Epigenetiska mekanismer som är involverade i differential MDR1mRNA uttryck mellan mag- och koloncancercellinjer och motiven för klinisk kemoterapi

Epigenetiska mekanismer som är involverade i differential MDR1
mRNA-expression mellan mag- och koloncancercellinjer och motiven för klinisk kemoterapi Bild Sammanfattning
Bakgrund sälja The membrantransportörer såsom P-glykoprotein (Pgp), den MDR1
genprodukten, är en av orsakerna till behandlingssvikt hos cancerpatienter. I denna studie var de epigenetiska mekanismer som är involverade i differentiell MDR1
mRNA-uttryck jämfört mellan 10 gastrisk och 9 koloncancercellinjer.
Metoder sälja The MDR1
mRNA-nivåer bestämdes med användning av PCR och realtids PCR-analyser efter omvänd transkription. Cytotoxicitet genomfördes med användning av MTT-analysen. Metylering status undersöktes genom kvantifiering PCR-baserade metylering och bisulfit DNA-sekvensering analyser.
Resultat sälja The MDR1
mRNA-nivåer som erhålls genom 35 cykler av RT-PCR i gastriska cancerceller var bara jämförbara med de som erhållits med 22 cykler av RT-PCR i koloncancerceller. Realtids-RT-PCR-analys avslöjade att MDR1
mRNA inte detekterades i de 10 gastriska cancercellinjer men variabla MDR1
mRNA-nivåer i 7 av 9 koloncancercellinjer utom SNU-C5 och HT-29-celler . MTT-analysen visade att Pgp-hämmare såsom cyklosporin A, verapamil och PSC833 sensibiliserade Colo320HSR (kolon, högsta MDR1
uttryck) men inte SNU-668 (gastric, högsta) och SNU-C5 (gastric, inget uttryck) till paclitaxel. Kvantifiering PCR-baserad metylering analys visade att 90% av gastric cancerceller, och 33% av koloncancerceller var denaturerad, vilket var helt matchas med de resultat som erhållits genom bisulfit DNA sekvensanalys. 5-aza-2'-deoxcytidine (5ÉC, ett DNA-metyltransferas-inhibitor) ökade MDR1
mRNA-nivåer i 60% av gastriska celler, och i 11% av koloncancerceller. Trichostatin A (TSA, histondeacetylasinhibitor) ökade MDR1
mRNA-nivåer i 70% av gastriska cancerceller och 55% av koloncancerceller. Den kombinerade behandlingen av 5ÑC med TSA ökade MDR1
mRNA-nivåer additivt i 20% av gastriska cancerceller, men synergistiskt i 40% av gastrisk och 11% av koloncancerceller.
Slutsats
Dessa resultat indikerar att den MDR1
mRNA-nivåer i gastric cancerceller är betydligt lägre än i koloncancerceller, som är åtminstone delvis på grund av olika epigenetiska regelverk som DNA-metylering och /eller histon deacetylering. Dessa resultat kan ge en bättre förståelse av effekten av kombinerad kemoterapi samt deras orala biotillgänglighet.
Bakgrund
Gastric och kolorektal cancer är en orsak till sjuklighet och dödlighet i världen idag. Om en botande kirurgisk resektion är omöjligt, är dessa cancerformer svarar mycket dåligt på kemoterapi och vilket resulterar i en dålig prognos. I gastric cancerpatienter, har 5-fluorouracil (5-FU) baserad kombinationskemoterapi försökts i syfte att förbättra behandlingsresultaten [1]. Med kolorektal cancer, har 5-FU varit den mest använda drogen i mer än 40 år. Emellertid har andra medel, såsom irinotekan eller oxaliplatin använts för att förbättra antitumöreffektivitet i kombination med 5-FU [2]. 5-FU stör DNA-syntes genom att blockera produktionen av pyrimidinnukleotid dTMP från dUMP under de novo
DNA-syntes genom inhibering av tymidylatsyntas samt genom inkorporering av fluor-nukleotider i DNA och RNA [3].
P-glykoprotein (Pgp) som kodas av multiresistens 1 (MDR1
) -genen är en representativ membranutflödespumpen av ATP-bindande kassett (ABC) transportörer [4-6]. Pgp fungerar som energiberoende utflödespumpar av olika strukturellt olika kemoterapeutiska medel såsom doxorubicin, vinkristin, vinblastin, paklitaxel, colhicine, aktinomycin D och mitomycin C [7], vilket kan minska den intracellulära nivån av ackumulering av läkemedlet. Som ett resultat, överuttryck av dessa proteiner förlänar MDR till cancerceller genom att kringgå de cytotoxiska effekterna av läkemedel. I den mänskliga tarmen, är Pgp uttrycks starkt på den apikala ytan av de ytliga kolumnära epitelceller i ileum och kolon, och dess uttrycksnivå minskar gradvis proximalt in i jejunum, duodenum och mage [8]. Reglering av den transkriptionella aktiviteten av MDR1
genen är beroende av flera trans-agerande proteiner som binder konsensus cis-element [9]. Tillgängligheten av promotorelement till sina bindande faktorer regleras i nivå med kromatin montering. Nivåerna av både DNA-metylering och histon deacetylering reglerar MDR1
genuttryck [10-12]. Hittills har transkriptionsreglering av MDR1
genuttryck genom epigenetiska mekanismer rapporterats i uttryck i tjocktarmscancerceller [13-16], men ingen i gastric cancer celler. Dessutom har förhållandet mellan transkriptions uttryck av MDR1
genuttryck och epigenetiska mekanismer i mag- och koloncancerceller inte jämförts. Därför är det oklart varför kemoterapier har olika används för att behandla mag- och kolorektal cancer och varför MDR1
mRNA uttrycks differentiellt i mag- och kolorektal cancerceller. Därför undersöktes denna studie huruvida graden av metylering vid promotorställe av MDR1
genen är nära förknippad med MDR1
genuttryck i både cancerceller.
Methods
Cellodlings
de 10 humana gastriska cancercellinjer (SNU-1, -5, -16, -216, -484, -601, -620, -638, -668 och -719) och 9 koloncancercellinjer (SNU-C1, C4, C5, Colo320HSR, LoVo, DLD-1, HT-29, HCT-8 och HCT-116) erhölls från Cancer Research Center vid Seoul National University (Sydkorea). Alla celler odlades vid 37 ° C i en 5% CO 2 atmosfär med användning av RPMI 1640-medium (GibcoBRL, Gland Island, NY, USA) med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (Sigma, ST. Louis, MO, USA). Cellerna bibehölls antingen som en suspension eller en monolagerkultur, och subodlades tills de nådde konfluens.
Omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (RT-PCR) -analys
totalt RNA extraherades med användning MagExtractor ® för det MFX-2100 (Toyobo, Osaka, Japan) auto-nukleinsyra reningssystem, enligt tillverkarens anvisningar. Den MDR1
och p-aktin
mRNA-transkript detekterades med användning av RT-PCR-analysen. MDR1
uttryck detekterades med 5'- och 3'-primrar som motsvarar nukleotiderna 907-930 (5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 ') och 1179 till 1201 (5'-TGCCAAG-ACCTCTTCAGCTACTG-3'), respektive, av den publicerade cDNA-sekvensen [17], vilket ger en 296-bp PCR-produkt. β-aktin
mRNA-uttryck användes som en kontroll för mängden av RNA, och detekterades med 5'- och 3'-primrar motsvarande nukleotiderna 1912-1932 (5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 ') och 2392 till 2412 ( 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3 '), respektive, av den publicerade cDNA-sekvensen [18], vilket gav ett 501-bp PCR-produkt. RNA från varje prov transkriberades omvänt med användning av 200 enheter av Moloney murint leukemivirus omvänt transkriptas (Gibco-Bethesta Research Laboratory, Grand Island, NY, USA) och 0,18

• Imaging bedöma lever och peritoneala metastaser av magcancer: en systematisk review
• Magsond införande under direkt syn med hjälp av kungen Vision ™ videolaryngoskop: en randomiserad, prospektiv, klinisk trial