funciones integradoras de factor de crecimiento transformante-α en los mecanismos de citoprotección de lesión de la mucosa gástrica

funciones integradoras de factor de crecimiento transformante-α en los mecanismos de citoprotección de lesión de la mucosa gástrica
Resumen Antecedentes

Factor crecimiento transformante α (TGF) protege contra el daño de la mucosa gástrica y facilita la cicatrización de la herida. Sin embargo, su sobreexpresión se sabe que inducen la gastropatía hipertrófica se asemeja a la enfermedad de Menetrier en ratones transgénicos (TG) en un fondo de FVB, como uno de los autores anteriormente. Estudiamos otra línea de ratones que expresan TGF? En un fondo CD1, cuya mucosa gástrica se ve normal. Desde este ratón TG tenía una fuerte resistencia a la lesión gástrica inducida por etanol, que considera el efecto a largo plazo de TGFa en varios mecanismos de protección gástrica.
Métodos
transgénicos que expresan TGF? (TG) líneas de ratones que llevan ADNc humano TGF? bajo el control del promotor de metalotioneína de ratón de genes que se han generado en un fondo de ratón CD1, y se analizaron sus fenotipos de lesiones resistente etanol producido por TGFa.
resultados
en la mucosa TG, el flujo sanguíneo se mantiene bien después de la lesión etanol . Además, los tipos neuronales e inducibles de NO sintasas fueron consistentemente y ampliamente expresadas en la mucosa TG, en comparación con la distribución limitada de tipo neural NO sintasa en la región luminal hoyo de la mucosa de tipo salvaje (WT). Su factor de transcripción NFkB aguas arriba de la COX-2 y se elevan de forma constitutiva en la mucosa TG incluso antes de la administración de etanol, mientras que fueron inducidas en la misma región de la mucosa WT sólo después de lesión etanol. Dos proteínas anti-apoptóticas, HSP70 y Bcl-2, se upregulated en la mucosa TG incluso antes de la administración de etanol, mientras que no se expresaron en la mucosa WT antes de la lesión. Además, pro-caspasa 3 se inhibió la activación en la mucosa TG, mientras que se convierte en la forma activa en la mucosa WT después de la administración de etanol.
Conclusión
Concluimos que TGFa mantiene la defensa de la mucosa gástrica contra la lesión gástrica por la integración de otros mecanismos citoprotectores.
Antecedentes
el etanol se ha utilizado para generar una lesión de la mucosa gástrica hemorrágica en roedores [1]. Con la administración oral de etanol acidificada con ácido clorhídrico o absoluta, extensas lesiones hemorrágicas pueden ser producidos en la mucosa gástrica. Este modelo de lesión gástrica experimental se ha utilizado con frecuencia para estudios de protección de la mucosa y de restitución gástricos. De hecho, un número de compuestos citoprotectores se ha probado para evaluar su potencia en la resistencia a las lesiones gástricas, incluyendo las hormonas gastrointestinales, factores de crecimiento, prostaglandinas, aminas bioactivos, e irritantes leves, tales como la capsaicina [2-5]. Entre estos compuestos, el factor de crecimiento epidérmico (EGF), factores de crecimiento de la familia en particular la transformación del factor de crecimiento α (TGFa), han sido reportados como potentes compuestos citoprotectores contra etanol, ácido acético, o una lesión gástrica inducida por aspirina [2, 4].
TGFa se expresó en la mucosa gástrica de rata después de la administración oral de taurocolato acidificada o ácido clorhídrico, lo que sugiere su función reparadora en la lesión gástrica [6]. TGFa vía intraperitoneal protegida contra la lesión gástrica inducida por etanol con un aumento significativo en mucina gástrica adherente en ratas [7]. La función citoprotectora de TGFa parecía estar mediada por la activación de la fosfolipasa C-γ1, pero no por las prostaglandinas, y era independiente del efecto anti-secretora de TGFa [7]. Por otra parte, las prostaglandinas y su enzima sintética, la ciclooxigenasa (COX), mucho tiempo se han propuesto como factores citoprotectores contra las lesiones gástricas [5, 8]. EGF se ha demostrado para expresar una isoforma de la COX inducible, COX-2, en la línea de células de la mucosa gástrica RGM1 rata a través de una vía de ERK MAP quinasa [9] y en fibloblasts Swiss 3T3, especialmente por la co-estimulación con gastrina [10]. Por otra parte, la COX-2 expresión por el factor de crecimiento similar a EGF de unión a heparina, un miembro de los factores de crecimiento de la familia EGF, fue bloqueada por un receptor de EGF específica (EGF-R) inhibidor en la mucosa gástrica de rata [11]. Por lo tanto, la señal de EGF-R parece mediar la COX-2 en la inducción de la mucosa gástrica.
Los mecanismos citoprotectores más importantes incluyen el flujo sanguíneo de la mucosa gástrica. EGF y TGF? Han demostrado que ejercen efectos citoprotectores a través de la estimulación de las neuronas sensibles a la capsaicina con la liberación de calcitonina péptido relacionado con el gen (CGRP) y el óxido nítrico (NO) en ratas expuestas a la administración de etanol orogástrica, resultando en un aumento en la sangre de la mucosa gástrica fluya [11, 12]. Por el contrario, Konturek et al. minimizado el papel del aumento CGRP-dependiente en el flujo sanguíneo gástrico mediante la demostración de que la administración de NO liberadora de protección que ofrece la aspirina contra la lesión gástrica inducida por etanol absoluto, incluso en ratas capsaicina denervado, resultando en la regulación positiva de la proteína de choque térmico 70 (HSP70 ) expresión y la atenuación de la lesión oxidativa por la fuerte regulación positiva de genes antioxidantes tales como cobre zinc superóxido dismutasa (SOD) y glutatión peroxidasa [13].
TGFa se inmunotiñó predominantemente en células GSM a lo largo de la fosa gástrica en seres humanos [14], intensamente en las células de la mucosa gástrica superficie (GSM) sobre la zona de proliferación y débilmente a lo largo de la región glandular bajo la zona proliferativa en ratas [15], y marcadamente a lo largo de la región de células mucosas del cuello en ratones de la cepa FVB /N [16]. Por otra parte, EGF-R se inmunotiñó en células GSM que reviste el pozo foveolar y la región de células mucosas del cuello a la región glandular más baja en seres humanos [17]. En ratas, EGF-R se localiza en la región superior a cielo y en las agrupaciones de células principales en la parte inferior de las glándulas gástricas [15]. Aunque TGFa se sabe que inducen la proliferación celular en primarios de rata cultivadas las células de la mucosa gástrica [18], y la proliferación hiperplásica en la mucosa en la transgénico TGFa-expresión de (TG) de ratón [19, 20], la distribución de TGFa y EGF-R en las células de la mucosa gástrica terminalmente diferenciadas sugiere que TGFa ejerce funciones no proliferativas incluyendo efectos anti-apoptóticos y formación de la barrera epitelial gástrica en una forma autocrina /paracrina. Por ejemplo, TGFa inhibe la apoptosis de una línea de células de la mucosa gástrica de ratón, GSM06, mediante la expresión de proteínas de la familia Bcl-2 anti-apoptóticas a través de una ruta de NF-KB dependiente de [21]. Gástrico apical y basolateral EGF-R se ha demostrado que induce una disminución de la permeabilidad paracelular al ácido para la protección de las células glandulares en un ambiente ácido [18, 22]. Por lo tanto, ambos TGF ejerce efectos proliferativos y no proliferativos sobre las funciones de la mucosa gástrica, y estos diversos efectos TGFa debe ser re-evaluado, al menos en términos de si sus resultados se derivan de tratamiento a corto plazo con líneas de células de cultivo o de largo expresión plazo utilizando animales que expresan transgenes TGFa.
hace una década, uno de los autores, H. Takagi, genera TGF-TG expresar las líneas de ratón bajo el control del promotor del gen de la metalotioneína, y una de estas líneas (MT100) exhibió gastropatía hipertrófica se asemeja a la enfermedad de Menetrier, como se muestra de manera similar por otros investigadores [19, 20]. Por el contrario, otra línea TG (MT42) muestra una mucosa gástrica de aspecto normal, aunque TGFa transgén se expresó en un grado similar en ambas líneas TG [20]. Puesto que la línea MT42 muestra un sorprendente nivel de resistencia a la lesión inducida por etanol a la mucosa gástrica, consideramos que podría ser útil para explorar los efectos no proliferativas de TGFa tal como la resistencia de la mucosa a la lesión etanol. En el presente estudio, hemos investigado los efectos a largo plazo de TGFa en la lesión gástrica inducida por etanol mediante el análisis de los cambios en los factores de regulación citoprotectores y anti-apoptóticos, incluyendo gástrica del flujo sanguíneo, la NO sintasa, la COX-2, y las proteínas asociadas a la apoptosis tales como HSP70, Bcl-2, y la caspasa 3.
Métodos
TGFa-expresión de ratón transgénico y la lesión gástrica inducida por etanol
TGFa-expresión de transgénicos (TG) líneas de ratones que llevan TGFa ADNc humano bajo el control de la me promotor del gen de la metalotioneína de ratón se generaron en un fondo CD1 o FVB ratón, tal como se describe anteriormente [20]. Una de las líneas de TG, MT100 en un fondo FVB ratón, muestra gastropatía hipertrófica se asemeja a la enfermedad de Menetrier [20], mientras que la otra línea, MT42 sobre un fondo de ratón CD1, muestra una mucosa gástrica de apariencia normal. El fenotipo del ratón TGF-TG parecía depender de la cepa de ratón, ya que tanto el MT100 y MT42 líneas expresaron un nivel similar del transgén TGFa en el estómago [20]. En el presente estudio, hemos utilizado la línea MT42 de TGF-expresando ratones machos TG y CD1 de tipo salvaje (WT) ratones machos a las edades de 6 a 8 semanas. Los animales se mantuvieron bajo luz controlada (7:00 AM a 7:00 PM) con comida y agua ad libitum
. México La ratones, con un peso de 30-35 g, se mantuvieron en ayunas durante 24 horas antes del experimento, pero se les permitió el acceso libre al agua. Todos los procedimientos experimentales que afectan a los ratones fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comité de Revisión de la Universidad de Gunma. A continuación, los ratones se les administró etanol acidificado orogástrica (100 l; 60% de etanol en 0,15 mol /L de HCl). Tres, seis y doce horas después de la administración de etanol acidificado los ratones fueron sacrificados para la evaluación de los análisis de lesiones gástricas e inmunohistoquímicos, y para el ARN y la extracción de proteínas para PCR en tiempo real, del Norte y los análisis Western blot.
Estudios fisiológicos
secreción de ácido gástrico se midió como se describe anteriormente [20, 23]. Brevemente, los ratones WT y TG se mantuvieron en ayunas durante 3 h y luego anestesiados con éter. Después de la incisión de la pared abdominal, la pyrolus se ligó, y se suturó la incisión. Se recogió el fluido gástrico 4 h después de la ligadura de pyrolus. Para la salida ácida máxima, la secreción ácida se estimuló mediante la inyección pentagastrina por vía subcutánea (/kg de peso corporal de 500 g). El fluido gástrico se tituló con NaOH 0,1 N a pH 7,0 utilizando un microtitrator.
Flujo sanguíneo de la mucosa gástrica se midió con un medidor de flujo Doppler láser (modelo SFA211, Avance Co., Tokio) mediante la colocación de una sonda en la superficie de la gástrico mucosa, tal como se describe anteriormente [24]. La señal de flujo se controló con el programa de grabación MacLab. El flujo de sangre se expresó con relación al nivel basal.
Estudios morfológicos comentario El espesor de la mucosa gástrica se midió desde la parte más alta a la parte inferior de la glándula con un micrómetro. De manera similar, las lesiones lesiones gástricas se midieron (anchura y longitud) con un micrómetro para calcular el área lesionada.
Para la inmunotinción, se obtuvieron anticuerpos de la siguiente manera. anticuerpo policlonal a H + /K + - ATPasa se obtuvo mediante la inyección de fracciones microsomales de células parietales de conejo en ratones [25]. Anticuerpo policlonal de conejo a la metalotioneína fue una especie de regalo del Dr. Nagamine, Escuela Universitaria de Ciencias de la Salud de Gunma [26]. Compramos anticuerpos como sigue: anticuerpo policlonal de conejo a TGFa, anticuerpo policlonal de conejo a EGF-R, cabra policlonal de anticuerpos a la COX-2, anticuerpo policlonal de conejo a NFkB, y el anticuerpo monoclonal de ratón para nNOS e iNOS de Santa Cruz Biotech. (Santa Cruz, CA); anticuerpo monoclonal de ratón a proliferativa de células antígeno nuclear (PCNA) de Zymed Lab. (South San Francisco, CA); anticuerpo de oveja para pepsinógeno II humana de biopur AB (Bubendorf, Suiza), que también reacciona a pepsinógeno ratón; anticuerpo policlonal de conejo para HSP70 de Stressgen Biotech. (Victoria, BC, Canadá); y anticuerpo monoclonal de ratón a Bcl-2 de BD Biosciences (San Diego, CA).
para la peroxidasa de rábano picante (HRP) -catalyzing tinción inmunohistoquímica, los estómagos picados fueron fijadas en formalina neutralizada al 10% a 4 ° C durante 24 h, y a continuación, se incluyeron en parafina para seccionamiento microtomo. Las secciones de tejido desparafinados se rehidrataron y se incubaron en solución de peróxido de hidrógeno al 3% para inhibir la actividad de la peroxidasa endógena. A continuación, las secciones se incubaron con un primer anticuerpo descrito anteriormente con una dilución apropiada a temperatura ambiente durante 30 min. Un anticuerpo secundario biotinilado se selecciona en base a las primeras especies animales que producen anticuerpos, y se utilizó luego con estreptavidina conjugada con HRP. La reacción HRP se realizó con 3-amino-9-etil-carbazol y peróxido de hidrógeno de acuerdo con las instrucciones suministradas con el tinción con estreptavidina-biotina Vectastatin Kit Elite (vectores Laboratories, Burlingame, CA). tinciones positivas aparecían de color marrón.
Para la tinción de inmunofluorescencia, estómagos picada se fijaron en paraformaldehído al 4% en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4 a 4 ° C durante 24 h. Pequeños trozos de tejido picado se sometieron a sustitución de sacarosa y se incluyeron en OCT-compuesto en la preparación de una sección congelada usando un microtomo. Para la inmunorreacción primario, las secciones en rodajas se probaron con un primer anticuerpo, y luego se incubaron ya sea con indodicarbocyanide (Cy3) conjugado purificado por afinidad de burro anti-conejo, anti-IgG de ratón (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), o fluoresceína isotiocianato (FITC) marcado con anti-IgG de conejo (Jackson ImmunoResearch), como anticuerpo secundario. La secundaria de anticuerpos IgG se selecciona en función de la especie en la que se planteó el primer anticuerpo.
La detección in situ de células apoptóticas se realizó utilizando el Kit para la detección de apoptosis in situ (Takara Bio Inc. Tokio, Japón). El kit contiene un sistema de ensayo de terminal mediada por desoxinucleotidiltransferasa desoxiuridina trifosfato de biotina nick fin de etiquetado (TUNEL). secciones del estómago se permeabilizaron con proteinasa K, y el 3'-OH extremos de los fragmentos de ADN se tiñeron siguiendo las instrucciones suministradas con el kit. Los núcleos teñidos de color marrón oscuro se consideraron células apoptóticas.
Análisis de ARN
estómagos se recorta y los ARN totales se extrajeron utilizando TRIzol (Gibco BRL, Tokio) de acuerdo con el protocolo suministrado por el fabricante. Para transferencia de Northern, el ARN total se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1,0% y se transfirió a una membrana de nylon (Amersham Pharmacia Biotech, Tokyo). La hibridación se realizó con una sonda de la humana TGFa ADNc (917 pb) marcado con [α- 32P] desoxi-CTP. Esta sonda reconoce ARNm de TGF? Humano, pero no ratón nivel TGF mRNA.
Ratón TGFa ARNm se midió usando una reacción en tiempo real cadena de la polimerasa (PCR) con la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control interno. La PCR en tiempo real se llevó a cabo usando el 7700 Detector de Secuencia ABI Prism y blandos (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando el ADN fluorescente del tinte SYBR verde detección. Los cebadores fueron diseñados utilizando el software de diseño Primer Express (Applied Biosystems). El resultado final para cada muestra se normalizó por el valor respectivo GAPDH. Las secuencias de cebador son como sigue: ratón TGFa: 5'-CCTGAGCACCCGAAGAT-3 'y 5'-CCTTCCCTCATGCCTTACT-3'; GAPDH: 5 'GTCGTGGATCTGACGTGCC-3' y 5'-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3 '
análisis Western blot
muestras de tejido gástrico fueron recortadas y la proteína total de la mucosa gástrica se homogeneizó en tampón RIPA que contiene un cóctel de inhibidores de proteasa. (fluoruro de fenilmetilsulfonilo, de pepstatina, leupeptina y aprotinina) (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). El sobrenadante se separó en un gel de SDS-PAGE, y luego se transfirió a una membrana de difluoruro de polivinilideno. La membrana se sondeó con los siguientes anticuerpos: anticuerpos para iNOS, COX-1, COX-2, HSP70, y Bcl-2, que eran los mismos utilizados para los estudios morfológicos; anticuerpo monoclonal de ratón a Bax (Santa Cruz Biotech.); anticuerpo policlonal de conejo a la caspasa 3 (Santa Cruz Biotech.); y el anticuerpo monoclonal de ratón a los filamentos de actina (Santa Cruz Biotech.). Se detectaron bandas de anticuerpos reaccionado utilizando un sistema de detección ECL (Amersham, Buckinghamshire, UK). Se midió
Medición de gastrina
Serum gastrina utilizando un kit de gastrina radioinmunoensayo (kit RIA de gastrina, Dainabot, Tokio, Japón). El anticuerpo es específico para la gastrina con un resto amida en su extremo carboxilo terminal.
Medición de prostaglandina E2 comentario El mucosa gástrica se homogeneizó a 4 ° C en tampón de lisis. Los homogeneizados se centrifugaron a 12.000 rpm durante 20 min, y los sobrenadantes se sometieron a la prostaglandina E 2 ensayo utilizando una prostaglandina E 2 Monoclonal Enzyme Immunoassay Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), de acuerdo con las instrucciones del fabricante .
el análisis estadístico
análisis estadístico se realizó mediante análisis de medidas repetidas de la varianza (ANOVA) para la longitud total de las lesiones gástricas por unpaired t-test para gástrico relación de disminución del flujo sanguíneo de la mucosa. Todos los valores se expresan como la media ± SE. P < 0,05 fue aceptado como estadísticamente significativo.
Resultados
Caracterización de la mucosa gástrica TG de ratón que expresan TGF?
La cepa WT CD1 y TGF? Transgenes que expresan los ratones de la línea MT42 crecieron de manera similar y no mostraron ninguna diferencia notable en sus características, comportamientos o esperanzas de vida. El mayor espesor observó para la pared gástrica y glándulas fúndicas fueron 3,50 ± 0,18 mm y 2,33 ± 0,20 mm, respectivamente, en los ratones WT, y 3,85 ± 0,24 mm y 2,63 ± 0,16 mm, respectivamente, en los ratones TG; no hubo diferencias significativas en la forma de las mucosas gástricas y glándulas entre los ratones WT y TG. Además de la apariencia normal de la mucosa gástrica, esta línea de ratón TG también tenía un hígado de aspecto normal, el páncreas y otros órganos.
A continuación, en comparación capacidad de secreción de ácido entre los ratones WT y TG. En los ratones WT, la producción ácida máxima aumentó significativamente desde el nivel basal de 25 ± 1,4 mEq /h hasta 50 ± 5,8 mEq /h después de la estimulación pentagastrina. Por el contrario, en los ratones Tg, aumentó la producción de ácido máxima en menor medida a 30 ± 5,7 mEq /h desde la salida basal de 23 ± 0,7 mEq /h (n = 5 en ratones WT y TG). La producción de ácido embotado puede reflejar la masa de células parietales reducida en la mucosa TG (Figura 1e). Figura 1 Caracterización de la mucosa TG TGFa-expresión. Escala en cada figura indica 100 micras. (A) La distribución de las células que expresan TGF?. células de color marrón TGFa-positivos eran visibles a lo largo de la región de pozo luminal en la mucosa WT, la región de pozo foveolar alargado, y el tercio inferior de la región glandular en la mucosa TG. (B) La superposición de las células TGF-positivas de color rojo y las células parietales H + /K + -ATPasa-positivas de color verde. células TGF-positivas inferiores en racimo son diferentes de las células parietales de color verde en la mucosa TG. (C) transferencia de Northern de ARNm de TGF? Humano y amplificado por PCR de ARNm de TGF? Ratón. ARNm de TGF? humano se expresa en la mucosa TG solo (panel izquierdo), pero amplificado por PCR TGFa mRNA de ratón se expresó de manera similar tanto en el WT y TG mucosas (panel derecho). (D) transferencia de Western de formas intermedias TGFa. precursor TGFa (20 kDa) y sus formas intermedias se visualizan más intensamente en la mucosa TG que en la mucosa WT. (E) La localización de receptor de EGF en la mucosa gástrica. receptor de EGF (EGF-R) se tiñó con Cy3 (rojo) y H + /K + -ATPasa se tiñeron con FITC (verde). EGF-R se inmunotiñó moderadamente en la región de pozo superior y fuertemente en la región glandular inferior de manera similar tanto en el WT y TG mucosas. (F) La distribución de la metalotioneína en la mucosa gástrica. Metalotioneína se immunostained fuertemente en la región glandular inferior, y moderadamente a lo largo de la región foveolar. (G) Elongación de la fosa gástrica de la mucosa TG. células PCNA positivas se distribuyen en la región superior tercio en las glándulas gástricas WT, mientras que se distribuyen de manera más numeroso y ampliamente en la región glandular media. (H) PAS tinción muestra fosa alargada en la mucosa TG.
Expresión de TGFa transgén
TGFa que expresan tipos de células se identificaron basa en células de tipo específico de inmunotinción y su ubicación de la mucosa. Según los informes, TGFa se inmunotiñó lo largo de las células de GSM en el pozo gástrica en seres humanos [14] y ratas [15], y a lo largo de la región de células mucosas del cuello en los ratones de la cepa FVB [16]. En el presente estudio, se distribuyeron las células de color marrón TGFa-positivos a lo largo de la región foveolar tanto de la WT y TG mucosas, y a lo largo de la región glandular inferior de la TG mucosa (Figura 1a). Las células TGF? Positivos a lo largo de la región foveolar parecían ser células de pozo gástricos, basados ​​por su ubicación (Figura 1B, panel superior), y los que a lo largo de la región glandular inferior de la mucosa TG no se superponían con el de color verde H + /K + - ATPasa-células parietales positivos (Figura 1B, panel inferior), pero no se superponen con las células principales pepsinógeno-positivo (datos no mostrados). El anticuerpo se utilizó para la inmunotinción para TGFa no podía distinguir entre el hombre y el ratón TGFa, pero su sonda de ARNm podría hacerlo para el análisis de transferencia Northern. El TGF? Transgén humano se expresó en la mucosa TG, mientras que no se observó expresión en la mucosa WT (Figura 1c, el panel de la izquierda). Por el contrario, el ratón endógeno TGFa ARNm se expresó de manera similar tanto en el WT y TG mucosa por PCR en tiempo real (Figura 1c, panel derecho). TGFa es un péptido de 50 aminoácidos, derivado de su precursor que atraviesa la membrana 160 amino ácido escindido por factor de necrosis tumoral-α de la enzima convertidora (TACE) [27, 28]. Con la expresión excedente del TGF? Transgén humano en la mucosa TG, un precursor de aproximadamente 20 kDa TGFa y sus formas intermedias se incrementaron por inmunotransferencia (Figura 1d).
Dado que tanto el precursor y formas procesadas fueron igualmente activo para estimular EGF -R [28], se examinó adicionalmente EGF-R localización en la mucosa. EGF-R se localiza en gran medida en la región inferior jefe de grupo de células y moderadamente en la región de células mucosas del cuello y en la región de pozo foveolar tanto en el WT y TG mucosa (Figura 1e), como se informó previamente para la mucosa gástrica de rata [15 ]. Puesto que el transgén TGFa fue controlado por el gen de metalotioneína de ratón [20] y de la metalotioneína se ha producido según se informa en la mucosa gástrica [29], se examinaron los tipos de células que expresan de metalotioneína en la mucosa. Por inmunohistoquímica, se observó tinción metalotioneína en su mayoría a lo largo de la región glandular inferior y scatteringly lo largo de la región hundida del control CD1 cepa mucosa gástrica (Figura 1F). Por lo tanto, la distribución de TGFa-expresión de tipos de células es similar a la de la metalotioneína-expresión de las células en la mucosa gástrica TG (figuras 1a y 1f).
En la mucosa ratón WT, el H + /K + - células parietales ATPasa-positivos se extienden ampliamente sobre la región glandular a excepción de la capa superior a cielo, mientras que el H + /K + - ATPasa-positivas región glandular se redujo en altura en el TG mucosa (Figura 1e). De hecho, el istmo en la base de la región de pozo, que fue confirmada por tinción con PCNA, se mueve hacia abajo a la mitad de la mucosa TG (Figura 1g). Además, las células PCNA positivas se distribuyeron densamente en el medio de la mucosa. Consistentemente, la fosa foveolar PAS-tinción positiva se alargó en la mucosa TG en contraste con el corto hoyo en el mucosa WT (Figura 1H). Por lo tanto, aunque la altura de la mucosa gástrica fue similar entre el WT y TG mucosa, la zona proliferativa se mueve hacia abajo y la región de pozo foveolar era más alargada con una región glandular reducida en el mocosa TG. Dado que el crecimiento de las células de pozo está fuertemente reforzada por la gastrina [25, 30], se compararon los niveles de gastrina sérica entre los ratones WT y TG pero no encontramos ningún aumento en los niveles de gastrina sérica en el ratón TG (WT, 213 ± 41 pg /ml;. TG, 263 ± 47 pg /ml, n = 5, p = 0,438)
lesión gástrica inducida por etanol en el WT y TG ratón mucosa
administración orogástrica de etanol acidificado (100 l) causada hemorrágica lesiones en la mucosa TG (Figura 2a, izquierda). Histológicamente la lesión se quitó las regiones hundidas e istmo y llegó a la región del medio-glandular (Figura 2b, izquierda). Por el contrario, este tipo de lesión en la mucosa del ratón TG no fue notable (Figura 2a, derecha). La lesión fue histológicamente limitado a la región luminal hoyo (Figura 2b, derecha). En la mucosa WT, el área lesionada se incrementó rápidamente con un pico a las 6 h después de la administración de etanol, mientras que en la mucosa TG el área aumenta lentamente y mínimamente sin un pico marcado (Figura 2c). Consistentemente, las células apoptóticas se muestran por la tinción de TUNEL distribuidos profundamente en la parte inferior glandular región 3 h después de la administración de etanol en la mucosa WT, mientras que las células apoptóticas estaban confinadas a la región en boxes, pero no se extendió a la región glandular en la mucosa TG ( Figura 2d). Figura 2 inducida por etanol lesión gástrica en la mucosa gástrica. (A) vista macroscópica de la mucosa gástrica. Escala: 5 mm. Ambas mucosas son 6 h después de la administración de etanol. Tenga en cuenta que el WT mucosa muestra extensas lesiones hemorrágicas, por el contrario, la mucosa TG se ve en buen estado después de la administración de etanol. (B) Hematoxilina y eosina tinción de la mucosa lesionada etanol-WT (izquierda) y la mucosa TG (derecha). Tenga en cuenta la formación de úlceras profundas en la mucosa WT. Escala: 100 micras. (C) Evolución temporal de la lesión gástrica inducida por etanol. área lesionada se traza contra el tiempo hasta 12 h después de la administración de etanol. Cada punto representa una media de cinco ratones. p Hotel < tinción 0.05 (d) TUNEL de WT mucosa (izquierda) y la mucosa TG (derecha). Ambas secciones son consecutivos a las de 2B
, respectivamente. Las células apoptóticas son visibles con núcleos de color marrón oscuro. Numerosas células apoptóticas se indican en la mucosa WT. Todas las fotos fueron 6 h después de la administración de etanol. Escala:. 100 micras
flujo sanguíneo de la mucosa gástrica en la mucosa tratados con etanol
Aunque se ha informado de una serie de factores reguladores citoprotectores, incluyendo NO, CGRP, COX2, y HSP70 [12, 13, 31, 32] , el flujo sanguíneo de la mucosa se ha propuesto como un factor principal para la protección y la restitución de la lesión gástrica inducida por etanol [1, 33]. Se midió el flujo sanguíneo gástrico mediante la colocación de una sonda de la medidor de flujo Doppler láser sobre la mucosa gástrica accede a través de una pared abdominal se expone en el ratón anestesiado. el flujo sanguíneo gástrico disminución marcada por 43,5 ± 6,37% después de la administración de etanol sobre la mucosa gástrica del ratón WT (Figura 3). En contraste, sólo disminuyó en un 17,2 ± 9,21% después de la administración de etanol en la mucosa TG (Figura 3). Por lo tanto, el flujo de sangre gástrico se mantiene bien en la mucosa TG incluso después del tratamiento con etanol. Desde isquemia de la mucosa es uno de los factores más importantes ulcerogénicos [33], el mantenimiento del flujo sanguíneo gástrico parece ser un factor esencial para la protección de la mucosa. Figura 3 Evaluación de flujo sanguíneo de la mucosa gástrica en la mucosa gástrica. Gástrico flujo sanguíneo de la mucosa se evaluó mediante la comparación de la relación de flujo de sangre antes y después del tratamiento con etanol. La relación se obtuvo como un por ciento contra el flujo de sangre antes del tratamiento, lo que era mucho más grande en la mucosa WT que en la mucosa TG. * P Hotel < . 0,03
La expresión de proteínas protectoras: NO sintasa, la COX-2 y HSP70
Para explorar el mecanismo de mantenimiento de alto flujo sanguíneo en la mucosa TG, se analizó la expresión de NO sintasa, lo que hace que NO a partir de arginina, y relaja los músculos lisos vasculares a través de la proteína quinasa dependiente de GMPc [34]. Hay tres tipos de NO sintasa (NOS): NOS neuronal (nNOS), NOS inducible (iNOS), y NOS endotelial (eNOS). nNOS y eNOS se expresan constitutivamente, mientras que la iNOS es inducida después de la lesión gástrica [35]. nNOS se distribuyó de manera similar a la tinción PAS-sobre la región de pozo foveolar (Figura 1g); se observó sobre la fosa alargada de la mucosa TG y se limitó a la fosa luminal de la mucosa WT (Figura 4a). eNOS se dispersó débilmente sobre toda la mucosa gástrica de manera similar tanto en el WT y TG mucosas (datos no mostrados). La tinción iNOS era insignificante en la mucosa WT, aunque fue muy inducida en la región glandular más baja después de la mucosa fue expuesto a etanol (Figura 4b). En la mucosa TG, iNOS se expresa constitutivamente en la región glandular menor de manera similar antes y después de la lesión (Figura 4b), que aparece a seguir contribuyendo al mantenimiento de un alto flujo sanguíneo. Figura 4 La inmunotinción de NO sintasa en la mucosa gástrica. Escala: 100 micras. inmunotinción (a) nNOS. nNOS era visible a lo largo de la región en boxes, lo que resulta en su distribución más amplia a lo largo de la fosa alargada en la mucosa TG. inmunotinción (b) la iNOS. iNOS fue inducida en la región glandular inferior después de la lesión de etanol en la mucosa WT, mientras que se expresa constitutivamente en la misma región de la mucosa TG independientemente de lesión etanol. Se propusieron
prostaglandinas como un factor importante citoprotector hace más de tres décadas [ ,,,0],8] y sus funciones han sido ampliamente estudiados [36, 37]. El papel de las enzimas de formación de prostaglandinas, la COX-1 y COX-2, ha sido controvertido en la protección de la mucosa contra los irritantes gástricos [7, 11, 32]. Se examinó la expresión de la COX en el WT y TG mucosa durante la lesión de etanol. La expresión de COX-1 no fue diferente entre el WT y TG mucosas, ni antes ni después de la lesión de etanol (Figura 5b). COX-2 no era detectable en la mucosa WT, pero su expresión se hizo evidente 6 h después de la lesión de etanol, y su tinción se localiza en la región glandular inferior (Figura 5a y 5b). En la mucosa TG, la COX-2 inmunotinción fue intensa en la misma región, incluso antes de la lesión y se mantuvo positivo después de la lesión (Figura 5a). Desde las COXs han demostrado que se expresa en las células mesenquimales tales como fibroblastos y células mononucleares en la mucosa gástrica [38], y el método de estreptavidina /biotina /HPR a veces presenta tinción de falsos positivos, se realizó la tinción de inmunofluorescencia usando una sección congelada que confirmó la expresión de la COX de forma similar en la región glandular inferior de la mucosa TG (datos no mostrados). Por inmunotransferencia, COX-2 se incrementó después de la lesión en la mucosa WT, mientras que estaba sumamente elevada en un grado similar antes y después de la lesión (Figura 5b). Consistentemente, la prostaglandina E 2 niveles fueron significativamente mayores en la mucosa TG que en la mucosa WT (Figura 5c).

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