ruoli integrativi di fattore di crescita trasformante-α nei meccanismi citoprotezione di lesioni della mucosa gastrica

ruoli integrativi di fattore di crescita trasformante-α nei meccanismi citoprotezione di lesioni della mucosa gastrica
Abstract
sfondo
Trasformare α fattore di crescita (TGFα) protegge contro le lesioni della mucosa gastrica e facilita la guarigione delle ferite. Tuttavia, la sua sovraespressione è nota per indurre gastropatia ipertrofica simile gastrite ipertrofica gigante in transgenici (TG) topi su uno sfondo FVB, come uno degli autori segnalati in precedenza. Abbiamo studiato un'altra linea TGFα esprimono mouse su uno sfondo CD1, la cui mucosa gastrica appare normale. Dal momento che questo mouse TG ha avuto una forte resistenza al danno gastrico etanolo-indotta, abbiamo considerato l'effetto a lungo termine di TGFα su diversi meccanismi di protezione gastrica.
Metodi
TGFα esprimono transgenici (TG) linee del mouse portanti umana TGFα cDNA sotto il controllo del mouse metallothionein gene I promotori sono stati generati da un mouse sfondo CD1, e analizzati i loro etanolo fenotipi lesioni resistenti prodotte da TGFα.
risultati
in mucosa TG, il flusso di sangue era ben tenuta dopo l'infortunio di etanolo . Inoltre, tipi neurali e inducibili di NO sintasi sono stati costantemente e ampiamente espressi nella mucosa TG, rispetto alla distribuzione limitata di tipo neurale NO sintasi nella regione luminale pozzo della mucosa wild-type (WT). COX-2 e le sue trascrizione monte NFKB fattore stati costitutivamente elevati nella mucosa TG ancor prima della somministrazione di etanolo, mentre erano stati indotti nella stessa regione della mucosa WT solo dopo lesioni etanolo. Due proteine ​​anti-apoptotiche, HSP70 e Bcl-2, sono stati upregulated nella mucosa TG ancor prima della somministrazione di etanolo, mentre non sono stati espressi nella mucosa WT prima del trauma. Inoltre, pro-caspasi 3 di attivazione è stato inibito nella mucosa TG, mentre è stato convertito nella forma attiva nella mucosa WT a seguito della somministrazione di etanolo.
Conclusione
Concludiamo che TGFα mantiene la difesa della mucosa gastrica contro le lesioni gastriche da l'integrazione di altri meccanismi citoprotettivi.
Sfondo
L'etanolo è stato a lungo utilizzato per generare un emorragica lesioni della mucosa gastrica nei roditori [1]. Con la somministrazione orale di etanolo acido acidificato assoluto o cloridrico, estese lesioni emorragiche possono essere prodotti nella mucosa gastrica. Questo modello di lesione gastrica sperimentale è stato spesso utilizzato per gli studi gastrici protezione della mucosa e restituzione. Infatti, alcuni composti citoprotettive sono stati testati per valutare la loro potenza nel resistere lesioni gastriche, inclusi ormoni gastrointestinali, fattori di crescita, prostaglandine, ammine bioattive, e irritanti lievi come capsaicina [2-5]. Tra questi composti, fattore di crescita epidermico (EGF) fattori di crescita della famiglia, in particolare trasformando α fattore di crescita (TGFα), sono stati segnalati come composti potenti citoprotettivi contro etanolo, acido acetico o lesioni gastriche aspirina-indotta [2, 4].
TGFα stato espresso nel ratto mucosa gastrica dopo somministrazione orale di taurocolato acidificato o acido cloridrico, suggerendo il suo ruolo riparativa lesioni gastriche [6]. TGFα somministrato per via intraperitoneale protetto contro le lesioni gastriche etanolo-indotta con un aumento significativo aderente mucina gastrica nel ratto [7]. La funzione citoprotettivo di TGFα sembrava essere mediata dall'attivazione della fosfolipasi C-γ1, ma non da prostaglandine, ed è indipendente l'effetto anti-secretoria TGFα [7]. D'altra parte, prostaglandine e loro enzima sintetico, cicloossigenasi (COX), hanno a lungo stati proposti come fattori citoprotettivo contro lesioni gastriche [5, 8]. EGF ha dimostrato di esprimere una isoforma inducibile COX, COX-2, nella linea di cellule della mucosa gastrica RGM1 ratto attraverso un ERK MAP chinasi [9], in fibloblasts Swiss 3T3, in particolare mediante co-stimolazione con gastrina [10]. Inoltre, COX-2 per il fattore di crescita EGF-simile eparina vincolante, un membro dei fattori di crescita della famiglia EGF, è stato bloccato da uno specifico recettore EGF (EGF-R) inibitore nel ratto mucosa gastrica [11]. Così, il segnale EGF-R appare di mediare COX-2 induzione nella mucosa gastrica.
I più importanti meccanismi citoprotettivi includono gastrica flusso di sangue della mucosa. EGF e TGFα hanno dimostrato di esercitare effetti citoprotettivi attraverso la stimolazione dei neuroni capsaicina sensibili con il rilascio di calcitonina peptide correlato al gene (CGRP) e l'ossido nitrico (NO) in ratti esposti a somministrazione di etanolo orogastrico, con un conseguente aumento nel sangue della mucosa gastrica flusso [11, 12]. Al contrario, Konturek et al. minimizzato il ruolo dell'aumento di CGRP-dipendente del flusso sanguigno gastrica, dimostrando che la somministrazione di NO-releasing aspirina protezione offerta contro le lesioni gastriche assoluto etanolo-indotta anche nei ratti capsaicina-denervato, con conseguente up-regolazione di shock termico proteina 70 (HSP70 ) espressione e attenuazione del danno ossidativo da una forte up-regolazione di geni antiossidanti come il rame zinco superossido dismutasi (SOD) e glutatione perossidasi [13].
TGFα stato immunostained prevalentemente celle GSM lungo la fossa gastrica negli esseri umani [14], intensamente mucosa gastrica superficie (GSM) cellule sulla zona proliferativa e debolmente lungo la regione ghiandolare sotto la zona proliferativa in ratti [15], e segnatamente lungo la regione mucosa cellule collo nei topi ceppo FVB /N [16]. D'altra parte, EGF-R è stata immunostained in celle GSM rivestimento fossa foveolar e mucose regione cellule collo alla regione ghiandolare inferiore nell'uomo [17]. Nei ratti, EGF-R è stato localizzato in corrispondenza della zona superiore pit e nei gruppi di cellule principali al fondo delle ghiandole gastriche [15]. Sebbene TGFα è nota per indurre la proliferazione cellulare in primaria-coltura ratto cellule della mucosa gastrica [18], e la proliferazione iperplastica nella mucosa sul transgenico TGFα esprimono (TG) topo [19, 20], la distribuzione di TGFα e EGF-R in cellule della mucosa gastrica terminalmente differenziate suggerisce che TGFα esercita funzioni non proliferative compresi gli effetti anti-apoptotici e la formazione di barriera epiteliale gastrica in modo autocrino /paracrino. Ad esempio, TGFα inibito l'apoptosi di una linea di cellule della mucosa gastrica mouse, GSM06, esprimendo anti-apoptotici Bcl-2 proteine ​​della famiglia attraverso un percorso di NF-kB-dipendente [21]. Gastrica apicale e basolaterale EGF-R ha mostrato di indurre una diminuzione della permeabilità paracellular all'acido per la protezione delle cellule ghiandolari in un ambiente acido [18, 22]. Così, TGFα esercita entrambi gli effetti proliferativi e non proliferativa sulle funzioni della mucosa gastrica, e questi diversi effetti TGFα dovrebbe essere rivalutato, almeno in termini di se i loro risultati sono derivati ​​da un trattamento a breve termine utilizzando linee cellulari cultura o da lungo espressione termine utilizzando TGFα-transgene che esprimono animali.
un decennio fa, uno degli autori, H. Takagi, generato TGFα esprimono linee di topi TG sotto il controllo del promotore del gene metallotioneina, e una di queste linee (MT100) iN MOSTRA gastropatia ipertrofica che assomiglia morbo di Menetrier, come allo stesso modo indicato da altri ricercatori [19, 20]. Al contrario, un'altra linea TG (MT42) appare una mucosa gastrica aspetto normale, anche se TGFα transgene è stato espresso in misura simile in entrambe le linee TG [20]. Poiché la linea MT42 visualizzato un sorprendente livello di resistenza al danno indotto dall'etanolo alla mucosa gastrica, abbiamo considerato che potrebbe essere utile per esplorare gli effetti non-proliferative TGFα come la resistenza al danno mucosale etanolo. In questo studio, abbiamo studiato gli effetti a lungo termine di TGFα sul pregiudizio gastrica etanolo-indotta dai cambiamenti analizzando in fattori di regolazione citoprotettive ed anti-apoptotici, incluso il flusso gastrico di sangue, NO sintetasi, COX-2, e le proteine ​​apoptosi associate tali come HSP70, Bcl-2, e caspasi 3.
Metodi
TGFα esprimenti topo transgenico e lesioni gastriche etanolo-indotta
TGFα esprimono transgenici (TG) linee del mouse portanti umano TGFα cDNA sotto il controllo del topo gene metallotioneina I promotori sono stati generati su una CD1 o sfondo FVB del mouse, come descritto in precedenza [20]. Una delle linee TG, MT100 su uno sfondo FVB mouse, visualizzato gastropatia ipertrofica assomiglia morbo di Menetrier [20], mentre l'altra linea, MT42 su un mouse sfondo CD1, visualizzata una mucosa gastrica aspetto normale. Il fenotipo del topo TGFα-TG sembrava dipendere dal ceppo di topi, perché sia ​​la MT100 e MT42 linee espresso un livello simile del transgene TGFα nello stomaco [20]. Nel presente studio, abbiamo utilizzato la linea MT42 di TGFα esprimono topi maschi TG e CD1 wild type (WT) topi maschi in età da 6 a 8 settimane. Gli animali sono stati mantenuti in luce controllata (7:00-07:00), con cibo e acqua fornita ad libitum
.
I topi, del peso di 30-35 g, sono stati tenuti a digiuno per 24 ore prima dell'esperimento, ma sono stati autorizzati libero accesso all'acqua. Tutte le procedure sperimentali che interessano i topi sono stati approvati dalla cura degli animali e Usa Review Committee presso l'Università di Gunma. I topi sono stati poi dato etanolo acidificato orogastrico (100 pl; 60% di etanolo in 0,15 mol /L HCl). Tre, sei e dodici ore dopo la somministrazione di etanolo acidificato i topi sono stati sacrificati per la valutazione del danno e immunoistochimica analisi gastrici, e per l'RNA e l'estrazione di proteine ​​per real time PCR, Northern e Western Blot analisi.
Studi fisiologici
secrezione acida gastrica è stata misurata come precedentemente descritto [20, 23]. In breve, i topi WT e TG sono stati tenuti a digiuno per 3 ore e poi anestetizzati con etere. Dopo l'incisione della parete addominale, la pyrolus stato ligato, e l'incisione è stata suturata. Il fluido gastrico è stato raccolto 4 h dopo la legatura pyrolus. Per l'uscita di acido massima, la secrezione acida è stata stimolata iniettando pentagastrina per via sottocutanea (500 mg /kg di peso corporeo). Il fluido gastrico è stato titolato con NaOH 0,1 N fino a pH 7,0 utilizzando una microtitrator.
Gastrica flusso ematico della mucosa è stata misurata con un flussometro laser Doppler (modello SFA211, Advance Co., Tokyo) ponendo una sonda sulla superficie gastrica mucosa, come precedentemente descritto [24]. Il segnale di flusso è stato monitorato con il programma di registrazione MacLab. Il flusso di sangue è stato espresso rispetto al livello basale.
Studi morfologici
Lo spessore della mucosa gastrica è stata misurata dalla parte più alta al fondo della ghiandola con un micrometro. Analogamente, le lesioni lesioni gastriche sono stati misurati (larghezza e longitudine) con un micrometro per calcolare l'area danneggiata.
Per immunostaining, abbiamo ottenuto anticorpi come segue. anticorpo policlonale per H + /K + - ATPasi è stato ottenuto iniettando frazioni cellulari microsomiali-coniglio parietali in topi [25]. Coniglio anticorpo policlonale di metallotioneina è stato un gentile dono del Dr. Nagamine, Gunma Scuola University of Health Sciences [26]. Abbiamo acquistato anticorpi come segue: coniglio anticorpo policlonale di TGFα, coniglio anticorpo policlonale di EGF-R, capra policlonale anticorpi per COX-2, coniglio policlonale anticorpi a NFκB, e anticorpo monoclonale murino di nNOS e iNOS da Santa Cruz Biotech. (Santa Cruz, CA); il mouse anticorpo monoclonale proliferativo delle cellule antigene nucleare (PCNA) da Zymed Lab. (South San Francisco, CA); anticorpo pecore Pepsinogeno II da Biopur AB (Bubendorf, Svizzera), che reagisce anche a pepsinogeno del mouse; policlonale di coniglio anticorpo anti HSP70 da Stressgen Biotech. (Victoria, BC, Canada); e il mouse anticorpo monoclonale di Bcl-2 da BD Biosciences (San Diego, CA). Compra di perossidasi di rafano (HRP) -catalyzing colorazione immunoistochimica, stomaci tritati sono stati fissati in formalina al 10% neutralizzato a 4 ° C per 24 ore, e è stato poi inclusi in paraffina per sezionamento microtomo. Le sezioni di tessuto deparaffinate sono state reidratate e incubate in soluzione di perossido di idrogeno al 3% di inibire l'attività della perossidasi endogena. Poi le sezioni sono state incubate con un primo anticorpo descritto con un'appropriata diluizione a temperatura ambiente per 30 min. Un anticorpo secondario biotinilato è stato selezionato sulla base delle prime specie animali produttrici di anticorpi, ed è stato poi utilizzato con streptavidina HRP-coniugato. La reazione HRP è stata eseguita con 3-ammino-9-etil-carbazolo e perossido di idrogeno in base alle istruzioni fornite con il kit Elite Vectastatin streptavidina-biotina colorazione (vettori Laboratories, Burlingame, CA). colorazioni positivi apparsi colore marrone.
Per immunofluorescenza, stomaci tritati sono stati fissati in paraformaldeide al 4% in tampone fosfato 0,1 M, pH 7,4 a 4 ° C per 24 h. Piccoli pezzi di tessuto tritato sottoposti sostituzione saccarosio e sono stati incorporati in OCT-compound in preparazione per una sezione congelata utilizzando un microtomo. Per il immunoreazione primaria, sezioni fette stati sondati con un primo anticorpo, e sono state poi incubate sia con indodicarbocyanide (Cy3) coniugata purificate per affinità asino anti-coniglio anti-IgG di topo (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), o fluoresceina isotiocianato (FITC) -labeled anti-IgG di coniglio (Jackson ImmunoResearch), come anticorpo secondario. L'IgG anticorpo secondario è stato selezionato sulla base della specie in cui è stato sollevato il primo anticorpo.
In rilevazione in situ di cellule apoptotiche è stata eseguita utilizzando il In Situ Apoptosis Detection Kit (Takara Bio INC. Tokyo, Giappone). Il kit contiene un sistema di analisi del terminale deossinucleotidil transferasi-mediata deossiuridina trifosfato biotina nick end-etichettatura (TUNEL). sezioni di stomaco sono state permeabilizzate con proteinasi K, e il 3'-OH estremità del DNA frammenti sono stati poi colorati seguendo le istruzioni fornite con il kit. I nuclei macchiati marrone scuro sono stati considerati cellule apoptotiche.
RNA analisi
stomaci sono stati tagliati e gli RNA totali sono stati estratti utilizzando TRIzol (Gibco BRL, Tokyo) secondo il protocollo fornito dal produttore. Per Northern blot, l'RNA totale è stato elettroforesi su un gel di agarosio 1,0% ed è stato trasferito ad una membrana di nylon (Amersham Pharmacia Biotech, Tokyo). L'ibridazione è stata eseguita con una sonda della umana TGFα cDNA (917 bp) marcato con [α- 32P] deossi-CTP. Questa sonda riconosce umana TGFα mRNA, ma non il mouse livello di TGF mRNA.
Mouse TGFα mRNA è stata misurata utilizzando una reazione in tempo reale a catena della polimerasi (PCR) con gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) come controllo interno. La PCR in tempo reale è stata effettuata utilizzando l'ABI Prism 7700 Sequence Detector e molli (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizzando la fluorescenza del DNA colorante SYBR rilevamento Verde. I primer sono stati progettati utilizzando il software di progettazione Primer Express (Applied Biosystems). Il risultato finale per ciascun campione è stata normalizzata dal rispettivo valore GAPDH. sequenze primer sono le seguenti: topo TGFα: 5'-CCTGAGCACCCGAAGAT-3 'e 5'-CCTTCCCTCATGCCTTACT-3'; GAPDH: 5'-GTCGTGGATCTGACGTGCC-3 'e 5'-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3'
analisi Western Blot
campioni di tessuto gastrico sono stati tagliati e proteine ​​totali dalla mucosa gastrica è stato omogeneizzato in tampone RIPA contenente un cocktail di inibitori delle proteasi. (fenilmetilsolfonilfluoruro, pepstatina, leupeptina, e aprotinina) (Roche Diagnostics, Mannheim, Germania). Il surnatante è stato separato su un gel SDS-PAGE, e venne poi cancellato ad una membrana di polivinilidene difluoruro. La membrana è stata sondato con i seguenti anticorpi: gli anticorpi per iNOS, COX-1, COX-2, HSP70, e Bcl-2, che erano gli stessi utilizzati per gli studi morfologici; il mouse anticorpo monoclonale di Bax (Santa Cruz Biotech.); anticorpo policlonale di coniglio per caspasi 3 (Santa Cruz Biotech.); e anticorpo monoclonale murino di actina filamenti (Santa Cruz Biotech.). bande di anticorpi reagito sono stati rilevati utilizzando un sistema di rilevazione ECL (Amersham, Buckinghamshire, Regno Unito).
misura di gastrina
gastrinemia è stata misurata utilizzando un kit di gastrina radioimmunoassay (kit di gastrina RIA, Dainabot, Tokyo, Giappone). L'anticorpo è specifico per la gastrina con un residuo ammide al suo capolinea carbossile.
Misurazione della prostaglandina E2
La mucosa gastrica è stata omogeneizzata a 4 ° C in tampone di lisi. Gli omogenati sono stati centrifugati a 12000 rpm per 20 minuti, e il surnatante sono stati sottoposti a prostaglandina E 2 test utilizzando una prostaglandina E 2 kit monoclonale immunoenzimatico (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), in base alle istruzioni del produttore analisi statistica
analisi statistica
. è stata effettuata mediante analisi misura ripetuta della varianza (ANOVA) per la lunghezza totale delle lesioni gastriche da t-test non appaiati per gastrica rapporto diminuzione del flusso ematico della mucosa. Tutti i valori sono espressi come media ± SE. P < 0.05 è stato accettato come statisticamente significativo
. Risultati
Caratterizzazione del TG del mouse TGFα esprimono mucosa gastrica
Il ceppo WT CD1 e TGFα-transgene che esprimono topi linea MT42 è cresciuto allo stesso modo e non ha mostrato alcuna differenza notevole nelle loro caratteristiche, comportamenti o durata della vita. Lo spessore maggiore osservata per la parete gastrica e ghiandole fundica erano 3,50 ± 0,18 millimetri e 2,33 ± 0,20 mm rispettivamente nei topi WT e 3,85 ± 0,24 millimetri e 2,63 ± 0,16 millimetri, rispettivamente, nei topi TG; non vi erano differenze significative nella forma delle mucose gastriche e ghiandole tra i topi WT e TG. In aggiunta al normale aspetto della mucosa gastrica, questa linea di topi TG aveva anche un aspetto normale del fegato, pancreas e altri organi.
Abbiamo poi confrontato capacità secrezione acida tra i topi WT e TG. Nei topi WT, secrezione acida massimale è aumentato significativamente dal livello basale di 25 ± 1,4 mEq /h a 50 ± 5,8 mEq /h dopo la stimolazione pentagastrina. Al contrario, nei topi TG, secrezione acida massima aumentata in misura minore di 30 ± 5,7 mEq /h dall'uscita basale di 23 ± 0,7 mEq /h (n = 5 in WT e topi TG). La secrezione acida smussato può riflettere la massa delle cellule parietali ridotta nel TG della mucosa (Figura 1e). Figura 1 Caratterizzazione del TGFα esprimono mucosa TG. Scala in ogni figura indica 100 micron. (A) Distribuzione di cellule TGFα-esprimono. cellule Brown color TGFα-positivi erano visibili lungo la regione pit luminale nella mucosa WT, la regione pit foveolar allungata, e il terzo inferiore della regione ghiandolare nella mucosa TG. (B) Sovrapposizione delle cellule TGFα-positivi di colore rosso e le cellule parietali H + /K + -ATPasi-positivi di colore verde. Lower cellule TGFα-positive a grappolo sono distinti dalle cellule parietali di colore verde nella mucosa TG. (C) Northern blot di umano TGFα mRNA e PCR-amplificato del mouse TGFα mRNA. Umana TGFα mRNA è espresso in sola mucosa TG (pannello di sinistra), ma la PCR-amplificato del mouse TGFα mRNA è espresso in modo simile in entrambi WT e TG mucose (pannello di destra). (D) Western Blot di TGFα forme intermedie. TGFα precursore (20 kDa) e le sue forme intermedie vengono visualizzate più intensamente nella mucosa TG che nella mucosa WT. (E) localizzazione del recettore EGF nella mucosa gastrica. Recettore EGF (EGF-R) è stato macchiato con Cy3 (rosso) e H + /K + -ATPasi era macchiata di FITC (verde). EGF-R è stato immunostained moderatamente nella regione fossa superiore e fortemente nella regione ghiandolare inferiori allo stesso modo sia nel WT e TG mucose. (F) Distribuzione di metallotioneina nella mucosa gastrica. Metallotioneina è immunostained fortemente nella regione ghiandolare inferiore, e moderatamente lungo la regione foveolare. (G) Allungamento della fossa gastrica della mucosa TG. cellule PCNA-positivi sono distribuiti in corrispondenza della zona superiore terzo nelle ghiandole gastriche WT, che sono distribuiti più numerosi e ampiamente nella regione ghiandolare centrale. (H) colorazione PAS mostra fossa allungata nella mucosa TG.
Espressione di TGFα transgene
TGFα-esprimono cellule-tipo sono stati identificati sulla base delle cellule-tipo-specifica immunoistochimica e la loro posizione mucosa. TGFα è stato riferito immunostained lungo le celle GSM nella fossette gastriche nell'uomo [14] e ratti [15], e lungo la regione cellule collo mucosa nei topi ceppo FVB [16]. Nel presente studio, le cellule di colore marrone TGFα-positivi sono stati distribuiti lungo la regione foveolar sia del WT e TG mucose, e lungo la regione ghiandolare inferiore del TG mucose (Figura 1a). Le cellule TGFα-positive lungo la regione foveolar sembravano essere cellule fossette gastriche, in base alla loro posizione (Figura 1b, pannello superiore), e quelli lungo la regione ghiandolare inferiore della mucosa TG non si sovrapponevano con il colore verde H + /K + - ATPasi cellule positive parietali (Figura 1B, pannello inferiore), ma ha fatto si sovrappongono con le cellule principali Pepsinogeno-positivi (dati non riportati). L'anticorpo che abbiamo usato per immunostaining per TGFα non riusciva a distinguere tra uomo e topo TGFα, ma la sua sonda mRNA potrebbe farlo per l'analisi Northern blot. Il TGFα-transgene umano è stato espresso nella mucosa TG, mentre nessuna espressione è stato notato nella mucosa WT (Figura 1c, pannello di sinistra). Al contrario, il mouse endogena TGFα mRNA era ugualmente espresso sia nel WT e TG mucose mediante real time PCR (Figura 1c, pannello di destra). TGFα è un peptide di 50 aminoacidi, derivato dal suo precursore membrana-spanning 160 aminoacidi spaccati dal fattore di necrosi tumorale-α-enzima di conversione (TACE) [27, 28]. Con il surplus espressione del transgene TGFα-umano nella mucosa TG, un precursore di circa 20 kDa TGFα e le sue forme intermedie sono stati aumentati di immunoblotting (Figura 1d).
Poiché sia ​​il precursore e le forme elaborate erano ugualmente attiva per stimolare FEG -R [28], abbiamo esaminato ulteriormente EGF-R localizzazione nella mucosa. EGF-R è stata localizzata pesantemente nel cluster regione cella inferiore capo e moderatamente nella regione cellule del collo mucose e nella regione pit foveolar sia nel WT e TG mucose (Figura 1e), come è stato riferito in precedenza per il ratto mucosa gastrica [15 ]. Poiché il transgene TGFα stato controllato sotto il topo gene metallotioneina [20] e metallotioneina è stato riferito prodotta nella mucosa gastrica [29], abbiamo esaminato i tipi di cellule che esprimono metallotioneina nella mucosa. Immunoistochimica, abbiamo notato metallotioneina colorazione per lo più lungo la regione ghiandolare inferiore e scatteringly lungo la regione fossa del controllo CD1-deformazione mucosa gastrica (Figura 1F). Pertanto, la distribuzione di TGFα esprimenti tipi di cella è simile a quella di metallotioneina esprimenti cellule della mucosa gastrica TG (Figure 1a e 1f).
Nella mucosa del mouse WT, l'H + /K + - cellule parietali ATPasi-positive sono state diffuse ampiamente sopra la regione ghiandolare tranne che per lo strato superiore-pit, mentre l'H + /K + - ATPasi-positivi regione ghiandolare è stata ridotta in altezza nel TG mucosa (Figura 1e). Infatti, l'istmo alla base della regione pozzo, che è stato confermato da PCNA colorazione, è stato spostato verso il centro della mucosa TG (Figura 1g). Inoltre, cellule PCNA-positivi sono stati fittamente distribuiti nel mezzo della mucosa. Coerentemente, la fossa foveolar PAS-colorazione positiva è stata allungata nella mucosa TG in contrasto breve pit nella mucosa WT (Figura 1h). Così, anche se l'altezza della mucosa gastrica era simile tra il WT e TG mucose, la zona proliferativa è stato spostato verso il basso e la regione pit foveolar era più allungata con una regione ghiandolare ridotta nella mocosa TG. Poiché la crescita delle cellule pit è fortemente migliorata gastrina [25, 30], abbiamo confrontato i livelli sierici di gastrina tra i topi WT e TG ma abbiamo trovato nessun aumento nei livelli di gastrina sierica nel topo TG (WT, 213 ± 41 pg /ml;. TG, 263 ± 47 pg /ml, n = 5, p = 0,438)
etanolo indotta lesioni gastriche nel WT e TG topo mucose
somministrazione orogastrico di etanolo acidificato (100 microlitri) causati emorragica lesioni nella mucosa TG (Figura 2a, sinistra). Istologicamente la lesione staccata regioni pit e istmo e ha raggiunto la regione medio-ghiandolare (Figura 2b, a sinistra). Al contrario, questo tipo di lesioni nella mucosa del mouse TG non era degno di nota (Figura 2a, a destra). Il pregiudizio è stato istologicamente limitato alla regione luminale pozzo (Figura 2b, a destra). In mucosa WT, la zona lesa aumentata rapidamente con un picco a 6 ore dopo la somministrazione di etanolo, mentre nella mucosa TG zona aumentata lentamente e minimamente senza un picco marcato (figura 2c). Coerentemente, cellule apoptotiche evidenziati dalla colorazione TUNEL distribuiti profondamente minore ghiandolare regione 3 h dopo la somministrazione di etanolo nella mucosa WT, mentre le cellule apoptotiche erano confinati alla regione pit, ma non si estendono alla regione ghiandolare nella mucosa TG ( Figura 2d). Figura 2 etanolo-indotta lesioni gastriche nelle mucose gastriche. (A) vista macroscopico della mucosa gastrica. Scala: 5 mm. Entrambe le mucose sono 6 h dopo la somministrazione di etanolo. Si noti che i WT mucosa visualizza estese lesioni emorragiche, al contrario, la mucosa TG sembra intatto dopo somministrazione di etanolo. (B) ematossilina e eosina di etanolo-feriti WT mucosa (a sinistra) e TG mucose (a destra). Si noti la formazione di ulcere in profondità nella mucosa WT. Scala: 100 micron. (C) Tempo corso di lesioni gastriche etanolo-indotta. zona danneggiata è rilevata in tempo fino a 12 ore dopo la somministrazione di etanolo. Ogni punto rappresenta la media di cinque topi. p
< 0.05 (d) TUNEL di WT mucose (a sinistra) e TG mucose (a destra). Entrambe le sezioni sono consecutivi a quelli 2B
rispettivamente. cellule apoptotiche sono visibili con i nuclei marrone scuro. Numerose cellule apoptotiche sono indicati nella mucosa WT. Tutte le foto sono state 6 ore dopo la somministrazione di etanolo. Scala:. 100 micron
gastrica flusso di sangue della mucosa nella mucosa etanolo trattati
Anche se sono stati segnalati una serie di fattori normativi citoprotettive, tra cui NO, CGRP, COX2, e HSP70 [12, 13, 31, 32] , flusso ematico della mucosa è stata proposta come un fattore primario per la protezione e restituzione di lesioni gastriche etanolo-indotta [1, 33]. Abbiamo misurato il flusso di sangue gastrico ponendo una sonda del misuratore laser Doppler sulla mucosa gastrica accede tramite una parete addominale esposta nel topo anestetizzato. il flusso di sangue gastrico diminuito segnata da 43,5 ± 6,37% dopo la somministrazione di etanolo sulla mucosa gastrica del mouse WT (Figura 3). Al contrario, esso è diminuito solo del 17,2 ± 9,21% dopo la somministrazione di etanolo sulla mucosa TG (Figura 3). Così, il flusso di sangue gastrico era ben mantenuto nella mucosa TG anche dopo il trattamento etanolo. Poiché mucosa ischemia è uno dei più importanti fattori ulcerose [33], il mantenimento del flusso sanguigno gastrico sembra essere un fattore essenziale per la protezione della mucosa. Figura 3 Valutazione delle gastrica flusso ematico della mucosa nelle mucose gastriche. Gastrica flusso ematico della mucosa è stata valutata confrontando il rapporto di flusso di sangue prima e dopo il trattamento etanolo. Il rapporto è ottenuto come percentuale contro il flusso di sangue prima del trattamento, che era molto più grande nella mucosa WT rispetto mucosa TG. * P
< . 0,03
Espressione di proteine ​​citoprotettive: NO sintetasi, COX-2, e HSP70
Per esplorare il meccanismo del sangue alta manutenzione flusso nella mucosa TG, abbiamo esaminato l'espressione di NO sintasi, che non fa da arginina, e rilassa i muscoli lisci vascolari via proteina chinasi cGMP-dipendente [34]. Ci sono tre tipi di NO sintetasi (NOS): neurali NOS (nNOS), NOS inducibile (iNOS), e endoteliale NOS (eNOS). nNOS e eNOS sono costitutivamente espressi, mentre iNOS è indotta su di lesioni gastriche [35]. nNOS è stato distribuito in modo simile al PAS-colorazione sulla regione fossa foveolare (Figura 1 g); si è osservato sopra la fossa allungata della mucosa TG, limitata a fossa luminale della mucosa WT (figura 4a). eNOS stato debolmente sparsi su tutta la mucosa gastrica simile sia nel WT e TG mucose (dati non mostrati). La colorazione iNOS era trascurabile nella mucosa WT, anche se è stato fortemente indotta nella regione ghiandolare inferiore dopo la mucosa è stata esposta a etanolo (Figura 4b). In mucosa TG, iNOS è costitutivamente espresso nella regione ghiandolare inferiori simile prima e dopo la lesione (figura 4b), che sembra contribuire ulteriormente al mantenimento di alta flusso sanguigno. Figura 4 Immunocolorazione di NO sintasi nella mucosa gastrica. Scala: 100 micron. immunostaining (a) nNOS. nNOS era visibile lungo la regione fossa, con conseguente sua distribuzione più ampia lungo la fossa di forma allungata nella mucosa TG. immunostaining (b) iNOS. iNOS è stata indotta nella regione ghiandolare inferiore dopo lesioni etanolo nella mucosa WT, mentre è stato costitutivamente espresso nella stessa regione della mucosa TG indipendentemente lesioni etanolo.
prostaglandine sono stati proposti come un importante fattore citoprotettivo oltre tre decenni fa [ ,,,0],8] ed i loro ruoli sono stati ampiamente studiati [36, 37]. Il ruolo degli enzimi prostaglandine-formatura, COX-1 e COX-2, è stato controverso nella protezione della mucosa gastrica contro irritanti [7, 11, 32]. Abbiamo esaminato l'espressione di COX nel WT e TG mucose durante lesioni etanolo. L'espressione di COX-1 non differiva tra il WT e TG mucose, né prima né dopo l'infortunio di etanolo (figura 5b). COX-2 non era rilevabile nella mucosa WT, ma la sua espressione divenne evidente 6 ore dopo la lesione etanolo, e la sua colorazione era localizzata nella regione ghiandolare inferiore (Figura 5a e 5b). Nella mucosa TG, l'immunocolorazione COX-2 è stato intenso allo stesso regione ancor prima che l'infortunio ed è rimasto positivo dopo l'infortunio (figura 5a). Dal momento che COX hanno dimostrato di essere espresso in cellule mesenchimali, come fibroblasti e cellule mononucleate nella mucosa gastrica [38], e il metodo streptoavidin /biotina /HPR a volte presenta colorazione di falsi positivi, abbiamo effettuato immunofluorescenza colorazione utilizzando un tratto ghiacciato che ha confermato espressione COX simile nella regione ghiandolare inferiore della mucosa TG (dati non mostrati). Con immunoblotting, COX-2 è aumentato dopo la lesione della mucosa WT, mentre è stato molto elevato in misura simile prima e dopo la lesione (Figura 5b). Coerentemente, prostaglandina E 2 livelli erano significativamente più alti nella mucosa TG che nella mucosa WT (Figura 5c).

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