonen i WT slimhinner, mens apoptotiske celler ble begrenset til pit regionen, men ikke strekker til kjertel regionen i TG slimhinnen ( Figur 2d). Figur 2 Etanol gastrisk skade i mage slimhinner. (A) Makroskopisk riss av mageslimhinnen. Skala: 5 mm. Begge slimhinner er 6 timer etter etanol administrasjon. Legg merke til at WT mucosa viser omfattende hemoragisk lesjoner, i motsetning til dette ser TG slimhinne uskadet etter administrering etanol. (B) Hematoxylin og eosin farging av etanol-skadde WT slimhinnen (til venstre) og TG slimhinnen (til høyre). Legg merke til den dype sår dannelse i WT mucosa. Scale: 100 mikrometer. (C) Tidsforløp av etanol-indusert gastrisk skade. Skadde området er plottet mot tiden opptil 12 timer etter at etanol administrasjon. Hvert punkt representerer et gjennomsnitt av fem mus. p
< 0.05 (d) TUNEL farging av WT slimhinnen (til venstre) og TG slimhinnen (til høyre). Begge deler er i rekkefølge de i 2B
, henholdsvis. Apoptotiske celler er synlige med mørkebrune kjerner. Mange apoptotiske celler, er oppført i WT slimhinnen. Alle bildene var 6 timer etter etanol administrasjon. Scale. 100 mikrometer
Gastric mucosal blodstrømmen i etanol-behandlede slimhinnen
Selv om en rekke cellebeskyttende regulatoriske forhold er rapportert, inkludert NO, CGRP, COX2, og HSP70 [12, 13, 31, 32] , mucosal blodstrømning har vært foreslått som en primær faktor for beskyttelse og restitusjon av etanol-indusert gastrisk skade [1, 33]. Vi målte gastrisk blodstrømmen ved å plassere en sonde av den laser Doppler strømningsmåleren på gastrisk mucosa tilgjengelig via en eksponert bukveggen hos bedøvet mus. Gastrisk blodstrømmen redusert markert med 43,5 ± 6,37% etter etanolen administrering på gastrisk mucosa av WT mus (figur 3). I motsetning til dette, det bare er redusert med 17,2 ± 9,21% etter etanolen administrering på TG slimhinnen (figur 3). Således gastrisk blodstrøm ble godt opprettholdt i TG-mucosa, selv etter etanolbehandling. Siden slimhinne iskemi er en av de viktigste faktorene ulcerogene [33], tillater opprettholdelse av gastrisk blodstrømmen ser ut til å være en viktig faktor for mukosal beskyttelse. Figur 3 Vurdering av mage mucosal blodstrømmen i mage slimhinner. Gastrisk mucosal blodstrøm ble bestemt ved å sammenligne blodstrømningsforholdet før og etter etanolbehandling. Forholdet ble erholdt som en prosent i forhold til blodstrømmen før behandlingen, som var mye større i WT mucosa enn i TG mucosa. * P
< . 0,03
Uttrykk av cellebeskyttende proteiner: NO syntase, COX-2, og HSP70
å utforske mekanismen for høy blodstrøm vedlikehold i TG slimhinnen, undersøkte vi uttrykket av NO synthases, som gjør NO fra arginin, og slapper vaskulær glatt muskulatur via cGMP-avhengig proteinkinase [34]. Det finnes tre typer NO-syntase (NOS): neural NOS (nNOS), induserbare NOS (iNOS) og endotel NOS (eNOS). nNOS og eNOS blir konstitutivt uttrykt, mens iNOS er indusert ved gastrisk skade [35]. nNOS ble distribuert på samme måte som PAS-farging over foveolar pit regionen (figur 1 g); Det ble observert over det langstrakte gropen av TG-mukosa og var begrenset til den luminale gropen av WT slimhinnen (figur 4a). eNOS ble svakt spredt over hele den gastriske slimhinne på samme måte i både WT og TG slimhinner (data ikke vist). Den iNOS farging var ubetydelig i WT mucosa, selv om det var sterkt indusert i den nedre kjertel regionen etter mukosa ble utsatt for etanol (figur 4b). I TG mucosa, ble iNOS konstitutivt uttrykt i den nedre kjertel region på samme måte før og etter skaden (figur 4b), som synes å bidra ytterligere til opprettholdelse av høye blodstrøm. Figur 4 Farging av NO synthases i mageslimhinnen. Scale: 100 mikrometer. (A) nNOS immunfarging. nNOS var synlig langs pit-regionen, noe som resulterer i sin bredere distribusjon langs den langstrakte grop i TG slimhinnen. (B) iNOS farging. iNOS ble indusert i den nedre kjertel regionen etter etanol skader i WT slimhinnen, mens det ble uttrykt konstitutivt i samme region av TG-mucosa uavhengig av etanol skade.
Prostaglandiner ble foreslått som en viktig faktor cytobeskyttende over tre tiår siden [ ,,,0],8] og deres roller har blitt grundig studert [36, 37]. Rollen til prostaglandin dannende enzymer, COX-1 og COX-2, har vært omstridt i slimhinne beskyttelse mot mave irritanter [7, 11, 32]. Vi undersøkte uttrykk for COX i WT og TG slimhinner i løpet av etanol skade. Ekspresjon av COX-1 var ikke forskjellig mellom de WT og TG slimhinner, eller før eller etter etanolen skade (figur 5b). COX-2 ikke var detekterbar i WT mucosa, men dens ekspresjon ble tydelig 6 timer etter skade etanol, og dens farging ble lokalisert til det nedre kjertelområdet (figur 5a og 5b). I TG mucosa, COX-2-farging var intens på samme region selv før skaden og forble positiv etter skaden (figur 5a). Siden Coxs er blitt vist å bli uttrykt i mesenchymale celler så som fibroblaster og mononukleære celler i mageslimhinnen [38], og den streptoavidin /biotin /HPR fremgangsmåte noen ganger presenterer falsk-positiv farging, utførte vi immunofluorescerende farging ved hjelp av et frosset seksjon som bekreftet COX uttrykk på samme måte i den nedre kjertelområdet av TG slimhinnen (data ikke vist). Ved immunoblotting, økt COX-2 etter skaden i WT slimhinnen, mens det var sterkt forhøyet til en tilsvarende grad før og etter skaden (figur 5b). Konsekvent, prostaglandin E 2 nivåer var signifikant høyere i TG slimhinner enn i WT slimhinnen (figur 5c).

• Genomsekvens av Helicobacter suis støtter sin rolle i mage pathology
• Oppregulering av CLDN1 i magekreft er korrelert med redusert survival