Integrative roller transformerende vækstfaktor-α i cytoprotektion mekanismer maveslimhinden injury

Integrative roller transformerende vækstfaktor-α i cytoprotektion mekanismer maveslimhinden skade
Abstract
Baggrund
transformerende vækstfaktor α (TGFa) beskytter mod gastrisk mucosal skade og letter sårheling. Imidlertid er dets overekspression kendt for at fremkalde hypertrofisk gastropathy ligner Ménétriers sygdom i transgene (TG) mus på en FVB baggrund, som en af ​​forfatterne tidligere rapporterede. Vi studerede anden TGFa-udtrykkende muse linje på en CD1 baggrund, hvis maveslimhinden fremtræder normal. Da denne TG mus havde en stærk modstand mod ethanol-induceret gastrisk skade, betragtes vi den langsigtede effekt af TGFa på flere gastriske beskyttelsesmekanismer.
Metoder
TGFa-udtrykkende transgene (TG) mus linjer bærer human TGFa cDNA under kontrol af muse-metallothionein-gen i promotoren blev genereret på en CD1 mus baggrund, og analyserede deres ethanol skade-resistente fænotyper produceret af TGFa.
Resultater
i TG slimhinde blev blod flow godt vedligeholdt efter ethanol skade . Desuden blev neurale og inducerbare typer NO-syntaser konsekvent og bredt udtrykt i TG mucosa, sammenlignet med den begrænsede fordeling af neural typen NO-syntase i den luminale pit region af vildtype (WT) slimhinde. COX-2 og dets opstrøms transskriptionsfaktor NFKB blev konstitutivt forhøjet i TG mucosa selv før ethanol administration, hvorimod de blev induceret i den samme region af WT mucosa først efter ethanol skade. To anti-apoptotiske proteiner, HSP70 og Bcl-2, blev opreguleret i TG mucosa selv før ethanol administration, mens de ikke blev udtrykt i WT mucosa før skaden. Desuden blev pro-caspase 3-aktivering inhiberes i TG mucosa, mens den blev omdannet til den aktive form i WT mucosa efter ethanol administration.
Konklusion
Vi konkluderer, at TGFa fastholder maveslimhinden forsvar mod gastrisk skade ved integrere andre cytobeskyttende mekanismer.
Baggrund
Ethanol har længe været brugt til at generere en blødende maveslimhinden skade i gnavere [1]. Med oral indgivelse af absolut eller saltsyre-forsuret ethanol, kan omfattende hæmorrhagiske læsioner fremstilles i maveslimhinden. Denne eksperimentelle gastrisk skade model er ofte blevet brugt til gastrisk undersøgelser slimhinde beskyttelse og tilbagelevering. Faktisk har en række cytobeskyttende forbindelser blevet testet for at vurdere deres styrke i at modstå gastrisk personskade, herunder gastrointestinale hormoner, vækstfaktorer, prostaglandiner, bioaktive aminer, og milde irritanter såsom capsaicin [2-5]. Blandt disse forbindelser, epidermal vækstfaktor (EGF) familie vækstfaktorer, navnlig transformerende vækstfaktor α (TGFa), er blevet rapporteret som potente cytobeskyttende forbindelser mod ethanol-, eddikesyre- eller aspirin-induceret gastrisk skade [2, 4].
TGFa blev udtrykt i rotten maveslimhinden efter oral administration af forsuret taurocholat eller saltsyre, tyder reparative rolle i gastrisk skade [6]. TGFa givet intraperitonealt beskyttet mod ethanol-induceret gastrisk skade med en betydelig stigning i vedhængende gastrisk mucin hos rotter [7]. Den cytobeskyttende funktion af TGFa syntes at være medieret af aktivering af phospholipase C-γ1, men ikke af prostaglandiner, og var uafhængig af den anti-sekretoriske effekt af TGFa [7]. På den anden side, prostaglandiner og deres syntetiske enzym, cyclooxygenase (COX), har længe været foreslået som cytobeskyttende faktorer mod gastrisk skade [5, 8]. EGF er blevet vist at udtrykke en inducerbar COX isoform, COX-2, i RGM1 rotte maveslimhinden cellelinie gennem en ERK MAP-kinase pathway [9] og i Swiss 3T3 fibloblasts, især ved co-stimulering med gastrin [10]. Endvidere COX-2-ekspression ved heparinbindende EGF-lignende vækstfaktor, et medlem af EGF-familien vækstfaktorer, blev blokeret af en specifik EGF-receptor (EGF-R) inhibitor i rotte gastrisk mucosa [11]. Således forekommer det EGF-R signal at mediere COX-2-induktion i maveslimhinden.
De vigtigste cytobeskyttende mekanismer omfatter maveslimhinden blodgennemstrømning. EGF og TGFa har vist sig at udvise cytobeskyttende virkninger via stimulering af capsaicin-sensitive neuroner med frigivelse af calcitonin-gen-relateret peptid (CGRP) og nitrogenoxid (NO) i rotter udsat for orogastric ethanol administration, hvilket resulterer i en stigning i maveslimhinden blod flow [11, 12]. I modsætning hertil Konturek et al. minimeret rolle CGRP-afhængig stigning i gastrisk blodstrøm ved at demonstrere, at administrationen af ​​NO-frigivende aspirin tilbudt beskyttelse mod absolut ethanol-induceret gastrisk skade, selv i capsaicin-denerveres rotter, hvilket resulterer i opregulering af varmechokprotein 70 (HSP70 ) ekspression og dæmpning af den oxidative skade ved stærk opregulering af antioxidative gener, såsom zink kobber superoxiddismutase (SOD) og glutathionperoxidase [13].
TGFa blev immunfarvet overvejende GSM celler langs maveregionen hos mennesker [14], intensivt i gastrisk overflade mucosal (GSM) celler i den proliferative zone og svagt langs glandulær region under den proliferative zone i rotter [15], og markant langs mukøse hals celle region i FVB /N-stamme mus [16]. På den anden side blev EGF-R immunfarvet i GSM-celler foring foveolar pit og slim hals celle region til den nedre glandulær region hos mennesker [17]. Hos rotter blev EGF-R lokaliseret ved toppen-pit-regionen og i de vigtigste celleklynger i bunden af ​​de gastriske kirtler [15]. Selvom TGFa vides at inducere celleproliferation i den primære dyrket rotte gastriske mucosale celler [18], og hyperplastisk proliferation i slimhinden på TGFa-udtrykkende transgen (TG) mus [19, 20], fordelingen af ​​TGFa og EGF-R i terminalt differentierede gastriske slimhindeceller antyder, at TGFa udøver ikke-proliferative funktioner, herunder anti-apoptotiske virkninger og gastrisk epitelbarrieren dannelse i en autokrin /parakrin måde. F.eks TGFa inhiberede apoptose af en mus maveslimhinden cellelinie GSM06, ved at udtrykke anti-apoptotiske Bcl-2-familien proteiner gennem en NF-KB-afhængige vej [21]. Gastrisk apikale og basolaterale EGF-R er blevet vist at inducere et fald i paracellulær permeabilitet for syre til beskyttelse af kirtelceller i et surt miljø [18, 22]. Således TGFa udøver både proliferative og ikke-proliferative effekt på maveslimhinden funktioner, og disse forskellige TGFa virkninger bør revurderes, i hvert fald hvad angår, om deres resultater er afledt af kortvarig behandling ved hjælp af kultur cellelinjer eller fra lang udtrykket udtryk ved hjælp TGFa-transgene-udtrykkende dyr.
for ti år siden, en af ​​forfatterne, H. Takagi, genereret TGFa-udtrykkende TG musen linjer under kontrol af metallothionein genet, og en af ​​disse linjer (MT100) udviste hypertrofisk gastropathy ligner Ménétriers sygdom, som på lignende måde vist af andre forskere [19, 20]. I modsætning hertil en anden TG line (MT42) viste en normalt udseende maveslimhinden, selvom TGFa transgen blev udtrykt i et tilsvarende omfang i begge TG kredsløb [20]. Siden MT42 linje viste en overraskende grad af resistens over for ethanol-induceret skade på maveslimhinden, vi mente, at det kunne være nyttigt for at udforske de ikke-proliferative virkninger af TGFa såsom slimhinde modstand mod ethanol skade. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi de langsigtede virkninger af TGFa på ethanol-induceret gastrisk skade ved at analysere ændringer i cytobeskyttende og anti-apoptotiske regulatoriske faktorer, herunder gastrisk blodstrøm, NO syntase, COX-2, og apoptose-associerede proteiner sådanne som HSP70, Bcl-2, og caspase 3.
Metoder Salg TGFa-udtrykkende transgen mus og ethanol-induceret gastrisk skade
TGFa-udtrykkende transgene (TG) muselinjer bærer human TGFa cDNA under kontrol af den muse-metallothionein-gen i promotoren blev genereret på en CD1 eller FVB mus baggrund, som tidligere [20] beskrevne. En af de TG linjer, MT100 på FVB mus baggrund, viste hypertrofisk gastropathy ligner Ménétriers sygdom [20], mens den anden linje, MT42 på en CD1 mus baggrund, vises en normalt udseende maveslimhinden. Fænotypen af ​​TGFa-TG mus syntes at afhænge af muse-stamme, fordi både MT100 og MT42 linier udtrykte et lignende niveau af TGFa transgen i maven [20]. I den foreliggende undersøgelse anvendte vi MT42 linje af TGFa-udtrykkende TG hanmus og CD1 vildtype (WT) hanmus i alderen 6 til 8 uger. Dyrene blev holdt under kontrollerede lys (7:00 til 07:00) med mad og vand ad libitum
.
Musene, der vejer 30-35 g, blev fastet i 24 timer før forsøget, men havde fri adgang til vand. Alle eksperimentelle procedurer påvirker mus blev godkendt af Animal Care og brug Udvalg Anmeldelse ved Gunma Universitet. Musene blev derefter givet orogastric forsuret ethanol (100 pi; 60% ethanol i 0,15 mol /l HCI). Tre, seks og tolv timer efter den syrnede ethanol administration blev musene aflivet til evaluering af gastriske skade og immunhistokemiske analyser og til RNA og protein-ekstraktion for real time PCR, Northern og Western blot-analyser. Salg Fysiologiske undersøgelser
Mavesyresekretion blev målt som tidligere beskrevet [20, 23]. Kort fortalt blev WT og Tg mus fastede i 3 timer og derefter bedøvet med ether. Efter indsnit i bugvæggen blev pyrolus ligeret, og snittet blev syet. Mavesaften blev samlet 4 timer efter pyrolus ligering. For maksimal syreproduktion blev stimuleret syresekretion ved injektion pentagastrin subkutant (500 ug /kg legemsvægt). Mavesaften blev titreret med 0,1 N NaOH til pH 7,0 ved anvendelse af en microtitrator.
Maveslimhinden blodstrøm blev målt med en laser Doppler flowmeter (model SFA211, Advance Co., Tokyo) ved at placere en sonde på overfladen af ​​den gastriske slimhinde, som tidligere beskrevet [24]. Strømmen signal blev overvåget med MacLab optagelse program. Den blodgennemstrømning blev udtrykt i forhold til det basale niveau.
Morfologiske undersøgelser
Tykkelsen af ​​maveslimhinden blev målt fra det højeste del til bunden af ​​kirtlen med et mikrometer. Ligeledes blev mavens skade læsioner målt (bredde og længdegrad) med et mikrometer til at beregne det skadede område.
For immunfarvning, opnåede vi antistoffer som følger. Polyklonalt antistof mod H + /K + - ATPase, blev opnået ved at injicere kanin parietalcellerne-mikrosomale fraktioner i mus [25]. Kanin polyklonale antistof til metallothionein var en slags gave fra Dr. Nagamine, Gunma University School of Health Sciences [26]. Vi købte antistoffer som følger: kanin polyklonalt antistof mod TGFa, kanin polyklonalt antistof mod EGF-R, ged polyklonale antistof mod COX-2, kanin polyklonalt antistof mod NFKB, og monoklonalt museantistof til nNOS og iNOS fra Santa Cruz Biotech. (Santa Cruz, CA); muse monoklonalt antistof til proliferative-celle (PCNA) fra Zymed Lab. (South San Francisco, CA); fåreantistof til human pepsinogen II fra BioPur AB (Bubendorf, Schweiz), som også reagerer på muse pepsinogen; kanin polyklonalt antistof mod HSP70 fra StressGen Biotech. (Victoria, BC, Canada); og muse-monoklonalt antistof mod Bcl-2 fra BD Biosciences (San Diego, CA). Hus Til peberrodsperoxidase (HRP) -catalyzing immunhistokemisk farvning blev hakket maver fikseret i neutraliseret 10% formalin ved 4 ° C i 24 timer, og blev derefter indlejret i paraffin for mikrotomsektionering. De afparaffinerede vævssnit blev rehydreret og inkuberet i 3% hydrogenperoxidopløsning for at inhibere endogen peroxidaseaktivitet. Derefter blev snittene inkuberet med et første antistof beskrevet ovenfor med en passende fortynding ved stuetemperatur i 30 min. Et sekundært biotinyleret antistof blev valgt på basis af det første antistof-producerende dyrearter, og blev derefter anvendt med HRP-konjugeret streptavidin. HRP-reaktionen blev udført med 3-amino-9-ethyl-carbazol og hydrogenperoxid i overensstemmelse med instruktionerne, der følger med streptavidin-biotin farvning Vectastatin Elite Kit (vektorer Laboratories, Burlingame, CA). Positive farvninger dukkede brun i farven. Hus Til immunfluorescensfarvning blev hakket maver fikseret i 4% paraformaldehyd i 0,1 M phosphatpuffer, pH 7,4 ved 4 ° C i 24 timer. Små stykker af hakket væv undergik saccharose udskiftning og blev indlejret i OCT-forbindelse i forberedelse til en frosset snit under anvendelse af en mikrotom. For det primære immunreaktion, blev skiver sektioner probet med et første antistof, og blev derefter inkuberet enten med indodicarbocyanide (Cy3) -konjugeret affinitetsoprenset æsel-anti-kanin, anti-mus IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), eller fluorescein (FITC) -mærket anti-kanin IgG (Jackson ImmunoResearch), som et sekundært antistof. Det sekundære antistof IgG blev valgt på basis af de arter, hvor det første antistof blev rejst. Salg In situ påvisning af apoptotiske celler blev udført ved anvendelse af in situ Apoptosis Detection Kit (TAKARA BIO INC. Tokyo, Japan). Sættet indeholdt en terminal deoxynukleotidyltransferase-medieret deoxyuridintriphosphat biotin nick endemærkning (TUNEL) analysesystem. Mave sektioner blev permeabiliseret med proteinase K, og 3'-OH ender af DNA fragmenter blev derefter farvet følge instruktionerne, der fulgte med sættet. Kernerne farvede mørkebrun blev anset for at være apoptotiske celler.
RNA-analyse
maver var trimmet og de totale RNA'er blev ekstraheret ved anvendelse af TRIzol (Gibco BRL, Tokyo) ifølge protokollen leveret af producenten. For Northern blot, blev det totale RNA elektroforeret på en 1,0% agarosegel og overført til en nylonmembran (Amersham Pharmacia Biotech, Tokyo). Hybridisering blev udført med en probe af det humane TGFa cDNA (917 bp) mærket med [α- 32P] deoxy-CTP. Denne probe genkender humant TGFa-mRNA, men ikke muse TGF-mRNA.
Mus TGFa mRNA-niveau blev målt ved anvendelse af et tidstro polymerasekædereaktion (PCR) med glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) som en intern kontrol. Den real time PCR blev udført under anvendelse af ABI Prism 7700 Sequence Detector og bløde (Applied Biosystems, Foster City, CA) under anvendelse af DNA-fluorescerende farvestof SYBR Green detektion. Primere blev konstrueret under anvendelse af primeren Express design software (Applied Biosystems). Det endelige resultat for hver prøve blev normaliseret ved den respektive GAPDH værdi. Primersekvenser er som følger: mus TGFa: 5'-CCTGAGCACCCGAAGAT-3 'og 5'-CCTTCCCTCATGCCTTACT-3'; GAPDH: 5'-GTCGTGGATCTGACGTGCC-3 'og 5'-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3'
Western blot-analyse
Gastriske vævsprøver blev trimmet og totalt protein fra maveslimhinden blev homogeniseret i RIPA puffer indeholdende en cocktail af proteaseinhibitorer. (phenylmethylsulfonylfluorid, pepstatin, leupeptin og aprotinin) (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland). Supernatanten blev separeret på en SDS-PAGE-gel, og blev derefter blottet til en polyvinylidendifluoridmembran. Membranen blev probet med de følgende antistoffer: antistoffer mod iNOS, COX-1, COX-2, HSP70, og Bcl-2, som var de samme, som anvendes til morfologiske undersøgelser; muse monoklonalt antistof til Bax (Santa Cruz Biotech.); kanin polyklonalt antistof mod caspase 3 (Santa Cruz Biotech.); og monoklonalt muse-antistof til actinfilamenter (Santa Cruz Biotech.). Antistof-reagerede bånd blev detekteret under anvendelse af et ECL detektionssystem (Amersham, Buckinghamshire, UK).
Måling af gastrin
Serum gastrin blev målt ved anvendelse af et gastrin radioimmunoassay kit (gastrin RIA-kit, Dainabot, Tokyo, Japan). Antistoffet er specifikt for gastrin med en amiddel ved dens carboxylterminus.
Måling af prostaglandin E2
maveslimhinden blev homogeniseret ved 4 ° C i lysisbuffer. Homogenater blev centrifugeret ved 12000 rpm i 20 min, og supernatanterne blev underkastet prostaglandin E 2 assay under anvendelse af et prostaglandin Ei 2 Monoklonalt Enzyme Immunoassay Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), ifølge producentens anvisninger .
Statistisk analyse
Statistisk analyse blev udført ved gentagen foranstaltning variansanalyse (ANOVA) for den samlede længde af de gastriske læsioner ved uparret t-test til gastrisk mucosal blodstrøm fald-forhold. Alle værdier er udtrykt som middelværdi ± SE. P < 0.05 blev accepteret som statistisk signifikant.
Resultater
karakterisering af TGFa-udtrykkende TG mus maveslimhinden
WT CD1 stamme og TGFa-transgen udtrykker MT42 line mus voksede tilsvarende og viste ingen mærkbar forskel i deres funktioner, adfærd eller livslængde. Den største tykkelse observeret for den gastriske væg og fundiske kirtler var 3,50 ± 0,18 mm og 2,33 ± 0,20 mm, henholdsvis i WT-mus, og 3,85 ± 0,24 mm og 2,63 ± 0,16 mm, henholdsvis i Tg-mus; Der var ingen signifikante forskelle i form af mavens slimhinder og kirtler mellem WT og TG-mus. Ud over den normale udseende af maveslimhinden, denne TG muse linje også havde en normalt udseende lever, bugspytkirtel og andre organer.
Vi derefter sammenlignet syresekretion kapacitet mellem WT og Tg mus. I WT-mus, maksimal syreproduktion steg betydeligt fra basisniveauet på 25 ± 1,4 mEq /h og 50 ± 5,8 mækv /h efter pentagastrin stimulation. Derimod i Tg-mus, maksimal syreproduktion øges til et mindre omfang til 30 ± 5,7 mEq /h fra den basale produktion på 23 ± 0,7 mEq /h (n = 5 i WT og TG-mus). Den afstumpet syreproduktionen kan afspejle den reducerede parietalcellerne masse i TG mucosa (figur 1e). Figur 1 Karakterisering af TGFa-udtrykkende TG slimhinde. Skala i hver figur indikerer 100 um. (A) Fordeling af TGFa-udtrykkende celler. Brunfarvet TGFa-positive celler var synlige langs den luminale pit region i WT slimhinde, den langstrakte foveolar pit region, og den nederste tredjedel af glandulær region i TG slimhinde. (B) Overlapning af rød-farvede TGFa-positive celler og grøn-farvet H + /K + -ATPase-positive parietalcellerne. Lavere TGFa-positive celler i klyngen adskiller sig fra de grønne-farvede parietale celler i TG slimhinde. (C) Northern blot af humant TGFa-mRNA og PCR-amplificeret muse TGFa mRNA. Humant TGFa-mRNA udtrykkes i TG mucosa alene (venstre panel), men PCR-amplificeret muse TGFa mRNA udtrykkes på lignende måde i både WT og TG slimhinder (højre panel). (D) Western blot af TGFa mellemformer. TGFa forløber (20 kDa) og dets mellemformer visualiseres mere intensivt i TG slimhinde end i WT slimhinde. (E) Lokalisering af EGF-receptoren i maveslimhinden. EGF-receptor (EGF-R) blev farvet med Cy3 (rød) og H + /K + -ATPase blev farvet med FITC (grøn). EGF-R blev immunfarvet moderat i den øvre pit regionen og stærkt i det nedre glandulær region på samme måde i både WT og TG slimhinder. (F) Fordeling af metallothionein i maveslimhinden. Metallothionein er immunfarvet kraftigt i den nedre glandulær region, og moderat langs foveolar region. (G) Forlængelse af maveregionen af ​​TG slimhinde. PCNA-positive celler er fordelt på det øverste tredjedel region i WT gastriske kirtler, mens de er fordelt mere talrigt og bredt i midten glandulær region. (H) PAS farvning viser aflang grube i TG slimhinde.
Ekspression af TGFa transgen
TGFa-udtrykkende celletyper blev identificeret baseret på celle-typespecifikke immunfarvning og deres slimhinde placering. TGFa blev angiveligt immunfarvet langs GSM celler i maveregionen hos mennesker [14] og rotter [15], og langs den mukøse hals celle region i FVB stamme mus [16]. I den foreliggende undersøgelse blev brunfarvet TGFa-positive celler fordelt langs foveolar region af både WT og TG slimhinder, og langs den nedre glandulær region af TG mucosa (figur 1a). TGFa-positive celler langs foveolar region syntes at være maveregionen celler, baseret ved deres placering (figur 1b, øvre panel), og dem langs den nedre glandulær region af TG slimhinden ikke overlapper med den grønne-farvede H + /K + - ATPase-positive parietalceller (figur 1b, nederste panel), men gjorde overlapper pepsinogen-positive chef celler (data ikke vist). Antistoffet vi brugt til immunfarvning for TGFa kunne ikke skelne mellem mennesker og mus TGFa, men dens mRNA sonde kunne gøre det for Northern blot analyse. Den menneskelige TGFa-transgen blev udtrykt i TG slimhinde mens ingen ekspression blev bemærket i WT slimhinden (figur 1c, venstre panel). I modsætning hertil blev endogene muse TGFa-mRNA tilsvarende udtrykt i både WT og TG slimhinder af real time PCR (figur 1c, højre panel). TGFa er en 50 aminosyre peptid, der opnås ved 160 aminosyre membranspændende precursor spaltes af tumornekrosefaktor-α-omdannende enzym (TACE) [27, 28]. Idet overskuddet ekspression af det humane TGFa-transgen i TG slimhinde, en cirka 20 kDa TGFa precursor og dets mellemformer blev forhøjet ved immunoblotting (figur 1d).
Da både forstadiet og processerede former var lige aktive til stimulering EGF -R [28], vi undersøgt yderligere EGF-R lokalisering i slimhinden. EGF-R blev lokaliseret kraftigt i den nedre ledende celle klynge region og moderat i slimhinderne hals celle-regionen og i foveolar pit region i både WT og TG slimhinder (figur 1e), som tidligere blev rapporteret for rotte gastrisk mucosa [15 ]. Da TGFa transgen blev kontrolleret under muse-metallothionein-genet [20] og metallothionein er blevet rapporteret produceret i maveslimhinden [29], undersøgte vi metallothionein-udtrykkende celletyper i slimhinden. Immunhistokemisk, vi bemærkede metallothionein farvning hovedsagelig langs den nedre glandulær region og scatteringly langs pit område af kontrol CD1-stamme maveslimhinden (figur 1f). Således fordelingen af ​​TGFa-udtrykkende celletyper svarer til den af ​​metallothionein-udtrykkende celler i TG maveslimhinden (figur 1A og 1f). Salg In WT mus slimhinde, H + /K + - ATPase-positive parietalceller blev spredt bredt over glandulær region med undtagelse af den top-pit lag, mens H + /K + - ATPase-positive glandulær region blev reduceret i højden i TG mucosa (figur 1e). Faktisk isthmus ved bunden af ​​gruben regionen, som blev bekræftet ved PCNA farvning, blev flyttet ned til midten af ​​TG mucosa (figur 1g). Desuden var PCNA-positive celler tykt fordelt i midten af ​​slimhinden. Konsekvent blev PAS-farvning-positive foveolar pit aflang i TG mucosa i modsætning til den korte grube i WT mucosa (figur 1 h). Selv højden af ​​maveslimhinden var ens mellem WT og TG slimhinder, blev den proliferative zone flyttet ned og foveolar pit regionen var mere langstrakt med en reduceret glandulær region i TG mocosa. Da væksten af ​​pit celler kraftigt forstærkes af gastrin [25, 30], sammenlignede vi serumgastrin mellem WT og Tg mus, men fandt ingen stigning i niveauerne af serum gastrin i TG mus (WT, 213 ± 41 pg /ml;. TG, 263 ± 47 pg /ml, n = 5, p = 0,438)
ethanol-induceret gastrisk skade i WT og TG muse slimhinder
Orogastric administration af forsuret ethanol (100 pi) forårsaget hæmoragisk skade i TG slimhinden (figur 2a, til venstre). Histologisk skaden skrællet væk fra pit og Isthmus regioner og nåede til midten glandulær region (figur 2b, til venstre). I modsætning hertil den slags skade i TG musen slimhinden var ikke bemærkelsesværdig (figur 2a, højre). Skaden blev histologisk begrænset til den luminale pit region (figur 2b, højre). I WT slimhinde, det skadede område steg hurtigt med en top på 6 timer efter ethanol administration, mens området i TG slimhinden steg langsomt og minimalt uden en markant top (Figur 2c). Konsekvent, apoptotiske celler der vises af TUNEL farvning fordelt dybt til den lavere glandulær region 3 timer efter ethanol administration i WT slimhinde, mens de apoptotiske celler var begrænset til pit-regionen, men ikke strækker sig til glandulær region i TG slimhinden ( Figur 2d). Figur 2 Ethanol-induceret gastrisk skade i mavens slimhinder. (A) Makroskopisk visning af maveslimhinden. Målestok: 5 mm. Begge slimhinder er 6 timer efter ethanol administration. Bemærk, at WT mucosa udviser udbredt hæmorrhagiske læsioner, i modsætning hertil TG mucosa ser ubeskadiget efter ethanol administration. (B) Hematoxylin og eosin-farvning af ethanol-skadet WT mucosa (venstre) og TG mucosa (højre). Bemærk den dybe sårdannelse i WT slimhinde. Skala: 100 um. (C) Tidsforløb for ethanol-induceret gastrisk skade. Skadede område er afbildet mod tid op til 12 timer efter ethanol administration. Hvert punkt repræsenterer gennemsnittet af fem mus. p
< 0,05 (d) TUNEL-farvning af WT mucosa (venstre) og TG mucosa (højre). Begge sektioner er fortløbende til dem i 2B
hhv. Apoptotiske celler er synlige med mørke-brune kerner. Talrige apoptotiske celler, er angivet i WT slimhinde. Alle billeder var 6 timer efter den ethanol administration. Skala:. 100 um
maveslimhinden blodgennemstrømningen i ethanol-behandlede slimhinde
Selv om en række cytobeskyttende regulatoriske faktorer er blevet rapporteret, herunder NO, CGRP, COX2, og HSP70 [12, 13, 31, 32] , slimhinder blodgennemstrømning er blevet foreslået som en primær faktor til beskyttelse og genoprettelse af ethanol-induceret gastrisk skade [1, 33]. Vi målte gastrisk blodstrøm ved at placere en sonde af laseren Doppler flowmeter på maveslimhinden tilgås via en eksponeret bugvæggen i den bedøvede mus. Gastrisk blodgennemstrømning faldt præget af 43,5 ± 6,37% efter ethanolen administration på maveslimhinden af ​​WT mus (figur 3). Derimod er det kun faldt med 17,2 ± 9,21% efter ethanolen administration på TG mucosa (figur 3). Således blev den gastriske blodgennemstrømningen godt vedligeholdt i TG mucosa selv efter ethanol behandling. Da mucosal iskæmi er en af ​​de vigtigste ulcerogene faktorer [33], er opretholdelsen af ​​gastrisk blodstrøm synes at være en væsentlig faktor til mucosal beskyttelse. Figur 3 Vurdering af maveslimhinden blodgennemstrømning i det gastriske slimhinder. Maveslimhinden blodgennemstrømning blev vurderet ved sammenligning af blodgennemstrømningen forholdet før og efter ethanol behandling. Forholdet blev opnået som et procent mod blodstrømmen før behandlingen, som var meget større i WT mucosa end i TG slimhinde. * P
< . 0.03
Angivelse af cytobeskyttende proteiner: NO syntase, COX-2, og HSP70
At udforske den mekanisme af høj blodgennemstrømning vedligeholdelse i TG slimhinde, undersøgte vi ekspressionen af ​​NO syntaser, hvilket gør NO fra arginin, og afslapper vaskulære glatte muskler via cGMP-afhængig proteinkinase [34]. Der er tre typer NO-syntase (NOS): neurale NOS (nNOS), inducerbar NOS (iNOS), og endothelial NOS (eNOS). nNOS og eNOS er konstitutivt udtrykt, mens iNOS induceres ved gastrisk skade [35]. nNOS blev fordelt på lignende måde som PAS-farvning over foveolar pit region (figur 1 g); Det blev observeret over den langstrakte pit af TG slimhinde og var begrænset til den luminale pit af WT slimhinden (figur 4a). eNOS blev svagt spredt over hele mavens slimhinde ligeledes i både WT og TG slimhinder (data ikke vist). INOS-farvning var ubetydelig i WT-mucosa, selv om det var stærkt induceret i den nedre glandulær region efter slimhinden blev udsat for ethanol (figur 4b). I TG mucosa, blev iNOS konstitutivt udtrykt i den nedre glandulær region på samme måde før og efter skaden (figur 4b), som synes at bidrage yderligere til opretholdelse af høj blodgennemstrømning. Figur 4 immunfarvning af NO syntaser i maveslimhinden. Skala: 100 um. (A) nNOS immunfarvning. nNOS var synlig langs pit-regionen, hvilket resulterer i en bredere fordeling langs den langstrakte pit i TG slimhinde. (B) iNOS immunfarvning. iNOS blev induceret i den nedre glandulær region efter ethanol skade i WT mucosa, det konstitutivt blev udtrykt i den samme region af TG mucosa uanset ethanol skade. Salg Prostaglandiner blev foreslået som en vigtig cytobeskyttende faktor mere end tre årtier siden [ ,,,0],8] og deres roller er blevet grundigt undersøgt [36, 37]. Rolle prostaglandin-dannende enzymer, COX-1 og COX-2, har været kontroversiel i mucosal beskyttelse mod gastriske irritanter [7, 11, 32]. Vi undersøgte ekspressionen af ​​COX i WT og TG slimhinder under ethanol skade. Udtrykket af COX-1 afveg ikke mellem WT og TG slimhinder, eller før eller efter ethanol skade (figur 5b). COX-2 var ikke påviselig i WT-slimhinde, men dets ekspression blev tydeligt 6 timer efter ethanol skade, og dets farvning blev lokaliseret til det nedre glandulær region (figur 5a og 5b). I TG slimhinde, COX-2-immunfarvning var intens på samme region selv før skaden og forblev positiv efter skaden (figur 5a). Da Coxs er blevet vist at blive udtrykt i mesenkymale celler såsom fibroblaster og mononukleære celler i maveslimhinden [38], og streptoavidin /biotin /HPR metode undertiden viser falsk-positiv farvning, udførte vi immunfluorescensfarvning ved anvendelse af et frosset snit som bekræftede COX-ekspression på samme måde i den nedre glandulær region af TG mucosa (data ikke vist). Ved immunoblotting, COX-2 steg efter skaden i WT mucosa, hvorimod det var stærkt forhøjede i et tilsvarende omfang før og efter skaden (figur 5b).

• Genom sekvens af Helicobacter suis understøtter sin rolle i gastrisk patologi
• Opregulering af CLDN1 i mavekræft er korreleret med reduceret overlevelse