Интегративной роли трансформирующий фактор роста-альфа в цитопротекция механизмах желудка травмы слизистой оболочки

Интегративной роли трансформирующий фактор роста-альфа в цитопротекция механизмах повреждения слизистой желудка
Аннотация
Справочная информация
трансформирующий фактор роста альфа (TGFα) защищает от повреждения слизистой желудка и способствует заживлению ран. Тем не менее, его избыточная экспрессия как известно, индуцирует гипертрофической гастропатия, напоминающую болезнь менетрие в трансгенных (TG) мышей на FvB фоне, как один из авторов сообщалось ранее. Мы изучали другой TGFα-выражающее линию мыши на фоне CD1, чей слизистой оболочки желудка кажется нормальным. Так как эта Т.Г. мышь имела сильное сопротивление этанол-индуцированной травмы желудка, мы рассмотрели долгосрочный эффект TGFα на нескольких механизмов защиты желудка.
Методы
TGFα экспрессирующие трансгенные (ТГ) линий мышей, несущих TGFα кДНК человека под контролем мыши металлотионеинового ген I промотора были получены на фоне мыши CD1 и анализировали их этанол травмы устойчивые фенотипы производства TGFα.

Результаты в слизистой оболочке Т.Г., кровоток в хорошем состоянии после травмы этанола , Кроме того, нейронные и индуцируемые типа NO-синтазы были последовательно и широко экспрессируется в слизистой оболочке ТГ, по сравнению с ограниченным распределением нейронного типа NO-синтазы в полостную яму области слизистой оболочки дикого типа (WT). ЦОГ-2 и его фактор NFkB вверх по течению транскрипции были конститутивно повышен в слизистой оболочке TG еще до введения этанола, в то время как они были вызваны в той же области слизистой оболочки WT только после того, как травмы этанола. Два антиапоптические белки, HSP70 и Bcl-2, были повышающей регуляции в слизистой оболочке ТГ еще до введения этанола, в то время как они не были выражены в слизистой оболочке WT до травмы. Кроме того, про-каспазы 3 активация ингибируется в слизистой оболочке ТГ, в то время как он был преобразован в активную форму в слизистой оболочке WT после введения этанола.
Заключение
Мы пришли к выводу, что TGFα сохраняет слизистой оболочки желудка защиту против повреждения желудка путем интеграции других цитопротекторным механизмов.
Справочная информация
этанол уже давно используется для создания геморрагический желудка травмы слизистой оболочки у грызунов [1]. При пероральном введении абсолютного или соляной кислотой подкисляют этанолом, обширные геморрагические повреждения могут быть получены в слизистой оболочке желудка. Эта экспериментальная модель желудка травма часто использовалась при желудочных исследований защиты слизистых оболочек и реституции. Действительно, ряд цитопротекторных соединений были протестированы, чтобы оценить их эффективность в борьбе против повреждения желудка, в том числе желудочно-кишечного тракта гормоны, факторы роста, простагландинов, биоактивных аминов и мягких раздражающих веществ, таких как капсаицин [2-5]. Среди этих соединений, эпидермальный фактор роста (EGF), факторы роста семьи, в частности, трансформирующий фактор роста a (TGFα), были зарегистрированы в качестве сильных цитопротекторных соединений против этанол-, уксусной кислоты-, или аспирин-индуцированной травмы желудка [2, 4]. выражалась
TGFα в слизистой оболочке желудка у крыс после перорального введения подкисленной таурохолата или соляной кислоты, что говорит о его репаративный роль в желудочном травмы [6]. TGFα внутрибрюшинно защищены от этанола, вызванной травмой желудка со значительным увеличением прилегающего муцина желудка у крыс [7]. Цитопротекторное функция TGFα, как представляется, опосредованного активацией фосфолипазы C-Г1, но не простагландинами, и не зависит от анти-секреторного эффекта TGFα [7]. С другой стороны, простагландины и их синтетического фермента циклооксигеназы (ЦОГ), уже давно были предложены в качестве цитопротекторных факторов против повреждения желудка [5, 8]. ЭФР было показано, чтобы выразить индуцируемый COX изоформы СОХ-2 в клетках линии слизистой желудка у крыс RGM1 через ЭРК МАР-киназы пути [9] и в Swiss 3Т3 fibloblasts, особенно путем совместной стимуляции с гастрина [10]. Кроме того, экспрессия ЦОГ-2 с помощью гепарин-связывающего EGF-подобного фактора роста, состоит из факторов роста EGF семейство, был заблокирован конкретной EGF-рецептором (EGF-R) ингибитор в слизистой оболочке желудка у крыс [11]. Таким образом, сигнал EGF-R, как представляется, опосредуют СОХ-2 индукции в слизистой оболочке желудка.
Наиболее важные цитопротективных механизмы включают в слизистой оболочки желудка кровоток. ЭФР и TGFα было показано, оказывают цитопротекторным эффекты путем стимуляции капсаицин-чувствительных нейронов с высвобождением с геном кальцитонина пептид, связанных с (CGRP) и оксида азота (NO) у крыс, подвергшихся воздействию orogastric введения этанола, что приводит к увеличению в слизистой желудка крови потока [11, 12]. В противоположность этому, Контурек и др. свести к минимуму роль CGRP-зависимого увеличения желудочного кровотока, демонстрируя, что введение NO-рилизинг аспирина обеспечивает защиту от абсолютного этанола, вызванной травмой желудка даже в капсаицин-денервированная крыс, что приводит к усилению активности белка теплового шока 70 (HSP70 ) выражение и ослабление окислительного повреждения сильным повышающей регуляции генов антиоксидантных, таких как цинк меди супероксиддисмутазы (СОД) и глутатионпероксидазы [13].
TGFα был иммунологически преимущественно в клетках GSM вдоль рва желудка у человека [14], интенсивно в желудочном поверхности слизистых оболочек (GSM) клеток в течение пролиферативной зоны и слабо вдоль железистой области под пролиферативной зоны у крыс [15], а также заметно вдоль слизистой области шеи клеток в FVB /N мышей деформации [16]. С другой стороны, EGF-R был иммунологически в клетках, выстилающих GSM foveolar котлован и слизистый области шеи клеток к нижней железистой области в организме человека [17]. У крыс EGF-R был локализован в области верхнего Колодец и в главных клеточных кластеров в нижней части желудочных желез [15]. Хотя TGFα известно, индуцирует пролиферацию клеток в первичных культивированных крысиных клеток желудочной оболочки [18], и гиперпластический пролиферации в слизистой оболочке на TGFα-выражающего трансгенными (ТГ) мыши [19, 20], распределение TGFα и EGF-R в терминально дифференцированных клеток слизистой оболочки желудка позволяет предположить, что TGFα оказывает непролиферативная функции, включая антиапоптотических эффекты и образование желудочного эпителиального барьера в аутокринный /паракринной образом. Например, TGFα ингибирует апоптоз мыши линии желудка через слизистую оболочку клеток, GSM06, выражая анти-апоптотических Bcl-2 белков семейства через NF-kB-зависимого пути [21]. Желудочный апикальной и базолатеральной EGF-R, как было показано, чтобы вызвать уменьшение парацеллюлярной проницаемости по отношению к кислоте для защиты железистых клеток в кислой среде [18, 22]. Таким образом, TGFα оказывает как пролиферативные и непролиферативная воздействие на функции слизистой оболочки желудка, и эти разнообразные эффекты TGFα должны быть пересмотрены, по крайней мере, с точки зрения того, их результаты получены из краткосрочного лечения с использованием культуры клеточных линий или от долго- термин выражение, использующее TGFα-трансгенов, экспрессирующие животных.
десять лет назад один из авторов, Х. Такаги, порожденные TGFα экспрессирующих TG линий мышей под контролем промотора гена металлотионеина, и одна из этих линий (MT100) гипертрофическая гастропатия выставляемый напоминающие болезнь менетрие, аналогично, как показано другими исследователями [19, 20]. В отличие от этого, другая линия TG (MT42) отображается в нормальный вид слизистой оболочки желудка, хотя TGFα трансгенов было выражено в одинаковой степени в обеих линиях ТГ [20]. Поскольку MT42 линия отображается удивительный уровень устойчивости к этанол-индуцированного повреждения слизистой оболочки желудка, мы считали, что это может быть полезно для изучения непролиферативная эффекты TGFα, такие как устойчивость к слизистой оболочке травмы этанола. В настоящем исследовании мы изучали долгосрочные эффекты TGFα на этанол-индуцированного повреждения желудка путем анализа изменений в цитопротекторных и антиапоптотических регуляторных факторов, в том числе желудочного кровотока, NO-синтазы, COX-2 и апоптоз белков, ассоциированных с такими , как HSP70, Bcl-2 и каспазы 3.
методов
TGFα экспрессирующих трансгенной мыши и этанол-индуцированного повреждения желудка
TGFα экспрессирующих трансгенные (ТГ) линий мышей, несущих TGFα кДНК человека под контролем мыши ген металлотионеина I промотор были получены на CD1 или FvB фоне мыши, как описано ранее [20]. Одна из линий TG, MT100 на FvB фоне мыши, отображается гипертрофическая гастропатия, напоминающее болезнь менетрие [20], в то время как другой линии, MT42 на фоне мыши CD1, отображается в нормальный вид слизистой оболочки желудка. Фенотип мыши TGFα-TG-видимому, зависит от штамма мыши, так как MT100 и MT42 линии выражали подобный уровень трансгена TGFα в желудке [20]. В настоящем исследовании мы использовали MT42 линию TGFα экспрессирующих TG самцов мышей и CD1 дикого типа (WT) самцов мышей в возрасте от 6 до 8 недель. Животных содержали в контролируемых света (7:00 утра до 7:00 вечера) с пищей и водой при условии вволю
.
Мышей весом 30-35 г, голодали в течение 24 часов до начала эксперимента, но имели свободный доступ к воде. Все экспериментальные процедуры, влияющие на мышей были одобрены уходу и использованию животных комитета по рассмотрению в Гумма университета. Затем мышам дали orogastric подкисленный этанол (100 мкл, 60% этанола в 0,15 моль /л HCl). Три, шесть и двенадцать часов после введения этанола подкисленной мышей умерщвляли для оценки желудка травмы и иммуногистохимических анализов, а также для РНК и экстракции белка для ПЦР в реальном времени, Северной и Вестерн-блот-анализ.
Физиологические исследования <бр> секреции желудочной кислоты измеряли, как описано ранее [20, 23]. Вкратце, WT и TG мышей подвергали голоданию в течение 3 ч, а затем под наркозом эфиром. После того, как разрез брюшной стенки, то pyrolus сшили, и разрез зашивали. Желудочный жидкость собирали 4 ч после pyrolus лигирования. Для выхода максимальной кислоты, секреции кислоты стимулировали путем инъекции подкожно пентагастрин (500 мкг /кг массы тела). Желудочный жидкость титруют 0,1 N NaOH до рН 7,0 с помощью microtitrator.
Желудочный поток через слизистую оболочку в крови измеряли с помощью лазерного доплеровского расходомера (модель SFA211, Advance Co., Токио) путем размещения зонда на поверхности желудка слизистая оболочка, как описано ранее [24]. Сигнал потока контролировалась с программой записи MacLab. была выражена по отношению к исходному уровню Кровоток.
Морфологические исследования
толщина слизистой оболочки желудка измеряется от самой высокой части к нижней части железы с помощью микрометра. Точно так же, желудочные повреждения травмы были измерены (ширина и долгота) с помощью микрометра для расчета поврежденной области.
Для иммуноокрашиванием, мы получили антитела следующим образом. Поликлональные антитела к H + /K + - АТФазы была получена путем введения клеток-микросомальной фракции кролика париетальные в мышей [25]. Кроличьи поликлональные антитела к металлотионеином был своего рода подарок от доктора Нагамине, Гумма школы университета медицинских наук [26]. Мы приобрели антитела следующим образом: кроличьи поликлональные антитела к TGFα, кроличьи поликлональные антитела к EGF-R, козьи поликлональные антитела к СОХ-2, кроличьи поликлональные антитела к NFκB, и мышиные моноклональные антитела к нОАС и иСОА от Santa Cruz Biotech. (Santa Cruz, CA); мышиные моноклональные антитела к пролиферативные-клеточного ядерного антигена (PCNA) из Zymed Lab. (Южный Сан-Франциско, Калифорния); овцы антитела к человеческому пепсиногена II от BIOPUR AB (Бубендорфе, Швейцария), который также вступает в реакцию с пепсиногена мыши; кроличьи поликлональные антитела к HSP70 из Stressgen Biotech. (Виктория, Британская Колумбия, Канада); и мышиные моноклональные антитела к Bcl-2 из BD Biosciences (San Diego, CA). Китай для пероксидазы хрена (HRP) -catalyzing иммуногистохимическое окрашивание, измельчить желудки были зафиксированы в нейтрализованной 10% формалине при 4 ° С в течение 24 ч, и затем заливали в парафин для микротома секционирования. Срезы депарафинизировали ткани были регидратации и инкубировали в 3% -ном растворе перекиси водорода для ингибирования эндогенной активности пероксидазы. Затем срезы инкубировали с первым антителом, описанным выше, с соответствующим разбавлением при комнатной температуре в течение 30 мин. Вторичный биотинилированные антитела было выбрано на основе первых продуцирующих антитела видов животных, а затем был использован с HRP-конъюгированного стрептавидина. Реакцию HRP проводили с 3-амино-9-этил-карбазола и перекиси водорода в соответствии с инструкциями, прилагаемыми с стрептавидин-биотин окрашивания Vectastatin Elite Kit (векторы Laboratories, Burlingame, CA). Положительные окрашивание появились коричневого цвета.
Для специфического окрашивания, измельчить Желудки фиксировали в 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,4, при 4 ° С в течение 24 ч. Небольшие кусочки фарша ткани подвергались сахарозу замены и были включены в ОКТ-соединения в рамках подготовки к замороженным секции с использованием микротома. Для получения первичного иммунореакцией, нарезанной секции зондировали с первым антителом, а затем инкубировали либо с indodicarbocyanide (Су3) -conjugated аффинно очищенным осла против кролика, против мышиного IgG (Jackson ImmunoResearch, Вест-Гроув, штат Пенсильвания), или флуоресцеин изотиоцианат (FITC), меченным анти-кроличьего IgG (Jackson ImmunoResearch), в качестве вторичного антитела. IgG, вторичное антитело выбрано на основании вида, на котором был поднят первым антителом.
При обнаружении на месте апоптотических клеток проводили с использованием структур полевых измерений Апоптоз Detection Kit (TAKARA BIO INC. Токио, Япония). Комплект содержит терминальную дезоксинуклеотидтрансферазу-опосредованной деоксиуридин трифосфат биотин ник конечного маркировки (TUNEL) систему анализа. Разделы Желудок были проницаемыми с протеиназы К, и 3'-ОН-концы ДНК-фрагменты были затем окрашивали следуя инструкции, прилагаемой к набору. Ядра окрашиваются темно-коричневого цвета считались апоптотических клеток.
Анализ РНК
желудки были обрезаны и тотальную РНК экстрагировали с использованием TRIzol (продукт фирмы Gibco BRL, Токио) в соответствии с протоколом, поставляемым изготовителем. Для нозерн-блоттинга, Общую РНК подвергали электрофорезу на 1,0% агарозном геле и переносили на нейлоновую мембрану (Amersham Pharmacia Biotech, Токио). Гибридизацию проводили с зондом человеческого TGFα кДНК (917 п.н.), меченного [альфа- 32Р] дезокси-CTP. Этот зонд распознает мРНК человеческого TGFα, но не мыши уровень TGF-мРНК.
Мыши TGFα мРНК измеряли с использованием в режиме реального времени полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH) в качестве внутреннего контроля. ПЦР в реальном времени проводили с использованием ABI Prism 7700 Sequence Detector и мягкие (Applied Biosystems, Foster City, CA) с использованием ДНК флуоресцентного красителя SYBR Green обнаружение. Праймеры были разработаны с использованием разработки программного обеспечения Primer Express (Applied Biosystems). Окончательный результат для каждого образца нормированы соответствующим значением GAPDH. Последовательности праймеров следующим образом: мыши TGFα: 5'-CCTGAGCACCCGAAGAT-3 'и 5'-CCTTCCCTCATGCCTTACT-3'; GAPDH: 5'-GTCGTGGATCTGACGTGCC-3 'и 5'-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3'
Вестерн-блот-анализ образцов
Желудочные ткани были обрезаны и общий белок из слизистой оболочки желудка гомогенизировали в RIPA буфере, содержащем коктейль ингибиторов протеазы. (фторид phenylmethylsulphonyl, пепстатина, лейпептина и апротинина) (Roche Diagnostics, Mannheim, Германия). Супернатант разделяли на геле SDS-PAGE, а затем переносили на поливинилидендифторидную мембрану. Мембрану зондировали со следующими антителами: антитела к иСОА, ЦОГ-1, ЦОГ-2, HSP70 и Bcl-2, которые были одни и те же те, которые используются для морфологических исследований; мышиные моноклональные антитела к Вах (Santa Cruz Biotech.); кроличьи поликлональные антитела к каспазы 3 (Santa Cruz Biotech.); и мышиные моноклональные антитела к актиновых филаментов (Santa Cruz Biotech.). Антителопродуцирующие реагировали полосы были обнаружены с использованием системы обнаружения ECL (Amersham, Buckinghamshire, UK).
Измерение гастрин
Serum гастрина измеряли с использованием набора гастрин радиоиммуноанализа (RIA гастрин комплект, Dainabot, Tokyo, Japan). Антитело специфично для гастрина с амидного фрагмента у его карбоксильного конца.
Измерение простагландина Е2
слизистую оболочку желудка гомогенизируют при 4 ° С в буфере для лизиса. Гомогенаты центрифугировали при 12000 оборотах в минуту в течение 20 минут, и супернатанты были подвергнуты простагландина Е <к югу> 2 анализа с использованием простагландина Е <суб> 2 Моноклональные иммуноферментный Kit (Cayman Chemical, Анн-Арбор, Мичиган), в соответствии с инструкцией завода-изготовителя .
Статистический анализ
Статистический анализ проводили с помощью повторного анализа измерьте дисперсии (ANOVA) для общей длины желудочных поражений с помощью непарного т-тест для желудка соотношение уменьшение потока крови через слизистую оболочку. Все величины выражены как среднее ± SE. P &л; 0,05 была принята в качестве статистически значимой.

Результаты Характеризация TGFα-выражающей TG мыши слизистой оболочки желудка
Штамм WT CD1 и TGFα-трансгена, выражающие MT42 линии мышей росли аналогично и не показали заметной разницы в их особенностях, поведения, или продолжительность жизни. Наибольшая толщина наблюдается для стенки желудка и фундальную железы 3,50 ± 0,18 мм и 2,33 ± 0,20 мм, соответственно, у мышей WT, и 3,85 ± 0,24 мм и 2,63 ± 0,16 мм, соответственно, у мышей TG; не было никаких существенных различий в форме желудочных желез и слизистых оболочек между WT и мышей TG. В дополнение к обычному появлению слизистой оболочки желудка, эта мышь линия TG также имела нормальный вид печени, поджелудочной железы и других органов.
Мы затем сравнивали кислоты способность секреции между WT и мышей TG. У мышей WT, выход максимальная кислота значительно увеличилась с базальным уровнем 25 ± 1,4 мг-экв /ч до 50 ± 5,8 мэкв /ч после стимуляции пентагастрином. В противоположность этому, у мышей TG, максимальная выходная кислота увеличена в меньшей степени, до 30 ± 5,7 мг-экв /ч от базальный выход 23 ± 0,7 мг-экв /ч (п = 5 в WT и ТГ у мышей). Выход притупляются кислота может отражать снижение массы париетальных клеток в слизистой оболочке ТГ (рис 1е). Рисунок 1 характеристика TGFα-выражающей TG слизистой оболочки. Шкала на каждой фигуре указывает на 100 мкм. (А) Распределение TGFα-экспрессирующих клеток. Коричневый цвета TGFα-позитивные клетки были видны вдоль ямы области полостной в слизистой оболочке WT, удлиненного foveolar области ямы, а нижний трети железистой области в слизистой оболочке ТГ. (Б) Перекрытие красного цвета TGFα-позитивных клеток и зеленого цвета H + /K + -АТФазы-положительных париетальных клеток. Нижние TGFα-позитивных клеток в кластере отличаются от зеленого цвета париетальных клеток в слизистой оболочке ТГ. (С) Нозерн-блот человеческой мРНК TGFα и ПЦР-амплификации мыши мРНК TGFα. Человек мРНК TGFα выражается только в слизистой оболочке ТГ (левая панель), но ПЦР-амплифицировали мыши TGFα мРНК выражается так же в обоих WT и TG слизистыми оболочками (правая панель). (D) Вестерн-блот TGFα промежуточных форм. TGFα предшественника (20 кДа) и его промежуточные формы визуализируются более интенсивно в слизистой оболочке ТГ, чем в слизистой оболочке WT. (Е) локализация рецептора ЭФР в слизистой оболочке желудка. Рецептор ЭФР (EGF-R) окрашивали Cy3 (красный) и H + /K + -АТФазы окрашивали FITC (зеленый). EGF-R был иммунологически умеренно в верхней области ямы и сильно в нижней железистой области так же, как в WT и TG слизистыми оболочками. (Е) Распределение металлотионин в слизистой оболочке желудка. Металлотионеин сильно иммуноокрашиванию в нижнем железистой области, и умеренно вдоль foveolar региона. (Г) Удлинение желудка ямы слизистой оболочки TG. PCNA-позитивные клетки распределены в верхней трети области в желудочных желез WT, в то время как они распределены более многочисленно и широко в средней железистой области. (Ч) PAS окрашивания показывает удлиненную яму в слизистой оболочке TG.
Экспрессия трансгена TGFα
TGFα экспрессирующих типов клеток были определены на основе типа клеток по конкретным иммунным окрашиванием и их местонахождении через слизистую оболочку. TGFα, как сообщается, иммуноокрашиванию вдоль клеток GSM в яме желудка у человека [14] и крыс [15], а также вдоль области слизистой шейки клеток в FVB мышей штамма [16]. В настоящем исследовании, коричневого цвета TGFα-позитивные клетки были распределены вдоль foveolar области как WT и TG слизистыми оболочками, а также вдоль нижней железистой области Т. Г. слизистая оболочка (рис 1а). В TGFα-позитивные клетки вдоль foveolar области оказались желудочные ямы клетки, на основе их расположения (рис 1b, верхняя панель), а те, вдоль нижней железистой области слизистой оболочки ТГ не пересекаться с зеленым цветом H <вир> + /к + - АТФазы-положительных париетальных клеток (рисунок 1b, нижняя панель), но пересекаться с пепсиногена-положительных главных клеток (данные не показаны). Антитела мы использовали для иммунологического окрашивания для TGFα не мог различать человека и мыши TGFα, но его мРНК зонд может сделать это для Нозерн-блот-анализа. Было выражено человеческое TGFα-трансгенов в слизистой оболочке ТГ в то время как ни одно выражение не было отмечено в слизистой оболочке WT (рис 1c, левая панель). В отличие от этого, аналогичным образом выражается эндогенный мыши TGFα мРНК в обоих WT и TG слизистыми оболочками путем ПЦР в реальном времени (рис 1c, правая панель). TGFα представляет собой пептидный 50 амино-, полученный из его 160 аминокислот, трансмембранный предшественник расщепляется фактора некроза опухоли-альфа-превращающего фермента (ТАСЕ) [27, 28]. При избыточной экспрессии человеческого TGFα-трансгена в слизистой оболочке ТГ, предшественника приблизительно 20 кДа TGFα и его промежуточные формы были увеличены с помощью иммуноблоттинга (Рисунок 1d).
Так как предшественник и обработанные формы были одинаково активны для стимуляции EGF -R [28], мы исследовали далее локализацию EGF-R в слизистой оболочке. EGF-R был локализован в большой степени в нижней главной области соты кластера и умеренно в области слизистой шейки клетки и в foveolar пит области в обоих WT и TG слизистыми оболочками (рис 1e), как это было ранее сообщалось для слизистой оболочки желудка у крыс [15 ]. Поскольку трансгенная TGFα контролировали под мышь металлотионеинового гена [20] и металлотионеина был по сообщениям произведен в слизистой оболочке желудка [29], мы исследовали металлотионеина-экспрессирующих типов клеток в слизистой оболочке. Иммуногистохимически, мы уже отмечали металлотионеина окрашивание в основном вдоль нижней железистой области и scatteringly вдоль ямы области управления CD1-деформированного слизистой оболочки желудка (рис 1f). Таким образом, распределение TGFα экспрессирующих типов клеток аналогична из металлотионеина-экспрессирующих клеток в слизистой оболочке желудка TG (фиг.1А и 1f).
В слизистой оболочке мыши WT, Н + /К + - АТФазы-положительные теменной клетки широко распространились по всему железистой области для верхнего пит слоя, за исключением, в то время как H + /K + - АТФазы-положительная железистой область была уменьшена по высоте в ТГ слизистая оболочка (рис 1д). Действительно, перешеек у основания области ямы, которая была подтверждена PCNA окрашиванием, был перемещен вниз к середине TG слизистой оболочки (рис 1 г). Кроме того, PCNA-позитивные клетки были распределены плотно в середине слизистой оболочки. Последовательно ССА-окрашивание-положительным foveolar яма удлинен в слизистой оболочке TG в отличие от короткой ямы в слизистой оболочке WT (рис 1 ч). Таким образом, несмотря на то высота слизистой оболочки желудка была сходной между WT и TG слизистыми оболочками, пролиферативная зона была перемещена вниз и foveolar яма область была более вытянут с уменьшенным железистой области в mocosa TG. Так как рост ямы клеток сильно усиливается гастрина [25, 30], мы сравнили уровни сывороточного гастрина между мышей WT и TG, но не нашли никакого увеличения уровней сывороточного гастрина у мышей TG (WT, 213 ± 41 пг /мл;. Т.Г., 263 ± 47 пг /мл, п = 5, р = 0,438)
этанол-индуцированной травмы желудка в WT и TG мышки слизистыми оболочками
Orogastric введения подкисленного этанола (100 мкл) вызывает геморрагический травмы в слизистой оболочке ТГ (рис 2а, слева). Гистологически травма отслаивается ямы и перешейка регионы и достиг к середине железистой области (рис 2b, слева). В отличие от такого рода травмы в слизистой оболочке мышей TG не отличалась (рис 2а, справа). Травма гистологически ограничивается областью просветная ямы (рис 2b, справа). В слизистой оболочке WT, поврежденной области быстро увеличивалась с пиком через 6 ч после введения этанола, тогда как в слизистой оболочке TG область медленно и минимально увеличена без заметного пика (рис 2с). Последовательно, апоптотических клеток, показанные окрашивания TUNEL распределены глубоко в нижнюю железистой область 3 ч после введения этанола в слизистой оболочке WT, в то время как в апоптозе клетки ограничивается областью ямы, но не распространяется на железистой области в слизистой оболочке ТГ ( Рисунок 2d). Рисунок 2 Этанол-индуцированное повреждение желудка в слизистой оболочке желудка. (А) Макроскопические вид слизистой оболочки желудка. Масштаб: 5 мм. Оба слизистая 6 ч после введения этанола. Обратите внимание, что WT слизистая обширные геморрагические отображает поражения, в отличие от этого, слизистая оболочка ТГ выглядит неповрежденным после введения этанола. (Б) гематоксилином и эозином этанол-мозговой травмой WT слизистой оболочки (слева) и TG слизистой оболочки (справа). Обратите внимание на образование глубоких язв в слизистой оболочке WT. Масштаб: 100 мкм. (С) Временной ход этанол-индуцированную травмой желудка. Травмированный площадь в зависимости от времени до 12 ч после введения этанола. Каждая точка представляет собой среднее значение из п ти мышей. р
&л; 0,05 (d) TUNEL окрашивание слизистой оболочки WT (слева) и TG слизистой оболочки (справа). Обе секции расположены последовательно с теми, в 2B
, соответственно. Апоптотических клеток видны с темно-коричневого ядер. Многочисленные апоптотических клеток отмечаются в слизистой оболочке WT. Все фотографии были 6 ч после введения этанола. Масштаб:. 100 мкм
слизистой оболочки желудка кровоток в обработанной этанолом слизистой оболочки
Хотя ряд цитопротекторных регуляторных факторов было зарегистрировано, в том числе NO, КГП, СОХ2 и HSP70 [12, 13, 31, 32] , через слизистую оболочку кровотока был предложен в качестве основного фактора для защиты и восстановления этанола индуцированных желудка травмы [1, 33]. Мы измерили желудочного кровотока путем размещения зонда лазерного доплеровского расходомера на слизистую оболочку желудка доступ через открытой брюшной стенки у анестезированных мышей. Желудочный кровоток снизился отмечен 43,5 ± 6,37% после введения этанола на слизистую оболочку желудка мыши WT (рисунок 3). В отличие от этого, она уменьшилась только на 17,2 ± 9,21% после введения этанола на слизистую оболочку TG (рисунок 3). Таким образом, желудочный кровоток в хорошем состоянии в слизистой оболочке TG даже после обработки этанолом. Так как слизистая ишемия является одним из наиболее важных факторов ульцерогенных [33], содержание желудочного кровотока, действительно кажется, является существенным фактором для защиты слизистых оболочек. Рисунок 3 Оценка слизистой оболочки желудка кровотока в слизистой оболочке желудка. Желудочную среду кровотока оценивали путем сравнения отношения кровотока до и после обработки этанолом. Отношение получали в виде процентов по отношению к потоку крови до лечения, который был в слизистой оболочке WT значительно больше, чем в слизистой оболочке ТГ. * Р
&л; 0.03.
Экспрессия белков цитопротекторных: NO-синтазы, ЦОГ-2, и HSP70
Чтобы изучить механизм поддержания потока высокого кровяного в слизистой оболочке ТГ, мы исследовали экспрессию NO-синтазы, что делает NO из аргинина, и расслабляет гладкие мышцы сосудов через цГМФ-зависимой протеинкиназы [34]. Есть три типа NO-синтазы (NOS): нейронная NOS (ННО), индуцируемый NOS (иОАС) и эндотелиальной NOS (Енос). ННО и Енос конститутивно выражены, в то время как иОАС индуцируется после повреждения желудка [35]. нОАС был распределен по аналогии с PAS-окрашиванием над foveolar пит-области (рис 1 г); наблюдалось над удлиненным ямой слизистой оболочки TG и была ограничена полостной яму слизистой оболочки WT (рис 4а). Енос был слабо разбросаны по всей слизистой оболочке желудка так же, как в WT и TG слизистыми оболочками (данные не показаны). Окрашивание иОАС была незначительной в слизистой оболочке WT, хотя она была сильно индуцируется в нижней железистой области после того, как слизистая оболочка подвергалось этанолом (фиг.4В). В слизистой оболочке ТГ, был экспрессирован иОАС в нижнем железистой области аналогичным образом до и после травмы (рис 4б), который, как представляется, дальнейший вклад в поддержание высокого кровотока. Рисунок 4 Иммуноокрашивание NO-синтазы в слизистой оболочке желудка. Масштаб: 100 мкм. (А) нОАС иммунное. нОАС был виден вдоль области ямы, в результате чего ее более широкого распространения вдоль удлиненного ямы в слизистой оболочке ТГ. (Б) иОАС иммунное. иОАС индуцировали в нижней железистой области после повреждения этанола в слизистой оболочке WT, в то время как он был экспрессирован в той же области слизистой оболочки ТГ независимо от повреждения этанола.
Простагландины были предложены в качестве основного фактора защиты клеток более чем три десятилетия назад [ ,,,0],8] и их роли были тщательно изучены [36, 37]. Роль простагландина формирования ферментов, ЦОГ-1 и ЦОГ-2, был спорным в защите слизистой оболочки желудка с раздражителями [7, 11, 32]. Мы исследовали экспрессию ЦОГ в WT и TG слизистыми оболочками во время травмы этанола. Выражение COX-1 не отличались между WT и TG слизистыми оболочками, ни до, ни после травмы этанола (рис 5b). СОХ-2 не был обнаружен в слизистой оболочке WT, но его экспрессия стало очевидно, через 6 ч после травмы этанола, и его окрашивание локализуется в нижней железистой области (рис 5а и 5b). В слизистой оболочке TG, иммунным ЦОГ-2 был интенсивным в том же регионе еще до травмы и оставался положительным после травмы (рис 5а). Так как Coxs было показано, экспрессируется в мезенхимных клеток, таких как фибробласты и мононуклеарных клеток в слизистой оболочке желудка [38], а также метод стрептоавидин /биотин /HPR иногда представляет ложно-положительное окрашивание, мы проводили иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием замороженных срезов, который подтвердил, выражение ЦОГ аналогичным образом в нижней железистой области слизистой оболочки TG (данные не показаны). С помощью иммуноблоттинга, ЦОГ-2 увеличилась после травмы в слизистой оболочке WT, в то время как он был сильно повышен до такой же степени, до и после травмы (5б). Последовательно, простагландин Е 2 были достоверно выше в слизистой оболочке ТГ, чем в слизистой оболочке WT (рис 5в).

• Геном последовательность Helicobacter суис поддерживает свою роль в желудочном последовательности pathology
• До регуляции CLDN1 при раке желудка коррелирует с уменьшенным survival