Integrativni uloge transformirajući faktor-a u citozaštitne mehanizmima želučane ozljede sluznice

Integrativna uloga transformirajući faktor rasta-a u cito-zaštitu mehanizmima želučane sluznice ozljede pregled apstraktne pregled pozadine
transformirajući faktor rasta sadržaj a (TGFa) štiti želučanu ozljede sluznice i olakšava zarastanje rana. Međutim, njegova pretjerana ekspresija se zna da inducira hipertrofičnu gastropatije nalik Menetrierova Bolest u transgenih miševa (TG) na FVB podlozi, kao što je jedan od autora prethodno objavljene. Proučavali smo još TGFa-izražava miša liniju na CD1 pozadini, čiji je želučana sluznica pojavljuje normalno. Budući da je ovo TG miš je imao jaku otpornost na ozljede želuca etanolom inducirana, smatra da dugoročni učinak TGFa na nekoliko mehanizama želučane zaštite.
Metode pregled TGFa-izražavanje transgenični (TG) miš linija koje nose ljudski TGFa cDNA pod kontrolom miša metalotioneina gen i promotor su generirani na CD1 miša pozadini, a analizirani su njihovi etanol ozljeda otporan fenotipova proizvodi TGFa. pregled Rezultati
u TG sluznice, protok krvi te održava se nakon ozljede etanola , Nadalje, živčane i inducibilni vrste NO sintaze dosljedno i široko su izraženi u TG sluznicu, u usporedbi s ograničenom distribuciju neuronske tipa NO sintaze u luminalne pit regije divljeg tipa (WT) sluznice. COX-2 i njegovi uzvodno transkripcijski faktor NfkB su konstitutivno povišena u TG sluznice i prije primjene etanola, dok su inducirani u istoj regiji WT sluznice tek nakon ozljede etanola. Dva antiapoptotski proteini, HSP70 i Bcl-2, regulira prema gore su u TG sluznice i prije primjene etanola, dok oni nisu bili izraženi u WT sluznici prije ozljede. Nadalje, pro-kaspaza 3 aktivacija je spriječeno u TG sluznice, dok se prevede u aktivni oblik u WT sluznicu nakon primjene etanola. Pregled Zaključak pregled Zaključujemo da TGFa održava želučane sluznice obranu od želučanog ozljede integrirajući druge mehanizme zaštite stanice. pregled Pozadina pregled, etanol je odavno koristi za generiranje hemoragijski želučane sluznice ozljede kod glodavaca [1]. Oralno davanje apsolutnog ili klorovodične etanol kiselinom zakiseli se opsežna hemoragične lezije se mogu proizvesti u želučanoj sluznici. Ovaj eksperimentalni želuca ozljede model često se koristi za želučane zaštite za sluznicu i povrata studija. Doista, broj citozaštitna sredstva su testirani bi se procijenila njihova sposobnost in otpor želučane ozljeda, gastrointestinalnih hormona, čimbenika rasta, prostaglandini, bioaktivnim amine i blagim irritants kao kapsaicina [2-5]. Među tim spojevima, epidermalni faktor rasta (EGF), čimbenici rasta obitelj, osobito transformirajući faktor rasta (sadržaj a TGFa), su izvijestili kao potentni citozaštitna sredstva protiv etanol, octena kiselina- ili aspirin induciranog želučanog ozljede [2, 4]. pregled TGFa je izražen u sluznici želuca štakora nakon oralne primjene zakiseli taurokolata ili klorovodičnom kiselinom, sugerirajući njegov reparativnim ulogu u želučanom ozljede [6]. TGFa dan intraperitonealno zaštićen od ozljeda želuca etanolom inducirana sa značajnim povećanjem prijanja želučanoj sluzi u štakorima [7]. Citozaštitnu funkcija TGFa čini se da je posredovana aktivacijom fosfolipaze C-γ1, ali ne i prostaglandina, te je nezavisna o anti-sekretorni učinak TGFa [7]. S druge strane, prostaglandina i njihovih sintetičkih enzima ciklooksigenaze (COX), dugo su predloženi kao citozaštitnu faktora protiv želučanog ozljede [5, 8]. EGF je pokazano da izražavaju inducibilni COX izoforme, COX-2, na želučane sluznice stanične linije RGM1 štakora kroz ERK MAP kinaze [9], a u Swiss 3T3 fibloblasts posebno ko-stimulacije s gastrin [10]. Osim toga, ekspresija COX-2 od strane heparin-vezujući EGF-slični faktor rasta, član EGF obitelji faktora rasta, blokirao je određeno EGF receptor (EGF-R), inhibitor u sluznici želuca štakora [11]. Prema tome, čini se EGF-R signal posredovati COX-2 indukcije u sluznicu želuca.
Najvažnije mehanizme zaštite stanice uključuju želučane sluznice protok krvi. EGF i TGFa se pokazalo se da zaštite stanice učinaka preko stimulacije kapsaicina osjetljivog neurona s oslobađanje gena povezanih peptida kalcitonina (CGRP) i dušičnog oksida (NO) u štakora izloženih orogastric etanol primjene, što dovodi do porasta u želučanoj mukoznoj krvi protok [11, 12]. Nasuprot tome, Konturek et al. minimizirati ulogu CGRP-ovisnim povećanjem želučane krvotoka demonstrirajući da primjena NO-otpuštajući aspirin nudi zaštitu od apsolutnog ulazak želučane etanolom inducirana čak kapsaicina-denervirano štakora, što rezultira u povećanju protein toplinskog šoka 70 (hsp70 ) izraz i gušenja od oksidativnog ozljede jakim ranijim koracima antioksidacijskih gena, kao što su cink bakar superoksid dismutaza (SOD) i glutation peroksidaze [13].
TGFa je imunološki pretežno u GSM stanica uz želučane jami kod ljudi [14], intenzivno u želučanom površine sluznice (GSM) stanica preko proliferativna zone i slabo uz žljezdanog područja pod proliferativna zoni u štakora [15], a izrazito duž stanica regiji sluznice vrata u FVB /N soj miševa [16]. S druge strane, EGF-R je imuno na GSM stanica sluznice foveolar jamu i stanica regiju sluznice vrata do donjeg žljezdanog područja kod ljudi [17]. U štakora, EGF-R je lokaliziran na top-pit regiji iu staničnim nakupinama glavnih pri dnu želučanih žlijezda [15]. Iako TGFa je poznato da potiču proliferaciju stanica u primarnoj kulturan štakora želučanih stanica sluznice [18], i hiperplastične proliferaciju u sluznici na TGFa-izražavanje transgenični (TG) miš [19, 20], distribucija TGFa i EGF-R u terminalno diferenciranim želučane sluznice stanica sugerira da TGFa ispoljava ne-proliferacije funkcije, uključujući protiv apoptoze efektima i epitela formiranje želuca barijera u autokrinog /parakrini način. Na primjer, TGFa inhibiran apoptozu gastričnu sluznicu sa staničnoj liniji miša, GSM06, ekspresijom antiapoptotski obitelji Bcl-2 proteina kroz NF-kB ovisan put [21]. Želuca apikalni i bazolateralne EGF-R je pokazano da inducira pad paracellular permeabilnosti za kiselinu za zaštitu žljezdane stanica u kiselom mediju [18, 22]. Dakle, TGFa pojačava proliferacije i ne-proliferacije učinak na želučane sluznice funkcija, a ove raznolike TGFa učinke treba ponovno vrednovati, barem u smislu da li su njihovi rezultati dobiveni od kratkotrajnog liječenja pomoću kulture stanične linije ili s dugo- izraz izraz koristi TGFa-transgen-izražavanje životinje.
prije deset godina, jedan od autora, H. Takagi, generira TGFa-izražavanje TG miša linije pod kontrolom promotora metalotioneina gena, a jedna od tih linija (MT100) Izloženi hipertrofična gastropatija nalik Menetrierova bolest, kao što je na sličan način pokazuje drugim istražiteljima [19, 20]. Nasuprot tome, drugi TG linija (MT42) nije pokazao normalnu-pojavljuju želučanu sluznicu, ali TGFa Transgen je izražena u sličnog dosega u oba TG linije [20]. Budući da MT42 linija prikazana iznenađujući stupanj otpornosti na etanolom inducirana povrede želučane sluznice, smatra se da to može biti korisno za istraživanje ne-proliferativne učinke TGFa kao sluznice otpornost na ozljedu etanola. U ovom istraživanju, istražuju se dugoročne učinke TGFa na ozljede želuca etanolom inducirana analizirajući promjene u zaštite stanice i protiv apoptoze regulatornih čimbenika, uključujući želučanu protok krvi, NO sintaze, COX-2 i apoptozu povezane proteina takvih kao HSP70, Bcl-2 i kaspaze 3. pregled metoda
TGFa-izražavanje transgenični miš i ozljede želučane etanola izazvanu pregled TGFa-izražavanje transgenih (TG) miš linija koje nose ljudski TGFa cDNA pod kontrolom miš metalotioneina gen sam promotor je generiran na CD1 ili FVB miša pozadini, kao što je ranije [20] što je opisano. Jedan od TG linija MT100 na FVB miša pozadini prikazan hipertrofičnu gastropatije nalik Menetrierova Bolest [20], a s druge linije, MT42 na CD1 miša pozadini, nije pokazao normalnu-pojavljuju želučane sluznice. Fenotip TGFa-TG miša pojavio ovisi o soju miša, jer su i MT100 i MT42 linija izrazio sličnu razinu TGFa transgena u želucu [20]. U ovom istraživanju, koristili smo MT42 liniju TGFa-izražavanje TG muških miševa i CD1 divlji tip (WT) mužjaka miševa u dobi od 6 do 8 tjedana. Životinje su držane pod kontroliranim svjetla (od 7:00 do 7:00) s hranom i vodom ad libitum
.
Miševa težine 30-35 g, izgladnjivani su 24 h prije eksperimenta, ali je omogućen slobodan pristup vodi. Svi eksperimentalni postupci utječu na miševima su odobreni od strane njegu životinja i koristiti pregled odbor na Sveučilištu u Gunma. Miševi su zatim dana orogastric zakiseljeni etanol (100 ul, 60% etanol u 0,15 mol /L HCl). Tri, šest i dvanaest sati nakon zakiseljeno etanola uprave miševi su žrtvovani za ocjenu želučane ozljede i imunohistokemijska analiza, kao i za RNA i ekstrakciju proteina za realnom vremenu PCR, Sjeverna i Western blot analize.
Fizioloških studija
izlučivanja želučane kiseline je mjerena kao što je prethodno opisano [20, 23]. Ukratko, WT i TG miševi su izgladnjivani 3 sata, a zatim se anesteziraju s eterom. Nakon incizije trbušnu stijenku, pyrolus se veže, a rez je zašivena. Želučani sok je sakupljen 4 h nakon pyrolus podvezivanja. Za izlaz maksimalne kiseline lučenja kiseline stimuliran je injektiranjem potkožno pentagastrina (500 ug /kg tjelesne težine). Želučani sok se titrira s 0,1 N NaOH na pH 7,0 pomoću microtitrator.
Želučanom protok krvi za sluznicu je mjeren laser Doppler mjeračem protoka (Model SFA211, Advance Co., Tokyo) stavljanjem sonde na površini želučanih sluznice, kao što je opisano [24]. Signal protoka je praćena s programom MacLab snimanje. Protok krvi je izražena u odnosu na bazalne razine.
Morfološke studije
Debljina sluznice želuca izmjerena je od najvišeg dijela prema dnu žlijezda s mikrometra. Slično tome, želučani ozljeda lezije su mjerene (širina i dužina) mikrometrom se izračunao ozlijeđeno područje.
Za imunološko, dobili smo antitijela kao što slijedi. Poliklonska antitijela H + /K + - ATPaze dobiven ubrizgavanjem frakcije zec parijetalni stanicama mikrozozomalnih u miševe [25]. Zec poliklonska antitijela na metalotionein bio poklon Dr. Nagamine, Gunma fakulteta Sveučilišta Health Sciences [26]. kupili smo antitijela kao što slijedi: zečjeg poliklonalnog antitijela TGFa, zečjim poliklonalnim protutijelom protiv EGF-R, kozje poliklonsko protutijelo na COX-2, zečjeg poliklonskog protutijela na NFκB i mišje monoklonsko antitijelo na nNOS i iNOS od Santa Cruz Biotech. (Santa Cruz, CA); mišje monoklonsko protutijelo u proliferativnu-stanice nuklearnog antigena (PCNA) od Zymed Lab. (South San Francisco, CA); Ovce antitijela na ljudski pepsinogen II iz biopur AB (Bubendorf, Švicarska), koji također reagira na miša pepsinogen; Zečje poliklonalno protutijelo HSP70 s stress Biotech. (Victoria, BC, Kanada); i mišje monoklonsko antitijelo Bcl-2 iz BD Biosciences (San Diego, CA). pregled za peroksidazom hrena (HRP) -catalyzing imunohistokemijsko bojenje, mljeveno želuci su fiksirani u neutraliziranom 10% formalinu na 4 ° C tijekom 24 sati, i zatim je u parafin za mikrotoma sekcioniranje. Sekcije tkiva su deparafmizirani rehidrirane i inkubirani su u 3% otopina vodikovog peroksida za inhibiciju Aktivnost endogene peroksidaze. Zatim su sekcije su inkubirane s prvim protutijelom prethodno opisanom odgovarajućim razrjeđivanjem na sobnoj temperaturi 30 min. Sekundarni biotiniliranog antitijela je izabran na osnovu prve životinjskim vrstama koje proizvode antitijela, a zatim se koristi s HRP-streptavidinom konjugiranim. HRP reakcija je provedena s 3-amino-9-etil-karbazola i vodikovog peroksida u skladu s uputama isporučenim uz streptavidin-biotin bojenje Vectastatin Elite Kit (vektori Laboratories, Burlingame, CA). Pozitivni stainings pojavio smeđe boje.
Za imunoflorescentnom bojanju, mljeveno želuci su fiksirane u 4% paraformaldehidu u 0,1 M fosfatnom puferu, pH 7,4 pri 4 ° C tijekom 24 sata. Mali komadi mljevenog tkiva prošao saharozu zamjenu te su ugrađena u OCT-spoju u pripremi za smrznutom dijelu pomoću microtome. Za primarnu immunoreaction, narezane sekcije su ispitane s prvim antitijelom, a nakon toga su inkubirani ili s indodicarbocyanide (Cy3) konjugirano afinitetno pročistiti magarećim anti-zečjeg, anti-mišji IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), ili fluorescein izotiocijanat (FITC) -označeni anti-zečjeg IgG (Jackson ImmunoResearch) kao sekundarnim antitijelom. IgG sekundarnog antitijela je odabran na temelju vrste na kojem je podignuta prva antitijela.
In situ detektiranje apoptotičnih stanica je izvedena pomoću in situ Detection Kit apoptoze (TAKARA BIO INC. Tokyo, Japan). Kit je sadržavala terminala deoksinukleotidil transferaze posredovane deoksiuridin trifosfat biotin nick kraj označavanje (TUNEL) test sustava. Želudac sekcije su natopljeni s proteinazom K, i 3'-OH završava DNA fragmenti su zatim obojene u skladu s uputama u kompletu. Jezgre obojeni tamno smeđe su smatrali da su apoptotične stanice. Pregled, analiza RNA pregled želuci su obrubljen a ukupna RNA se ekstrahira pomoću Trizol (Gibco BRL, Tokyo) prema protokolu koji je preporučio proizvođač. Za Northern blot, ukupna RNA je elektroforezi na agaroznom gelu 1,0% te je prenijeta u najlonsku membranu (Amersham Pharmacia Biotech, Tokyo). Hibridizacija je provedena sa sondom humanog TGFa cDNA (917 bp) je označena s [a- 32P] deoksi-CTP. Ta sonda prepoznaje humani TGFa mRNA, ali ne mišji TGF mRNA. Pregled Mouse TGFa mRNA razina je mjerena korištenjem lančane reakcije polimeraze u realnom vremenu (PCR) pomoću gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) u internom kontrolom. U realnom vremenu provedena je PCR rabeći ABIPRISM 7700 Sequence Detector i meke (Applied Biosystems, Foster City, CA) korištenjem DNA fluorescentnom bojom SYBR Green otkrivanje. Klice su konstruirane pomoću dizajn softver Primer Express (Applied Biosystems). Konačni rezultat za svaki uzorak se normalizira odgovarajuće GAPDH vrijednosti. Nizovi primera su kao što slijedi: miš TGFa: 5'-CCTGAGCACCCGAAGAT-3 'i 5'-CCTTCCCTCATGCCTTACT-3'; GAPDH: 5'-GTCGTGGATCTGACGTGCC-3 'i 5'-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3' pregled Western blot analiza pregled uzorci želučane tkiva se skratiti i ukupni protein od želučane sluznice je homogenizirana u RIPA puferu koji sadrži koktel inhibitora proteaze. (fenilmetilsulfonil fluorida, pepstatina, leupeptina i aprotinina) (Roche Diagnostics, Mannheim, Njemačka). Supernatant odvojen na gel SDS-PAGE, i onda je bugaćen na polivinilidenfluorid membrane. Membrana je bila ispitana sa sljedećim antitijelima: antitijela iNOS, COX-1, COX-2, HSP70 i Bcl-2, koji su isti kao oni koji se koriste za morfološkim istraživanjima; mišje monoklonsko antitijelo Bax (Santa Cruz Biotech.); Zečje poliklonalno protutijelo kaspaze 3 (Santa Cruz Biotech.); i mišje monoklonsko antitijelo aktinska vlakna (Santa Cruz Biotech).. Protutijela reagira vrpce su detektirane korištenjem detekciju ECL (Amersham, Buckinghamshire, UK). Pregled Mjerenje gastrin
Serum gastrina je mjerena korištenjem seta radioimunih pokusa (gastrin gastrin RIA kompleta, Dainabot, Tokyo, Japan). Što je protutijelo specifično za gastrina s amidnom skupinom u svom karboksilnom kraju, pregled Mjerenje prostaglandin E2
želučane sluznice je homogeniziran na 4 ° C u puferu za lizu. Homogenati su centrifugirani na 12000 rpm tijekom 20 minuta, a supernatanti su podvrgnuti prostaglandin E 2 testu korištenjem prostaglandin E 2 Monoclonal enzimskog pribora za imunoesej (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) prema uputama proizvođača . pregled, Statistička analiza pregled, Statistička analiza provedena je od strane ponovljena mjerenja analizom varijance (ANOVA) za ukupne dužine od želučanih lezija strane t-test za želučane smanji protok omjer za sluznicu krvi. Sve vrijednosti su izraženi kao srednja vrijednost ± SE. P < 0.05 je prihvaćena kao statistički značajna.

• Genom Helicobacter suis podržava svoju ulogu u želučanom pathology
• Up-regulaciju CLDN1 kod raka želuca je u korelaciji sa smanjenim survival