Epigenetische mechanismen betrokken bij differentiële MDR1mRNA expressie tussen maag- en darmkanker cellijnen en beweegredenen voor de klinische chemotherapy

epigenetische mechanismen die betrokken zijn in differentiële MDR1
mRNA expressie tussen maag- en darmkanker cellijnen en beweegredenen voor de klinische chemotherapie
De abstracte Achtergrond
membraan transporters zoals P-glycoproteïne (Pgp), het MDR1
genproduct, een van de oorzaken van falen van de behandeling van kankerpatiënten. In deze studie, de epigenetische mechanismen die betrokken zijn in differentiële MDR1
mRNA expressie werden vergeleken tussen 10 maag- en 9 darmkanker cellijnen.
Methods Ondernemingen De MDR1
mRNA-niveaus werden bepaald met behulp van PCR en real-time PCR-tests na reverse transcriptie. Cytotoxiciteit werd uitgevoerd met de MTT assay. Methylatie status werd onderzocht door kwantificatie van PCR-methylatie gebaseerde en bisulfiet DNA-sequencing analyses.
Resultaten
De MDR1
mRNA verkregen door 35 cycli van RT-PCR bij maagkanker cellen waren gewoon te vergelijken met die verkregen door 22 cycli van RT-PCR in darmkankercellen. Real-time RT-PCR analyse toonde aan dat MDR1
mRNA niet gedetecteerd in de 10 maagkanker cellijnen maar variabele MDR1
mRNA in 7 van 9 colonkanker cellijnen behalve SNU-C5 en HT-29 cellen . MTT-test toonde aan dat Pgp-remmers zoals cyclosporine A, verapamil en PSC833 gesensibiliseerd Colo320HSR (colon, hoogste MDR1
expressie), maar niet SNU-668 (maag-, hoogste) en SNU-C5 (maag, geen expressie) aan paclitaxel. Kwantificatie PCR-gebaseerde methylatie analyse bleek dat 90% van maagkanker cellen en 33% van darmkankercellen werden gemethyleerd, die volledig werden gekoppeld aan de verkregen bisulfiet DNA sequentie analyseresultaten. 5-aza-2'-deoxcytidine (5AC, een DNA-methyltransferase inhibitor) verhoogde de MDR1
mRNA niveaus in 60% van maag cellen en in 11% van darmkankercellen. Trichostatine A (TSA, histon deacetylase remmer) verhoogde de MDR1
mRNA niveaus in 70% van maagkanker cellen en 55% van darmkankercellen. De gecombineerde behandeling van 5AC met TSA verhoogde de MDR1
mRNA additief in 20% van maag- kankercellen, maar synergetisch 40% van maag- en 11% van darmkankercellen.

Conclusie Deze resultaten geven aan dat het MDR1
mRNA niveaus in maagkanker cellen zijn aanzienlijk lager dan die in darmkankercellen, die ten minste gedeeltelijk als gevolg van verschillende epigenetische regelingen zoals DNA methylering en /of histon deacetylering. Deze resultaten kunnen een beter inzicht in de effectiviteit van de gecombineerde chemotherapie en hun orale biologische beschikbaarheid. Achtergrond
maag en colorectale kankers zijn een oorzaak van morbiditeit en mortaliteit in de wereld. Als een curatieve chirurgische resectie onmogelijk, deze kankers reageren heel slecht op chemotherapie en resulteert in een slechte prognose. Bij maagkanker patiënten werden 5-fluorouracil (5-FU) gebaseerde combinatie chemotherapie is geprobeerd om de behandelingsresultaten te verbeteren [1]. Met colorectale kanker is 5-FU de meest gebruikte drug al meer dan 40 jaar. Echter, andere middelen zoals irinotecan of oxaliplatin gebruikt om de antitumor werkzaamheid in combinatie verbeteren [2] 5-FU. 5-FU hindert DNA-synthese door het blokkeren van de productie van pyrimidine nucleotide dTMP van dUMP tijdens de novo DNA-synthese
door remming van thymidylaatsynthetase en door de integratie van fluor-nucleotiden in het DNA en RNA [3].
P-glycoproteïne (Pgp) gecodeerd door het multidrug resistance 1 (MDR1
) gen is een representatief membraan efflux pomp van ATP-bindende cassette (ABC) transporters [4-6]. Pgp functioneert als energie-afhankelijke efflux pompen van een verscheidenheid van structureel verschillende chemotherapeutische middelen zoals doxorubicine, vincristine, vinblastine, paclitaxel, colhicine, actinomycine D en mitomycine C [7], waarbij het intracellulaire niveau van accumulatie van het geneesmiddel kunnen verlagen. Hierdoor overexpressie van deze eiwitten verleent MDR kankercellen door onttrekken aan de cytotoxische effecten van geneesmiddelen. In de menselijke darm, wordt Pgp sterk tot expressie op het apicale oppervlak van de kolomvormige oppervlakkige epitheelcellen van het ileum en de colon, en het expressieniveau verlaagt geleidelijk in proximaal jejunum, twaalfvingerige darm en maag [8]. Regulering van de transcriptionele activiteit van het MDR1 gen
afhankelijk van verschillende trans-werkende eiwitten die de consensus cis-elementen binden [9]. De toegankelijkheid van de promoter elementen van bindende factoren gereguleerd op het niveau van chromatine assemblage. De niveaus van beide DNA-methylatie en histon deacetylering reguleren MDR1
genexpressie [10-12]. Tot nu toe heeft de transcriptionele regulatie van MDR1
genexpressie door middel van epigenetische gemeld bij expressie in darmkankercellen [13-16], maar geen in maagkanker cellen. Bovendien is de relatie tussen de transcriptionele expressie van MDR1
genexpressie en epigenetische mechanismen maag- en darmkanker cellen niet vergeleken. Daarom is onduidelijk waarom chemotherapie verschillend zijn voor de behandeling van maag- en colorectale kanker en waarom MDR1
mRNA wordt differentieel tot expressie in maag- en colorectale kankercellen. Daarom is deze studie onderzocht of de mate van methylering op de promotorplaats van het MDR1 gen
nauw geassocieerd met MDR1
genexpressie in zowel kankercellen.

Werkwijzen Celkweek
de 10 menselijke maagkanker cellijnen (SNU-1, -5, -16, -216, -484, -601, -620, -638, -668 en -719) en 9 colonkanker cellijnen (SNU-C1, C4, C5, Colo320HSR, LoVo, DLD-1, HT-29, HCT-8 en HCT-116) werden verkregen van de Cancer Research Center in Seoul National University (Zuid-Korea). Alle cellen werden gekweekt bij 37 ° C in een CO 5% 2 atmosfeer via RPMI 1640 medium (GibcoBRL, Gland Island, NY, USA) met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal bovien serum (Sigma, ST. Louis, MO, VERENIGDE STATEN VAN AMERIKA). De cellen werden gehandhaafd hetzij als een suspensie of een monolaag cultuur, en doorgekweekt totdat zij confluentie bereikten.
Omgekeerde transcriptie-polymerasekettingreactie (RT-PCR) test
Het totale RNA werd geëxtraheerd met behulp MagExtractor ® voor de MFX-2100 (Toyobo, Osaka, Japan) auto-nucleïnezuur zuiveringssysteem, volgens instructies van de fabrikant. Het MDR1 Kopen en β-actine
mRNA transcripten werden gedetecteerd met behulp van de RT-PCR assay. MDR1
expressie werd gedetecteerd met de 5 'en 3' primers die overeenkomen met de nucleotiden 907-930 (5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 ') en 1179-1201 (5'-TGCCAAG-ACCTCTTCAGCTACTG-3'), respectievelijk de gepubliceerde cDNA-sequentie [17], waarbij een 296-bp PCR product. β-actine
mRNA expressie werd gebruikt als controle voor de hoeveelheid RNA en werd gedetecteerd met de 5 'en 3' primers die overeenkomen met nucleotiden 1912-1932 (5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 ') en 2392-2412 ( 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3 ') respectievelijk van de gepubliceerde cDNA-sequentie [18], waarbij een 501-bp PCR product. Het RNA van elk monster werd reverse getranscribeerd met behulp van 200 eenheden Moloney murine leukemie virus reverse transcriptase (Gibco-Bethesta Research Laboratory, Grand Island, NY, USA) en 0,18 ug /ml oligo (dT 20) primer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Het verkregen cDNA van de maagkanker cellen (2-voudig verdund cDNA in de darmkankercellen) werden geamplificeerd met 1,25 eenheden Taq-polymerase (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 1 mM MgClz 2 en 10 pmol van elke primer in een thermische cycler (GeneAmp 2400, PE Applied Biosystems, Boston, MA, USA) gedurende 22 cycli met darmkankercellen maar 35 cycli met maagkanker cellen MDR1 Kopen en 17 cycli β-actine Website van sequentiële denaturatie (94 ° C gedurende 30 s), gloeien (65 ° C gedurende MDR1
, 53 ° C gedurende β-actine
) en verlenging (72 ° C gedurende 30 s). Na de laatste cyclus werden de PCR-producten onderworpen aan een laatste verlenging van 5 minuten bij 72 ° C. Kwantificatie, 3 pCi [α- 32P] dCTP toegevoegd aan elk reactiemengsel. Na PCR werden de PCR-producten gecombineerd en daarna geëlektroforeerd op een 7,5% denaturerende polyacrylamidegel. De banden werden gescand met een densitometer (PDI, Huntington Station, NY, USA). De hoeveelheid van elk mRNA transcript genormaliseerd aan die van elke β-actine mRNA
.
Eiwitextractie en Western blotanalyse
Totale cellysaten werden bereid door het lyseren geoogste cellen extractiebuffer (1% NP-40 , 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS in fosfaatgebufferde zoutoplossing) aangevuld met 2 mM fenylmethylsulfonylfluoride (Sigma) en 10 ug /ml leupeptine (Sigma). DNA werd gefragmenteerd door sonificatie en Western vlekanalyse werd uitgevoerd onder toepassing van een geringe modificatie van de werkwijze die als eerste is beschreven door Towbin et al. [19]. Eiwitten werden op een nitrocellulosemembraan overgebracht door elektroblotting met een stroom van 60 V overnacht. Het membraan werd geïncubeerd in blokkeeroplossing (5% magere melk) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur gewassen en vervolgens geïncubeerd met primair geiten polyklonaal antilichaam (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) voor Pgp. Het membraan werd gewassen en geïncubeerd met mierikswortel peroxidase-geconjugeerd secundair antilichaam (verdund 1: 1000) tegen elkaar IgG voor systemen van primaire antilichamen gedurende 1 uur. Het membraan werd vervolgens gekleurd met het reagens voor detectie van het ECL detectie kit (Amersham, Piscataway, NJ, USA).
Real-time PCR
Extractie van mRNA werd uitgevoerd volgens de RNeasy proctocol (Qiagen, Hilden, Duitsland ). Eén microgram totaal RNA werd omgekeerd getranscribeerd in cDNA in een volume van 20 pl met 200 eenheden Moloney murine leukemie virus reverse transcriptase (Gibco-Bethesta Research Laboratory, Grand Island, NY, USA) en 0,18 ug /ml oligo (dT 20) primers (Promega, Madison, USA) volgens de handleiding van de fabrikant. Real-time PCR werd uitgevoerd met de Light Cycler 2.0 Instrument (Roche, Mannheim, Duitsland) met behulp van de Fast Start DNA Master SYBR Green I Kit (Roche). Ter verificatie van de juiste amplificatieproduct werden PCR geanalyseerd op een 2% agarose gel gekleurd met ethidiumbromide. De sequenties van de primers zijn als volgt: voor β-actine
, 5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 'en 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3'; voor MDR1
, 5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 'en 5'-TGCCAAGACCTCTTCAGCTACTG-3'. Elke reactie (20 ui) bevatte 4 pl cDNA (10-voudige verdunning), 4 mM MgClz 2, 10 pmol van elke primer en 2 pl Fast Start DNA Master SYGR Green I Meng met buffer, dNTPs, SYBR Green dye en Tag-polymerase. De amplificatiewerkwijze van doelwitgenen was als volgt: pre-denatureren bij 95 ° C gedurende 10 min, 40 cycli van denaturatie bij 95 ° C gedurende 15 seconden, annealing voor MDR1
bij 67 ° C (β-actine
bij 55 ° C) gedurende 5 seconden en verlenging bij 72 ° C gedurende 7 sec (β-actine
voor 21 sec). Smeltcurve-analyse werd uitgevoerd om de productie van een enkel product te bevestigen. Negatieve controles zonder template werden geproduceerd voor elke run. Genexpressie waarden (relatieve mRNA levels) worden uitgedrukt als verhoudingen (verschil tussen de Ct-waarden = Het punt op de curve waarbij de hoeveelheid fluorescentie snel begint te stijgen, meestal een paar standaardafwijkingen boven de basislijn, wordt aangeduid als de drempelcyclus ( ct waarde).) tussen het gen van belang (MDR1
mRNA) en een interne referentie gen (β-actine
mRNA) dat een normalisatiefactor voor de hoeveelheid RNA geïsoleerd uit een monster. Analyse van de gegevens werd uitgevoerd met behulp Light Cycler softwareversie 4,0 (Roche).
Cytotoxiciteit test met MTT assay

in vitro cytotoxiciteit van de geneesmiddelen werd gemeten met een MTT-assay, zoals elders [20] beschreven. De cellen werden uitgezaaid met een 2 x 10 4cells /ml en overnacht geïncubeerd om voor bevestiging en stabilisatie. De cellen werden geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 3 dagen en MTT [3- (4,5-dimethylthiazool-2-yl) -2,5-difenyl tetrazolium bromide, Sigma] werd oplossing toegevoegd aan elk putje met cellen. Na schudden gedurende 1 min werd de plaat gedurende 5 uur. Formazan kristallen van de suspensiekweek werden opgelost in 150 gl dimethylsulfoxide (DMSO) na verwijdering van de supernatant. De extinctie van de putjes werd gemeten met een microplaat reader (μQuant, Bio-tek Instruments Inc., Winooski, VT, USA) bij 540 nm.
Kwantificering PCR-gebaseerde methyleringsanalyse
Vijf microgram van genomisch DNA werd geknipt met 50 U van
Msp I en Hpa II
(MBI Fermentas, Vilnius) bij 37 ° C gedurende 16 uren, toegevoegd een 1/15 volume van 0,6 M Tris (pH 7,5) en 1,5 M NaCl en geknipt met 50 U van
Pst I (New England Biolabs, MA, USA) bij 37 ° C gedurende 8 uur. De methyleringsstatus van het MDR1
5'CpG promotergebied werd onderzocht door analyse van 100 ng restrictie-gedigereerde DNA door PCR in 25 pl reacties die 1,25 eenheden Taq DNA polymerase en 10 pmol van elke primer. De kwantificering PCR gebaseerde methylatie analyse werd uitgevoerd volgens de eerder beschreven methode uitgevoerd [11]. De PCR-primers waren 5'-TCTAGAGAGGTGCAACGGAAG-3 'en 5'-TCAGCCTCACCACAGATGAC-3' voor het MS1 methylering-gevoelige primers (121 bp), 5'-TGAAGTCCTCTGGCAAGTCC-3 'en 5'-ATTCTCCCTCCCGGTTCC-3' voor de MS2 methylatie-gevoelige primers (206 bp), 5'-ATTTCACGTCTTGGTGGCC-3 'en 5'-TCCAGTGCCACTACGGTTT-G-3'for MC positieve controle primers (240 bp), en 5'-GGCGAAGGAGGT-TGTCTATTC-3' en 5 ' -AACGTTCTAGGAGAGTCGGG-3 'voor MN negatieve controle primers (240 bp) verkregen uit het triosefosfaatisomerase-gen promotergebied. Amplificatie werd uitgevoerd in een DNA thermische cycler voor 35 cycli voor de MN, MC, MS1 en MS2 primers waarbij achtereenvolgens denaturatie (95 ° C gedurende 30 s), annealing (60 ° C gedurende 30 s) en verlenging (72 ° C 30 s). Na de laatste cyclus werden de PCR-producten onderworpen aan een laatste verlenging gedurende 5 minuten bij 72 ° C. De PCR producten werden gescheiden door elektroforese op 7% PAGE gels. De gels werden daarna gekleurd met ethidium bromide en gefotografeerd door een Kodak Image Station 4000 MM (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA).
Bisulfiet DNA sequentie-analyse
Eén pg genomisch DNA chemisch werd gemodificeerd door natrium bisulfiet met de EZ DNA methylatie kit (Zymo Research, Orange, CA, USA) om ongemethyleerde cytosines omzetten uracillen terwijl gemethyleerde cytosinen ongewijzigd. Het bisulfiet gemodificeerd DNA werd gebruikt voor PCR amplificatie. Uitgebreide MS1 primer omvat 10 CpG posities, en SP-2 1 sites die verplicht is voor de functionele MDR1
promoter te activeren [21]. De primer sequenties voor amplificatie van bisulfiet behandelde strengen (223 bp) waren als volgt: S: 5'-GGAAGTTAGAATATTTTTTTTGGAAAT-3 '; AS: 5'-ACCTCTACTTCTTTAAACTTAAAAAAACC-3 '. Amplificatie werd uitgevoerd in dezelfde PCR-omstandigheden, behalve 48 ° C annealing temperatuur en 45 PCR cycli. Na de laatste cyclus werden de PCR-producten onderworpen aan een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 5 minuten. Sequentie van PCR-producten werd geanalyseerd onder toepassing van een geautomatiseerde sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Statistische analyse De resultaten worden als gemiddelde ± SE en de gegevens werden geanalyseerd met de t-test van de student
. P-waarden < 0,05 werden beschouwd als significant.
Resultaten
Vergelijking van expressie profielen van MDR1 mRNA in maag- en darmkanker cellen
MDR1
mRNA expressie werd geanalyseerd met behulp van de RT-PCR-test met de expressie niveau wordt genormaliseerd met de β-actine mRNA
bereikt na 17 PCR-cycli. De MDR1
mRNA werd niet gedetecteerd na 22 cycli van PCR in de 10 maagkanker cellijnen maar kan worden gedetecteerd op verschillende niveaus na 35 cycli van PCR met uitzondering van SNU-16, hetgeen een aanzienlijk lage MDR1
mRNA expressie in de maagkanker cellen getest (Figuur 1). Zoals getoond in figuur 1, de rangorde volgens de MDR1-β-actine
verhouding van maagkanker cellijnen als volgt: SNU-668 (1,51) > SNU-484 (1,37) > SNU-5 (0,63) > SNU-601 (0,33) > SNU-719 (0,32) > SNU-216 (0,29) > SNU-638 (0,07) > SNU-1 (0,04) > SNU-16 (0). Van de 9 colonkanker cellijnen, kunnen variabele MDR1
mRNA worden gedetecteerd in 7 colonkanker cellijnen na 22 cycli van PCR, maar niet in de SNU-C5 en HT-29 cellen. De MDR1
mRNA's van de laatste twee cellen kunnen niet worden gedetecteerd, zelfs na 35 cycli van PCR. Deze resultaten suggereren een relatief hoge MDR1
mRNA expressie ondanks enkele uitzonderingen in de darmkankercellen. Zoals getoond in figuur 2, de rangorde volgens de MDR1
/β-actine
verhouding in de colonkanker cellijnen is als volgt: Colo320HSR (0,90) > SNU-C4 (0.45) > HCT-8 (0,26) > SNU-C1 (0,12) > HCT-116 (0,11) > LoVo (0.10) > DLD-1 (0.07) > SNU-C5 (0) = HT-29 (0). Figuur 1 MDR1 mRNA expressie in maagkanker cellijnen. Het niveau van MDR1
mRNA expressie werd bepaald door RT-PCR, en genormaliseerd door die van β-actine mRNA
, dat werd gebruikt als controle voor RNA. Het cDNA reverse-getranscribeerd van het mRNA afzonderlijk met elk primerpaar voor het MDR1 Kopen en β-actine
genen geamplificeerd. Porties van elk PCR reactiemengsel werden op 7% polyacrylamide gel. De gel werd gedroogd en blootgesteld aan röntgenfilm gedurende de nacht.
Figuur 2 MDR1 mRNA expressie in de colonkanker cellijnen. Dezelfde methode beschreven in figuur 1 werd gebruikt.
Wij voerden opnieuw de real-time RT-PCR assay voor de kwantitatieve validatie van MDR1
mRNA verkregen uit RT-PCR-bepaling. De MDR1
mRNA werd niet gedetecteerd in de 10 maagkanker cellijnen. Echter, de 9 colonkanker cellijnen, variabele MDR1
mRNA-niveaus kunnen worden gedetecteerd in 7 colonkanker cellijnen behalve SNU-C5 en HT-29 cellen als de RT-PCR data (figuur 3). Figuur 3 MDR1 mRNA expressie in maag- en darmkanker cellijnen. Het niveau van MDR1
mRNA expressie werd bepaald door real-time RT-PCR, en genormaliseerd door die van β-actine mRNA
, dat werd gebruikt als controle voor RNA. Het cDNA reverse-getranscribeerd van het mRNA werd afzonderlijk geamplificeerd met elk primerpaar voor het MDR1 Kopen en β-actine
genen.
Het geheel van MDR1
mRNA niveaus in de maagkanker cellijnen significant lager dan die in de colonkanker cellijnen.
Chemosensitizing effecten van Pgp-remmers in maag- en darmkanker cellen
Hoewel de eiwitgehalten in deze studie werden onderzocht, werden functionele studies uitgevoerd met de Pgp-remmers in de maag en colonkanker cellijnen die het hoogste MDR1
mRNA expressie. Zoals getoond in figuur 4A, de Colo320HSR cellen (colon, mutant p53, hoogste expressie van MDR1
mRNA) werden 14-voudig en > 200 keer resistent tegen paclitaxel dan SNU-C5 en SNU-668-cellen (maag, mutant p53, hoogste expressie van MDR1
mRNA) vergeleken op basis van de IC 50 waarden, respectievelijk, die een aanzienlijk verschil in de PGP levels. Bovendien is de weerstand van de Colo320HSR cellen aan paclitaxel werd teruggedraaid door de Pgp-remmers zoals cyclosporine A, verapamil, en PSC833 (figuur 4B). Echter, deze omkering niet waargenomen in de SNU-C5 (colon, geen MDR1
mRNA) cellen en SNU-668. Dit suggereert dat Pgp expressie coloncarcinoom cellen, maar niet maagkanker cellen werkt functioneel en kan worden geremd door de Pgp-remmers. Figuur 4 Vergelijking van Pgp expressie en functie in maag- en darmkanker cellijnen. (A) Vergelijkende gevoeligheid van Colo320HSR (colon, hoogste), SNU-668 (maag-, hoogste) en SNU-C5 (colon, geen expressie) aan paclitaxel; (B) Effect van gp remmers van de gevoeligheid van Colo320HSR, SNU-668 en SNU-C5 paclitaxel (IC10 concentratie 50 pM, 0,3 nM en 0,5 nM). Gevoeligheid voor paclitaxel werd bepaald met behulp van MTT-test in aanwezigheid of afwezigheid van de Pgp-remmers (cyclosporine A, verapamil en PSC833 van 0,8 uM elk). *, P <. 0,05 versus de controle
Vergelijking van de methylatie status van MDR1 in maag- en darmkanker cellen of the status van methylering werd bepaald door kwantificatie van PCR-gebaseerde methylatie analyse voor een CpG-rijke domein van ongeveer 1 te zijn kb dat exon 1 en intron 1 van de MDR1
promoter. Om de mate van methylering van het MDR1 gen
promotergebied, twee primers (MS1 en MS2) die de
Msp I /Hpa II
plaatsen werden ontworpen van exon 1 en intron 1, respectievelijk bepalen. Het primerpaar MC werd gebruikt als een positieve controle om de kwaliteit van de bron genomisch DNA te bepalen. In tegenstelling, het MN dat de
Msp I /
Hpa II plaats kruisen in het triosefosfaatisomerase-gen promotergebied en niet gemethyleerd werd gebruikt als negatieve controle. Figuur 5B toont typische kwantificatie PCR-gebaseerde methyleringsanalyse beelden van de SNU-5 (maag) en HT-29 (colon) cellen. De kwantificering PCR-gebaseerde methylatie analyse bleek dat geen PCR-producten voor het MS1 en MS2 niet werden geproduceerd van Pst
1-geknipt genoom DNA behandeld met MSP
I (methylatie-ongevoelig enzym). Anderzijds, PCR producten voor MS1 en MS2 in de SNU-5 cellen, maar een PCR-product voor het MS1 alleen in het HT-29 cellen werden verkregen na
Hpa II (methylering-gevoelige enzymen) behandeling, wat aangeeft methylatie CpG in het MS1 en MS2 sites in de SNU-5-cellen en alleen het MS2-site in het HT-29 cellen. Zoals samengevat in Tabel 1, werd methylering gedetecteerd bij het MS1 en MS2 plaatsen van de 9 maagkanker cellijnen behalve SNU-484 maar 2 (SNU-C5 en HCT-116) van het 9 colonkanker cellijnen. Anderzijds werden de HT-29 cellen gemethyleerd Pas bij het MS2 plaats. De SNU-C5, HT-29 (colon) en SNU-16 (maag) cellen niet tot expressie MDR1
mRNA gemethyleerd. Bisulfiet DNA-sequentieanalyse werd uitgevoerd om de methylering te bevestigen. Zoals getoond in Tabel 1, methylering graad (%) van 10 CpG posities op verbruikt MS1 site volledig afgestemd resultaten verkregen door kwantificering PCR gebaseerde methylering analysis.Table 1 methylatie status en de effecten van 5AC en /of TSA MDR1
mRNA expressie en in diverse maag- en darmkanker cellijnen




DNA-methylatie-test




Tissue
Cellijn
5AC
restrictie-enzym
natriumbisulfiet
TSA

5AC + TSA


Fold
Effect
Site
Degree (%)1

Fold

Effect

Fold

Effect

Gastric
SNU-1
32.6
O
MS1
MS2
100
20.7
O
+23.6
D
SNU-5
5.8
O
MS1
MS2
100
1.03
X
6.8 Hotels A
SNU-16
nd
X
MS1
MS2
60
8.4
O
28,9
S
SNU-216
-1,0
X
MS1
MS2
50
8.4
O
8.2
N
SNU-484
-1,3
X
-
- 0
-5,1
X
-0,17
- SNU-601
3.2
O
MS1
MS2
100
3.3
O
13,7
S
SNU-620
67,6
O
MS1
MS2
100
*
X
*
*
SNU-638
68,9
O
MS1
MS2
100
5,7
O
72,9
A
SNU- 668
-1,0
X
MS1
MS2
80
1.8
O
4.4
S
SNU-719
5.8
O
MS1
MS2
100
4.2
O
12.4
S
Colon
SNU-C1
-1.96
X
n.d.
n.d.
0
1.7
O
+1.0
D
SNU-C4
1.0
X
nd
nd
0
-1
X
-1,6
N
SNU-C5
nd
X
MS1
MS2
100
nd
X
8
S
Colo320HSR
1.4
X
nd
nd
0
1.6
O
1,3
D
LoVo
-1,9
X
nd
nd
0
1.1
X
-2
N
DLD-1
1.1
X
nd
nd
0
3,5
O
1,1
D
HT-29 pagina Home
X
nd
MS2
0
∞
O
*
*
HCT-8
1,0
X
nd
nd
0
1,0
X
1.1
N
HCT-116
1.7
O
MS1
MS2
100
1.6
O
1.6
N
1Sequence werd geanalyseerd met behulp van PCR-producten die het verlengde MS1 site die is aangetoond dat een belangrijke rol MDR1
mRNA expressie spelen. n.d., niet gedetecteerd; *, Zeer cytotoxische; ∞, een stijging ten opzichte van geen MDR1 mRNA
meningsuiting; D, is afgenomen; A, additieven; S, synergetische; N, niet veranderd
Figuur 5 De kwantificering PCR gebaseerde methyleringsanalyse van maag- en darmkanker cellijnen. (A) CpG en Hpa II
/Msp I
plaatsen in het menselijke MDR1
promotorgebied. Top: De CpG posities worden weergegeven door de korte verticale balken. De posities van exons 1 en 2 zijn aangegeven bakwagens. De positie die met deze fragmenten worden aangegeven. Midden: Hpa II Twitter /Msp I
herkenningsplaatsen worden vertegenwoordigd door korte verticale balken. Bodem, PCR primers gebruikt methylatie analyse. (B) Vertegenwoordiger methylatie status van de MDR1
promotorregio door kwantificatie van PCR-gebaseerde methylatie analyse in SNU-5 (maag) en HT-29 (colon). 1: MN, Never-gemethyleerd Hpa II Twitter /Msp I
plaats bij de triosefosfaatisomerase gen promoter regio (negatieve controle) (240 bp); 2: MC, de positieve controle primerpaar (240 bp); 3: MS1, Hpa II Twitter /Msp I
plaats 1 (121 bp); 4: MS2, Hpa II
/Msp I
plaats 2 (206 bp)
Effecten van 5-aza-2'-deoxcytidine (5AC) en /of trichostatine A (TSA) op de expressie van. MDR1 mRNA in maag- en darmkanker cellijnen Ondernemingen de DNA-methyltransferase inhibitor 5AC en histon deacetylase (HDAC) remmer TSA zijn welbekend epigenetische genrepressie [22] verlichten. Deze studie onderzocht het effect van 5AC en /of TSA op MDR1
mRNA expressie in de maag- en darmkanker lijnen. In 10 maag- en 9 darmkankercellen werd MDR1
mRNA-expressie bepaald met RT-PCR na ze te behandelen met 2,5 uM 5AC voor 96 uur en /of 100 ng /ml TSA gedurende 48 uur. Een toename werd gedefinieerd in gevallen tonen meer dan een 1,5-voudige toename. Zoals getoond in Tabel 1, de 5AC behandeling verhoogde de MDR1
mRNA niveaus in de SNU-1, -5, -601, -620, -638 en -719 maagkanker cellijnen, en dat in de HCT-116 colon kanker cellijn (figuren 6 en 7). Echter, 5AC veroorzaakte geen MDR1
mRNA expressie, zelfs in de SNU-16 en SNU-C5 en HT-29 cellen waarvan MDR1
gen werd gemethyleerd. De behandeling TSA verhoogde de MDR1
mRNA niveaus in de SNU-1, -16, -216, -601, -638, -668 en -719 maagkanker cellijnen en SNU-C1, Colo320HSR, DLD-1, H29 en HCT-116 colonkanker cellijnen (figuur 6 en 7). 5AC toonde hoge cytotoxiciteit alleen of in combinatie met TSA, met name in het HT-29 cellen. Ook TSA vertoonde sterk cytotoxische activiteit alleen of in combinatie met 5AC, met name in de SNU-620-cellen. Deze studie onderzocht ook de effecten van de gecombineerde behandeling van 5AC met TSA, waarbij de MDR1
mRNA additief in de SNU-5 en -638 cellen verhoogd synergetisch maar in de SNU-16, -601, -668, -719 en SNU-C5-cellen (Tabel 1). Figuur 6 Activering van MDR1 mRNA expressie door 5AC en /of TSA bij maagkanker cellen. Het expressieniveau wordt gerapporteerd als de verhouding van MDR1
/β-actine. Het totale RNA werd geïsoleerd na behandeling met 2,5 uM 5AC voor 96 uur en /of 100 ng /ml TSA gedurende 48 uur. RT-PCR werd uitgevoerd onder toepassing van dezelfde methode beschreven in figuur 1. Figuur 7
Activering van MDR1 mRNA expressie door 5AC en /of TSA in verschillende darmkankercellijnen. RT-PCR-analyse na behandeling van de cellen met 5AC en /of TSA met dezelfde werkwijze in figuur 6. De MDR1 /β-actine
verhouding verkregen via 35 PCR-cyclus nadat TSA in combinatie met 5AC beschreven, en alleen in SNU C5 en HT-29 tot expressie brengen niet MDR1
mRNA respectievelijk weggelaten in het histogram.
Deze resultaten suggereren dat MDR1
mRNA expressie verschillend wordt gereguleerd maag- en darmkanker cellen met betrekking tot de onderdrukking van MDR1
expressie door middel van epigenetische mechanismen zoals DNA-methylatie en /of histon deacetylering.
Discussie
in deze studie hebben we vastgesteld dat de MDR1
mRNA niveaus in de maagkanker cellijnen waren aanzienlijk lager dan die in de colonkanker cellijnen, hoewel er enkele variaties. Deze resultaten zijn consistent met een rapport waarin dat Pgp sterk uitgedrukt op ileum en colon, in een hoeveelheid die geleidelijk afneemt in de proximaal jejunum, twaalfvingerige darm en maag [8]. Aangezien de maag en colon belangrijke rollen spelen bij de spijsvertering en absorptie, respectievelijk, is het niet verrassend dat transporteurs zoals Pgp differentieel tot expressie gebracht in de twee normale weefsels. Onze bevinding dat de differentiële expressie van MDR1
mRNA in kanker cellijnen afkomstig uit de maag en de dikke darm is ook in overeenstemming met gepubliceerde rapporten [23-26]. Immuunpathologische studies is gebleken dat Pgp uitdrukking op menselijke tumoren het vaakst werd ontdekt in de dikke darm, nier en bijnier carcinomen, maar zelden in de longen en maag carcinomen en bepaalde kiemceltumoren [27]. Ondernemingen De drie-weg verbinding tussen DNA-methylatie, chromatine structuur en de genexpressie werd onlangs beoordeeld [28-30]. Een belangrijk gevolg van CpG methylering is de lokale onderdrukking van genexpressie, die kan worden gemedieerd door de directe methylering interferentie van de binding van verschillende transcriptiefactoren. De belangrijkste component van silencing van genexpressie lijkt de binding van methyl-CpG-bindend eiwit 2 (MeCP2), die een affiniteit voor methyl-CpG [31, 32] heeft. DNA demethylering van 5AC veroorzaakt het vrijkomen van de MeCP2 van de promoter, die transcriptionele genexpressie [10] activeert. Het is bekend dat MeCP2 ook verrijkt op de MDR1
promoter en is gerelateerd aan de silencing [33]. 5AC verandert het methyleringspatroon van het MDR
1 promoter in Pgp-negatieve cellen te lijken op die van Pgp-positieve cellen en activeert de promotor zodanig dat MDR1
mRNA detecteerbaar [34].
In deze studie de methyleringsstatus werd ook geanalyseerd om te bepalen of het MDR1
silencing komt door hypermethylering van het promotorgebied.

• Imaging bij de beoordeling van lever- en peritoneale metastasen van maagkanker: een systematische review
• Maagsonde inbrengen onder direct zicht met behulp van de Koning Vision ™ video laryngoscoop: een gerandomiseerde, prospectieve, klinische trial