Integrative szerepei a transzformáló növekedési faktor-α a citoprotekció mechanizmusok gyomornyálkahártya injury

Integrative szerepei a transzformáló növekedési faktor-α a citoprotekció mechanizmusok gyomornyálkahártya sérülés
Abstract
alapon
transzformáló növekedési faktor α (TGFa) véd a gyomor nyálkahártya sérülések és elősegíti a sebgyógyulást. Azonban a overexpressziója ismert, hogy indukálja hipertrófiás gyomorbaj hasonlító Ménétrier kór transzgenikus (TG) egereket egy FVB háttér, mint az egyik a szerzők korábban jelentett. Vizsgáltuk egy TGFa-t expresszáló egér vonal egy CD1 háttér, akinek gyomornyálkahártya normálisnak tűnik. Mivel ez a TG egér volt egy erős ellenállás etanollal kiváltott gyomor sérülés, figyelembe vettük a hosszú távú hatása TGFa több gyomor védelmi mechanizmusok.
Módszerek
TGFa-t expresszáló transzgén (TG) egér vonalakat, amelyek humán TGFa cDNS szabályozása alatt az egér metallotionein-gén-I-promótert állítottunk elő a CD1 egér háttér, és elemezték etanol sérülés-rezisztens fenotípusok által termelt TGFa.
eredménye
a Tg nyálkahártya, a vér áramlását jól karbantartott után etanol sérülés . További, neurális és indukálható típusú NO-szintázok következetesen és széles körben expresszálódik a TG nyálkahártya, szemben a korlátozott forgalmazási neurális típusú NO-szintáz luminális gödör régióban a vad típusú (WT) nyálkahártyáját. A COX-2 és annak upstream transzkripciós faktor NFkB arra konstitutívan emelkedett a TG nyálkahártyában, még mielőtt az etanol beadása, mivel ezeket indukált ugyanabban a régióban a WT nyálkahártya csak azután etanol sérülést. Két antiapoptotikus fehérjék, HSP70 és a Bcl-2, arra serkentett a Tg nyálkahártyában, még mielőtt az etanol beadása, míg azokat nem expresszálódik a WT nyálkahártyában a sérülés előtt. Továbbá, a pro-kaszpáz 3 aktiválását gátoltuk a Tg nyálkahártyájában, míg azt alakul át aktív formában a WT nyálkahártya következő etanol adagolásra.
Következtetés
Arra a következtetésre jutottunk, hogy a TGFa fenntartja a gyomornyálkahártya elleni védelem gyomor sérülések által integráló egyéb citoprotektív mechanizmusok.
alapon
etanol már régóta használják, hogy létrehoz egy vérzéses gyomor nyálkahártya sérülése rágcsálókban [1]. Orális beadás az abszolút vagy sósav-savanyított etanol, kiterjedt vérzéses károsodások állítható elő a gyomor nyálkahártyáját. Ez a kísérleti gyomor sérülés modell már eddig is gyakran használják a gyomor nyálkahártya védelmére és a kárpótlás tanulmányokat. Valóban, számos citoprotektív vegyületek már tesztelték, hogy értékeljék a potencia ellenállni a gyomor sérülések, beleértve a gasztrointesztinális hormonok, növekedési faktorok, prosztaglandinok, bioaktív aminok, és enyhe irritáló anyagok, mint például a kapszaicin [2-5]. Ezek közül a vegyületek, az epidermális növekedési faktor (EGF) család növekedési faktorok, mint például a transzformáló növekedési faktor α (TGFa), számoltak be, mint potens citoprotektív vegyületek ellen etanol-, ecetsav sav-, vagy aszpirin által kiváltott gyomor sérülés [2, 4].
TGFa fejeztük a patkány gyomornyálkahártya orális beadása után savanyítjuk taurokolát vagy sósav, ami arra utal, hogy reparatív szerepet gyomor sérülés [6]. TGFa intraperitoneálisan adott védeni etanollal kiváltott gyomor sérülés jelentős növekedése adherens gyomor mucin patkányokban [7]. A citoprotektív funkcióját TGFa tűnt, hogy közvetíti a foszfolipáz C aktiválását-γ1, de nem a prosztaglandinok, és független volt az anti-szekréciós hatását TGFa [7]. Másrészt, prosztaglandinok és azok szintetikus enzim, a ciklooxigenáz (COX), már régóta javasolták sejtvédő tényezők ellen gyomor sérülés [5, 8]. EGF kimutatták, hogy kifejezze egy indukálható COX izoforma, a COX-2, a RGM1 patkány gyomornyálkahártya sejtvonal keresztül ERK MAP kináz útvonal [9], és Swiss 3T3 fibloblasts, különösen ko-stimuláció gasztrin [10]. Továbbá, a COX-2-expresszió által heparinkötő EGF-szerű növekedési faktor, tagja az EGF család növekedési faktorok, a blokkolt egy specifikus EGF receptor (EGF-R) inhibitor a patkány gyomor nyálkahártya [11]. Így az EGF-R-jel jelenik meg, hogy közvetítsen a COX-2-indukció a gyomor nyálkahártyáját.
A legfontosabb citoprotektív mechanizmusok közé tartozik a gyomor nyálkahártya a vér áramlását. EGF és TGFa kimutatták, hogy gyakoroljon sejtvédő hatását keresztül stimulálása kapszaicin-érzékeny neuronok felszabadulását kalcitonin gén-rokon peptid (CGRP) és a nitrogén-oxid (NO) kitett patkányok orogastric etanol beadása, ami a növekedését gyomornyálkahártya vér áramlás [11, 12]. Ezzel szemben, a Konturek et al. minimalizált a szerepe a CGRP-függő növekedése gyomor véráramlás, bizonyítva, hogy az adminisztráció a NO-t szabaddá aszpirin kínált elleni védelem abszolút etanollal kiváltott gyomor sérülések még a kapszaicin-denervált patkányokban, ami a upregulációja hősokk protein 70 (Hsp70 ) expressziója és csillapítása oxidatív sérülés erős túlszabályzását antioxidatív gének, mint például a cink-réz szuperoxid-dizmutáz (SOD) és glutation-peroxidáz [13].
TGFa-t immunfestést túlnyomórészt GSM sejtek mentén a gyomor gödör emberben [14], intenzíven gyomor felületi nyálkahártya (GSM) sejtek felett proliferatív zóna és gyengén mentén mirigyes régió alatt a proliferatív zónában patkányokban [15], és jelentősen mentén a nyálkahártya nyak sejt régió FVB /N törzs egerekben [16]. Másrészt, az EGF-R-t immunfestett GSM sejtek bélés a foveolar gödör és nyálkahártya nyak sejt régióban, hogy az alsó mirigyes régió emberben [17]. Patkányoknál EGF-R-t lokalizált felső-pit régióban, valamint a fő sejtcsoportok alján a gyomor mirigyek [15]. Bár a TGFa ismert, hogy indukálja a sejtproliferációt primer-tenyésztett patkány gyomor nyálkahártya-sejtek [18] és hyperplasiás proliferáció a nyálkahártyában a TGFa-t expresszáló transzgén (TG) egér [19, 20], a forgalmazás TGFa és az EGF-R- a véglegesen differenciálódott gyomornyálkahártya-sejtek arra utal, hogy TGFa fejt ki nem proliferatív funkcióit, beleértve az anti-apoptotikus hatások és gyomornyálkahártya barrier kialakulását autokrin /parakrin módon. Például, TGFa gátolta apoptózist egy egér gyomornyálkahártya sejtvonal, GSM06, kifejezni antiapoptotikus Bci-2 családba tartozó proteinek keresztül NF-kB-függő útvonalat [21]. Gyomor apikális és bazolaterális EGF-R kimutatták, hogy indukálja csökkenését paracelluláris permeabilitást sav védelmére vonatkozó mirigyes sejtek savas környezetben [18, 22]. Így TGFa fejt ki mind a proliferatív és nem-proliferatív hatása a gyomor nyálkahártya funkciók, és ezek a különféle TGFa hatások újra kell értékelni, legalábbis a szempontból, hogy azok az eredmények olyan rövid távú kezelésére használja sejtvonalak vagy hosszú kifejezés kifejezés használatával TGFa-transzgén-expresszáló állatok.
egy évtizeddel ezelőtt, az egyik szerző, H. Takagi generált TGFa expresszáló TG egérvonalakban ellenőrzése alatt a metallotionein promóter, és az egyik ezek a vonalak (MT100) kiállított hipertrófiás gyomorbaj hasonlító Ménétrier-kór, ahogy hasonlóan mutatja más kutatók [19, 20]. Ezzel szemben, a másik TG vonal (MT42) jelenik meg egy normálisnak tűnő gyomor nyálkahártya, bár TGFa transzgén fejeztük hasonló mértékben mindkét TG vonalak [20]. Mivel az MT42 vonal jelenik meglepő szintű rezisztenciát etanol-indukált kárt a gyomor nyálkahártya, úgy gondoltuk, hogy ez lehet hasznos, hogy felfedezzük a nem proliferatív hatásait TGFa, mint a nyálkahártya ellenállása, hogy etanol sérülést. A jelen tanulmányban azt vizsgáltuk, hosszú távú hatásai TGFa etanollal kiváltott gyomor sérülés elemzésével változások citoprotektív és anti-apoptotikus szabályozó faktorok, beleértve a gyomor a véráramlás, NO-szintáz, a COX-2, és az apoptózis-asszociált proteinek, például mint HSP70, Bcl-2, és a kaszpáz 3
módszerek
TGFa-t expresszáló transzgenikus egér és etanollal indukált gyomorfekély sérülés
TGFa-t expresszáló transzgén (TG) egér vonalakat, amelyek humán TGFa cDNS ellenőrzése alatt a egér metallotionein-gén-I-promótert hoztunk létre egy CD1 vagy FVB egér háttér, a korábban leírtak szerint [20]. Az egyik TG vonalak, MT100 egy FVB egér háttér, megjelenik hipertrófiás gyomorbaj hasonlító Ménétrier-kór [20], míg a másik vonalat, MT42 a CD1 egér háttér, megjelenik egy normálisnak tűnő gyomor nyálkahártyáját. A fenotípus a TGFa-TG egér megjelent függ egértörzsként, mert mind a MT100 és MT42 vonalak kifejezett hasonló szintű a TGFa transzgén a gyomorban. [20] A jelen tanulmányban alkalmazott az MT42 vonal TGFa-t expresszáló TG hím egereket és vad CD1 típusú (WT) hím egerekben korosztály 6-8 hét. Az állatokat tartottuk szabályozott fény (7:00-07:00) tartottuk, táplálék és víz ad libitum katalógusa.
A egerek testtömege 30-35 g éheztettünk 24 órán a kísérlet előtt, de hagytuk szabadon hozzáfértek vízhez. Minden vizsgálati eljárást érintő egereket jóvá Animal Care and Use felülvizsgálati bizottság a Gunma Egyetemen. Az egereket ezután adott orogastric megsavanyítjuk etanolban (100 ul; 60% etanol 0,15 mol /l HCl). Három, hat és tizenkét óra után a savanyított etanol beadása az egereket leöltük értékeléséhez gyomor sérülések és immunhisztokémiai elemzések, valamint az RNS és fehérje extrakció valós idejű PCR-rel, Northern és Western-blot-analízissel.
Élettani vizsgálatok
Gyomorsav-szekréció mértékét a korábban leírt [20, 23]. Röviden, a WT és a TG egereket éheztettük 3 órán, majd éterrel érzéstelenítünk. Miután a metszést a hasi fal, a pyrolus ligáltuk, és a bemetszést összevarrjuk. A gyomornedvvel összegyűjtjük 4 óra után pyrolus lekötés. A maximális savtermelést, savkiválasztás stimuláltuk befecskendezésével pentagasztrin szubkután (500 ng /kg testtömeg). A gyomornedvvel titráltuk 0,1 N nátrium-hidroxiddal pH = 7,0 használva microtitrator.
Gyomor nyálkahártya véráramlását mértük lézer Doppler áramlásmérő (modell SFA211, Advance Co., Tokió) azáltal, hogy egy szondát a felszínen a gyomor nyálkahártyájában, a korábban leírtak szerint [24]. Az áramlási jel követtük nyomon a MacLab felvételi programot. A vér áramlását fejeztük viszonyítva a bazális szint.
Morfológiai vizsgálatok
A vastagság a gyomornyálkahártya mértük a legmagasabb rész, hogy az alján a mirigy egy mikrométerrel. Hasonlóképpen, a gyomor sérülés léziók mértük (szélesség és hosszúság) egy mikrométer kiszámításához a sérült terület.
Pre immunfestést, megkaptuk antitesteket a következők szerint. Poliklonális antitest H + /K + - ATP-áz kaptuk injektálásával nyúl parietalis sejt-mikroszomális frakciókat egerekbe [25]. Nyúl poliklonális antitest metallothionein ajándéka volt Dr. Nagamine, Gunma Egyetem Egészségtudományi [26]. Mi vásárolt antitestek a következők: nyúl poliklonális antitest TGFa, nyúl poliklonális antitest az EGF-R, kecske poliklonális antitest a COX-2, nyúl poliklonális antitest NFkB, és az egér monoklonális antitest nNOS és iNOS Santa Cruz Biotech. (Santa Cruz, CA); egér monoklonális antitest a proliferatív-sejt nukleáris antigén (PCNA) ebből Zymed Lab. (South San Francisco, CA); juh anti-humán pepszinogén II származó biopur AB (Bubendorf, Svájc), amely szintén reagál egér pepszinogén; nyúl poliklonális antitest HSP70 származó Stressgen Biotech. (Victoria, BC, Kanada); és egér monoklonális antitest a Bcl-2 a BD Biosciences (San Diego, CA).
Pre torma-peroxidáz (HRP) -catalyzing immunhisztokémiai festéssel, darált gyomrokat fixáltuk semlegesítjük 10% -os formalin 4 ° C-on 24 órán át, és ezután paraffinba ágyaztuk a mikrotom szakaszolási. A paraffint szöveti metszeteket rehidratált és inkubáltuk 3% -os hidrogén-peroxid-oldatot, hogy gátolják az endogén peroxidáz aktivitást. Ezután a metszeteket egy első ellenanyag a fent leírt megfelelő hígítása szobahőmérsékleten 30 percig keverjük. Egy másodlagos biotinilált antitestet választották alapján az első antitest-termelő fajokra, és ezután használt HRP-konjugált sztreptavidinnel. A HRP reakciót 3-amino-9-etil-karbazolt és a hidrogén-peroxid az utasítások szerint kaptuk meg a sztreptavidin-biotin-festéssel Vectastatin Elite Kit (Vektorok Laboratories, Burlingame, CA). Pozitív festés megjelent barna színű.
Pre immunofluoreszcens festéssel, darált gyomrokat fixáltuk 4% paraformaldehidet tartalmazó 0,1 M foszfát-puffer, pH = 7,4, 4 ° C-on 24 órán át. Kis darab darált szövet ment szacharózt csere és arra OCT-vegyület előállítására irányuló fagyasztott metszet segítségével mikrotóm. Az elsődleges immunreakció, szeletelt metszeteket próbaként egy első ellenanyagot, és ezután inkubáltuk akár indodicarbocyanide (Cy3) konjugált affinitás-tisztított szamár anti-nyúl, anti-egér IgG-t (Jackson Immuno, West Grove, PA), illetve fluoreszcein izotiocianát (FITC) jelzett anti-nyúl IgG-t (Jackson Immuno), mint másodlagos antitesttel. A másodlagos antitest IgG alapján választottuk ki a faj, amelyen az első ellenanyag-ra emeljük.
In situ detektálására az apoptotikus sejtek alkalmazásával hajtottuk végre in situ apoptózis Detection Kit (Takara Bio INC. Tokió, Japán). A készlet tartalmaz egy terminális dezoxinukleotidil transzferáz által közvetített dezoxiuridin-trifoszfát biotin nick végjelölés (TUNEL) mérési rendszer. Gyomor metszeteket permeabilizáltuk proteináz K-val, és a 3'-OH véget ér a DNS-fragmenseket azután festettük utasításait követve a készlethez mellékelt. A sejtmagokat festett sötétbarna tekintettük apoptotikus sejteket.
RNS-analízis
gyomrukat díszítve, és a teljes RNS-eket kivontuk TRIzol (Gibco BRL, Tokió) protokoll szerint, a gyártó által. A Northern-blot, a teljes RNS-t elektroforézisnek 1,0% -os agaróz gélen és átvisszük egy nylon membránra (Amersham Pharmacia Biotech, Tokió). Hibridizációt végeztünk egy szondát a humán TGFa cDNS-t (917 bp) jelölt [α- 32P] dezoxi-CTP. Ez a szonda ismeri emberi TGFa mRNS, de nem egér TGF-mRNS.
Egér TGFa mRNS szintje mértük egy valós idejű polimeráz láncreakció (PCR) A gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH), mint belső kontroll. A valós idejű PCR alkalmazásával végeztük az ABI Prism 7700 Sequence detector és lágy (Applied Biosystems, Foster City, CA) a DNS fluoreszcens festék SYBR Green detektálás. Primereket terveztünk a Primer Express tervező szoftver (Applied Biosystems). A végeredmény az egyes minták normalizáltuk a megfelelő GAPDH értéket. A primer szekvenciák a következők: egér TGFa: 5'-CCTGAGCACCCGAAGAT-3 'és 5'-CCTTCCCTCATGCCTTACT-3'; GAPDH: 5'-GTCGTGGATCTGACGTGCC-3 'és 5'-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3'.
Western blot analízis
Gyomor szöveti mintákat díszítve és a teljes fehérjét a gyomornyálkahártya homogenizáltuk RIPA-pufferben tartalmazó koktél proteázinhibitorok (fenil-metil-fluorid, pepsztatin, leupeptin és aprotinin) (Roche Diagnostics, Mannheim, Németország). A felülúszót elválasztottuk SDS-PAGE gél, és ezután blottoltuk egy polivinilidén-difluorid membránra. A membránt próbaként a következő antitestek: antitestek iNOS, a COX-1, COX-2, HSP70, és a Bcl-2, amelyet ugyanazok voltak azok, használt morfológiai vizsgálatok; egér monoklonális antitest Bax (Santa Cruz Biotech.); nyúl poliklonális antitest kaszpáz-3 (Santa Cruz Biotech.); és egér monoklonális antitest aktin (Santa Cruz Biotech.). Az antitest-reagált sávokban detektáltuk felhasználásával ECL detektáló rendszer (Amersham, Buckinghamshire, Egyesült Királyság).
Mérése gasztrin katalógusa szérum gasztrin mértük egy gasztrin radioimmunoassay kit (gasztrin RIA kit, Dainabot, Tokió, Japán). Az antitest specifikus gasztrin egy amid-csoport, karboxil terminálisán.
Mérése a prosztaglandin E2
gyomornyálkahártya homogenizáltuk 4 ° C-on lízispufferben. Homogenizátumot centrifugáltuk 12000 rpm-en 20 percen keresztül, és a felülúszót vetettük alá prosztaglandin-E 2 assay alkalmazásával prosztaglandin-E 2 monoklonális Enzyme Immunoassay Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) szerint a gyártó utasításai .
Statisztikai analízis
Statisztikai analízist végeztünk ismételt intézkedés varianciaanalízist (ANOVA) a teljes hossza a gyomor sérülések által párosítatlan t-teszt gyomornyálkahártya véráramlás csökkenés aránya. Minden érték kifejezve átlag ± SE. P < 0,05 fogadtuk el statisztikailag szignifikánsnak. Katalógusa eredményei katalógusa jellemzése TGFa-t expresszáló TG egér gyomornyálkahártya katalógusa A WT CD1 törzs és TGFa-transzgén kifejező MT42 vonal egerek nőtt hasonlóan, és nem mutattak észrevehető különbséget azok jellemzőit, viselkedés, vagy élettartamuk. A legnagyobb vastagsága megfigyelhető a gyomor fal és fundus mirigyeket 3,50 ± 0,18 mm, és 2,33 ± 0,20 mm-es, illetve a WT egerekben, és 3,85 ± 0,24 mm, és 2,63 ± 0,16 mm-es, illetve a Tg egerek; nem voltak szignifikáns különbségek az alakja a gyomor nyálkahártyája és a mirigyek között a WT és a Tg-egerekben. Amellett, hogy a normális megjelenés a gyomornyálkahártya, ez a TG egér vonal is volt egy normálisnak tűnő máj, hasnyálmirigy, és más szerveket.
Ezután képest savkiválasztás kapacitás között a WT és a Tg-egerekben. A WT egerekben maximális savtermelés jelentősen nőtt alapszintű 25 ± 1,4 mmol /h-ról 50 ± 5,8 mmol /h után a pen stimuláció. Ezzel szemben, a Tg egerek maximális savtermelés emelkedett kisebb mértékben, hogy 30 ± 5,7 mEq /h A bazális kimeneti 23 ± 0,7 mEq /óra (n = 5 a WT és a TG egerek). A tompa végű savtermelést tükrözheti a redukált parietális sejtek tömege a TG nyálkahártya (ábra 1e). 1. ábra jellemzése A TGFa-t expresszáló TG nyálkahártyáját. Scale minden ábra jelzi 100 nm. (A) megoszlása ​​TGFa-t expresszáló sejtekben. Barna színű TGFa-pozitív sejtek voltak láthatók mentén a luminális gödör régió a WT nyálkahártyájában, a hosszúkás foveolar gödör régiót, és az alsó egyharmada a mirigyes régió a TG nyálkahártyát. (B) az átfedés vörös színű TGFa-pozitív sejtek és a zöld színű H + /K + -ATP-áz-pozitív parietális sejtekben. Alsó TGFa-pozitív sejtek klaszter elkülönül a zöld színű parietális sejtek a TG nyálkahártyát. (C) Northern-blot humán TGFa mRNS és a PCR-amplifikált egér TGFa mRNS-t. Emberi TGFa mRNS expresszálódik a Tg nyálkahártya önmagában (baloldali panel), de a PCR-amplifikált egér TGFa mRNS expresszálódik Hasonlóképpen mind a WT és a TG nyálkahártyák (jobb panel). (D) a Western-blotot, TGFa köztes formák. TGFa prekurzor (20 kDa) és köztes formákat láthatóvá intenzívebben TG nyálkahártya, mint a WT nyálkahártyát. (E) lokalizálása EGF receptor, a gyomor nyálkahártyáját. EGF receptor (EGF-R) oldattal megfestettük, Cy3 (piros) és a H + /K + -ATPáz-t FITC (zöld). EGF-R-t immunfestett mérsékelten a felső gödör régióban, és erősen az alsó mirigyes régió Hasonlóképpen mind a WT és a TG nyálkahártyák. (F) eloszlásának metallotionein a gyomor nyálkahártyáját. Metallotionein van immunológiailag erősen az alsó mirigyes régió és mérsékelten mentén foveolar régióban. (G) A megnyúlás a gyomor gödör a TG nyálkahártyáját. PCNA-pozitív sejtek vannak elosztva a felső harmada régió WT gyomor mirigyek, mivel ezek elosztását számosan és nagyjából a közepén mirigyes régióban. (H) PAS-festéssel mutatja hosszúkás gödröt a TG nyálkahártyát. Katalógusa kifejezése TGFa transzgén katalógusa TGFa expresszáló sejt-típus alapján azonosítottuk sejttípus-specifikus immunhisztokémiai és nyálkahártya helyen. TGFa állítólag immunfestést mentén a GSM-sejtek a gyomor gödör emberben [14] és patkányokban [15], és ezzel együtt a nyálkahártya nyak sejt régió az FVB törzs egerekben [16]. A jelen vizsgálatban, barna színű TGFa-pozitív sejteket mentén elosztva foveolar régió mind a WT és a TG nyálkahártyák, és ezzel együtt az alsó mirigyes régió a TG nyálkahártya (1a ábra). A TGFa-pozitív sejtek mentén foveolar régió tűnt gyomor pit sejtek alapján a helyük (1b ábra, felső panel), és azok mentén az alsó mirigyes régiójában TG nyálkahártya nem átfedésben a zöld színű H + /K + - ATPáz-pozitív parietális sejtek (1b ábra, alsó panel), de nem átfedésben a pepszinogén-pozitív legfőbb sejtekben (adatokat nem mutatjuk). Az antitest esetében alkalmazott immunfestés TGFa nem tudott különbséget tenni a humán és az egér TGFa, de mRNS-szonda lehetne megtenni a Northern blot analízissel. Az emberi TGFa-transzgén kifejezett TG nyálkahártya miközben nincs kifejezés mutatkozott a WT nyálkahártya (1c ábra, bal panel). Ezzel szemben az endogén egér TGFa mRNS hasonlóan kifejezett mind a WT és TG nyálkahártyák real time PCR (1c ábra, jobb panel). TGFa egy 50 aminosavból álló peptid, származik a 160 aminosav membrán-áthidaló prekurzor hasítja a tumor nekrózis faktor-α-konvertáló enzim (TACE) [27, 28]. A többlet kifejezése az emberi TGFa-transzgén a TG nyálkahártya, egy körülbelül 20 kDa TGFa prekurzor és annak köztes formák fokozott immun (1D).
Mivel mind a prekurzor és a feldolgozott formája egyformán aktív stimuláló EGF -R [28], azt vizsgálták tovább, EGF-R lokalizáció a nyálkahártyában. EGF-R lokalizálták erősen az alsó vezető cella klaszter régió és mérsékelten a nyálkahártya nyaki sejt régió és a foveolar gödör régió mind a WT és TG nyálkahártyákon (ábra 1e), amint arról korábban a patkány gyomornyálkahártya [15 ]. Mivel a TGFa transzgén szabályozott alatt az egér metallotionein-gén [20] és a metallotionein már állítólag elő a gyomor nyálkahártya [29], megvizsgáltuk a metallotionein-expresszáló sejt-típusok a nyálkahártyában. Immunhisztokémiai, láttuk metallotionein festés főleg mentén az alsó mirigyes régió scatteringly mentén gödör régióban a kontroll CD1 törzs gyomornyálkahártya (ábra 1f). Így a eloszlása ​​TGFa-t expresszáló sejt-típusok hasonló a metallotionein-expresszáló sejtek a TG gyomornyálkahártya (1A és 1F).
WT egér nyálkahártya, a H + /K + - ATPáz-pozitív parietális sejtek széles körben elterjedt az mirigyes régióban, kivéve a felső-gödör réteg, míg a H + /K + - ATPáz-pozitív mirigyes régió magassága csökken a TG nyálkahártya (ábra 1e). Valóban, a földszoros tövében a gödör régióban, amely megerősítette PCNA festés volt, elindult lefelé a közepén a TG nyálkahártya (ábra 1 g). Sőt, PCNA-pozitív sejteket vastagon szét a közepén a nyálkahártya. Ezzel összhangban a PAS-festés-pozitív foveolar gödör megnyúlt a Tg nyálkahártya ellentétben a rövid gödör a WT nyálkahártya (Figure 1 H). Így, bár a magassága a gyomornyálkahártya hasonló volt a WT és a TG nyálkahártyák, a proliferatív zóna lefelé mozog, és a foveolar gödör régió több volt, hosszúkás, csökkentett mirigyes régió a TG mocosa. Mivel a növekedés a gödör sejtek erősen fokozott gasztrinpozitív [25, 30], összehasonlítottuk a szérum gasztrin szint közötti WT és TG egerekben, de nem talált növekedése a szérum gasztrin a TG egér (WT, 213 ± 41 pg /ml; TG, 263 ± 47 pg /ml, n = 5, p = 0,438).
etanollal kiváltott gyomor sérülés a WT és a TG egér nyálkahártyákon
Orogastric beadása savanyított etanolban (100 ul) okozott vérzéses sérülés a TG nyálkahártya (2a ábra, balra). Szövettanilag a sérülés kibújt a gödörbe, és földszoros régiók és elérte, hogy a közép-mirigyes régió (2b ábra, balra). Ezzel szemben ez a fajta sérülés a TG egér nyálkahártya nem volt jelentős (2a ábra, jobbra). A sérülés szövettanilag csak a lumen pit régió (2b ábra, jobbra). A WT nyálkahártya, a sérült terület gyorsan növekedett a csúcs 6 H után az etanol adagolás, míg a TG nyálkahártyában a területen nőtt lassan és minimálisan nélkül jelentős csúcs (2c ábra). Következetesen, apoptotikus sejtek által mutatott TUNEL festéssel elosztott mélyen az alsó mirigyes régió 3 óra után az etanol adminisztráció a WT nyálkahártya, míg az apoptotikus sejteket korlátozódik a gödör régióban, de nem terjed ki a mirigyes régió a TG nyálkahártya ( ábra 2d). 2. ábra etanollal kiváltott gyomor sérülés a gyomor nyálkahártyája. (A) makroszkópos véve a gyomor nyálkahártyáját. Skála: 5 mm. Mindkét nyálkahártyák 6 H etanol beadása után. Megjegyezzük, hogy a vezeték nélküli terminál nyálkahártya kijelzők kiterjedt vérzéses károsodások, ezzel szemben, a TG nyálkahártya néz sértetlen etanol beadása után. (B) a hematoxilin-eozin-festés etanol-sérült WT nyálkahártya (balra) és a TG nyálkahártya (jobbra). Megjegyzés: a mély fekély kialakulása a WT nyálkahártyát. Skála: 100 nm. (C) idő folyamán etanol-indukált gyomor sérülést. Sérült területet ábrázoltuk az idő akár 12 óra után az etanol beadása. Minden pont átlagosan öt egerekben. p katalógusa < 0,05 (d) TUNEL-festéssel WT nyálkahártya (balra) és a TG nyálkahártya (jobbra). Mindkét rész egymás után, hogy azok a 2B katalógusa, ill. Az apoptotikus sejtek láthatók sötétbarna magok. Számos apoptotikus sejtek megjegyezte, a WT nyálkahártyát. Minden fotó volt 6 óra után az etanol beadása. Skála: 100 jim.
Gyomor nyálkahártya véráramlását az etanolban kezelt nyálkahártya
Bár számos citoprotektív szabályozó faktorok is beszámoltak, ideértve a NO, CGRP, COX2, és HSP70 [12, 13, 31, 32] , nyálkahártya véráramlását javasolták elsődleges tényező a védelem és a kárpótlás etanollal kiváltott gyomor sérülés [1, 33]. Megmértük a gyomor véráramlást azáltal, hogy egy szondát a lézer Doppler áramlásmérő a gyomornyálkahártya keresztül érhető el egy kitett hasfal elaltatott egér. Gyomor véráramlás csökkent jelölt 43,5 ± 6,37% után az etanol beadása a gyomor nyálkahártya a WT egér (3. ábra). Ezzel szemben csak csökkent 17,2 ± 9,21% után az etanol beadása a TG nyálkahártya (3. ábra). Így a gyomor véráramlás jól karbantartott a Tg nyálkahártya után is etanol kezelést. Mivel nyálkahártya ischaemia az egyik legfontosabb ulcerogen faktorok [33], a fenntartó a gyomor véráramlás tűnik, hogy alapvető tényezője a nyálkahártya védelme. 3. ábra értékelése gyomornyálkahártya véráramlás a gyomor nyálkahártyája. A gyomor nyálkahártya véráramlását összehasonlításával értékeltük a vér folyási arány előtt és után az etanol kezelést. Az arány kapjuk százalékkal szemben a vér áramlását a kezelés előtt, amely sokkal nagyobb volt a WT nyálkahártyán, mint a Tg nyálkahártyát. * P katalógusa < 0,03.
Expressziója citoprotektív fehérjék: NO-szintáz, a COX-2, és a hsp70
Hogy vizsgálja meg a mechanizmus a magas vér áramlását a karbantartást a TG nyálkahártyájában, megvizsgáltuk a kifejezés a NO-szintázok, amely nem származó arginin, és ellazítja vaszkuláris sima izmokat keresztül cGMP-függő protein-kináz [34]. Háromféle NO szintáz (NOS): neurális NOS (nNOS), az indukálható NOS (iNOS) és endothelialis NOS (eNOS). nNOS és eNOS konstitutívan expresszált, míg az iNOS indukálódik upon gyomor sérülés [35]. nNOS osztottak, hasonlóan a PAS-festés alatt foveolar pit régió (ábra 1 g); megfigyelhető volt át a hosszúkás gödör a TG nyálkahártya és korlátozódott a luminális gödör a WT nyálkahártya (4a ábra). eNOS-t gyengén szétszórva a teljes gyomor nyálkahártya Hasonlóképpen mind a WT és a TG nyálkahártyák (az adatokat nem mutatjuk). Az iNOS festődés elhanyagolható volt a WT nyálkahártyában, annak ellenére, hogy erősen indukálta az alsó mirigyes régióban a nyálkahártya kitéve etanol (4b ábra). A TG nyálkahártya, iNOS konstitutíven kifejezett alsó mirigyes régióban hasonlóan előtt és után a sérülés (4b ábra), amely úgy tűnik, hogy még inkább hozzájáruljon a fenntartásához magas vér áramlását. 4. ábra immunfestése NO-szintázok a gyomor nyálkahártyáját. Skála: 100 nm. (A) nNOS immunfestés. nNOS volt látható mentén pit régióban, ami a szélesebb eloszlás mentén hosszúkás gödör a TG nyálkahártyát. (B) iNOS immunfestés. iNOS-t indukáltunk az alsó mirigyes régió után etanol sérülés a WT nyálkahártyájában, mivel arra a konstitutívan expresszált ugyanabban a régióban a TG nyálkahártya függetlenül az etanol sérülés.
prosztaglandinokat javasolt, mint egy nagy sejtvédő faktor több mint három évtizeddel ezelőtt [ ,,,0],8] és azok szerepét széles körben tanulmányozták [36, 37]. A szerepe a prosztaglandin-képző enzimek, a COX-1 és COX-2, eddig ellentmondásos a nyálkahártya elleni védelem gyomor irritáló [7, 11, 32]. Megvizsgáltuk a kifejezés COX a WT és TG nyálkahártyája alatt etanol sérülést. A kifejezés a COX-1 nem különbözött a vezeték nélküli terminál és a TG nyálkahártyák, sem előtt vagy után az etanol sérülés (5b ábra). A COX-2 nem volt detektálható a WT nyálkahártyájában, de a kifejezés nyilvánvalóvá vált, 6 H után etanol sérülés, és annak festődés lokalizálódott az alsó mirigyes régió (ábra az 5a és 5b). A TG nyálkahártya, a COX-2 immunhisztokémiai intenzív volt az ugyanabban a régióban, még mielőtt a kár és a pozitív tartományban maradt a sérülés után (5a ábra). Mivel Coxs kimutatták, hogy kell kifejezni mesenchymális sejtek, így a fibroblasztok és a mononukleáris sejtek a gyomornyálkahártya [38], és a streptavidin /biotin /HPR módszer néha bemutatja a hamis pozitív festéssel végeztünk immunfluoreszcens festést használva fagyasztott metszet, amely megerősítette, COX expresszióját hasonlóképpen az alsó mirigyes régió a TG nyálkahártya (az adatokat nem mutatjuk). Immunoblot, a COX-2 fokozott a sérülés után a WT nyálkahártyájában, mivel arra a nagyon emelkedett hasonló mértékben előtt és után a sérülés (5b ábra).

• Genomszekvenciáját Helicobacter suis támogatja szerepét gyomor- patológia
• Up-szabályozása CLDN1 gyomorrákban korrelál csökkent túlélést