Epigenetski mehanizmi uključeni u diferencijalne ekspresije MDR1mRNA između želuca i debelog crijeva staničnim linijama i načelima za kliničku kemoterapije

Epigenetički mehanizmi uključeni u diferencijalnoj MDR1 pregled mRNA ekspresije između želuca i debelog crijeva stanične linije i načelima za kliničku kemoterapije pregled apstraktne pregled pozadine
membranskih transportera, kao što su P-glikoproteina (Pgp) je MDR1
genskog produkta, jedan su od uzroka neuspjeha liječenja kod pacijenata oboljelih od raka. U ovoj studiji, epigenetski mehanizmi uključeni u diferencijalnoj MDR1 pregled ekspresije mRNA uspoređeni su između 10 želuca i 9 raka debelog crijeva stanične linije.
Metode
MDR1 pregled razine mRNA određene su pomoću PCR i real-time PCR testovi nakon reverzne transkripcije. Citotoksičnost je izvedena primjenom MTT pokusa. Status Metilacija je istraživao za kvantitativno PCR-based metiliranje i bisulfit DNA sekvenciranje analiza. pregled Rezultati
MDR1 pregled razine mRNA dobivenih 35 ciklusa RT-PCR u želučanih stanica raka samo su usporedivi s onima dobivenim za 22 ciklusi RT-PCR u stanicama raka debelog crijeva. U realnom vremenu RT-PCR analiza je pokazala da MDR1 pregled mRNA nije detektiran u 10 želučane staničnim linijama raka, nego s varijabilnim MDR1 pregled razine mRNA u 7 od 9 kolona staničnim linijama raka, osim SNU-C5 i HT-29 stanice , MTT test je pokazao da PGP inhibitori kao što su ciklosporin A, verapamil i PSC833 osjetljivi Colo320HSR (debelo crijevo, najviše MDR1 pregled izraz), ali ne SNU-668 (želuca, najviši) i SNU-C5 (želuca, bez izražavanja) na paklitaksel. Kvantifikacija PCR-based analiza metilacije pokazala je da 90% želučanih stanica raka, a 33% stanica raka debelog crijeva su metiliran, koji su sasvim podudaraju s rezultatima dobivenim bisulfita analize DNA. 5-aza-2'-deoxcytidine (5AC, inhibitor DNA metiltransferaza) povećao MDR1 pregled razine mRNA u 60% stanica želuca i 11% stanica raka debelog crijeva. Trihostatin A (TSA, HDAC inhibitor) povećao MDR1 pregled razine mRNA u 70% želučanih stanica raka i 55% stanica raka debelog crijeva. Kombinirani tretman s 5AC TSA povećao MDR1 pregled razine mRNA aditivno u 20% želučanih stanice raka, ali sinergistički u 40% želučanih i 11% stanica raka debelog crijeva. Pregled Zaključak
Ovi rezultati pokazuju da je MDR1 pregled mRNA razine u stanicama raka želuca su značajno niže od onih kod stanica raka debelog crijeva, koja je barem djelomično zbog različitih epigenetičkim propisa, kao što su DNA metilacije i /ili je deacetiliranje histona. Ovi rezultati mogu pružiti bolje razumijevanje efikasnosti kombinirane kemoterapije, kao i njihove oralne bioraspoloživosti.
Pozadina pregled želuca i kolorektalnog raka su uzrok pobola i smrtnosti u svijetu danas. Ako ljekovito kirurška resekcija je nemoguće, ove vrste raka reagiraju vrlo slabo na kemoterapiju i rezultira lošom prognozom. Kod oboljelih od raka želuca, 5-fluorouracil (5-FU), na temelju kombinirane kemoterapije su pokušali u cilju poboljšanja ishoda liječenja [1]. S rakom debelog crijeva, 5-FU je najraširenija droga za više od 40 godina. Međutim, druga sredstva, poput irinotekana ili oksaliplatina se koriste za poboljšanje antitumornu učinkovitost u kombinaciji s [2] 5-FU. 5-FU ometa sintezu DNA blokira proizvodnju pirimidin nukleotida dTMP iz s izvatkom u de novo sintezi DNA
inhibicijom timidilat sintaza i uključivanjem fluor-nukleotida u DNA i RNA. [3] pregled P-glikoprotein (Pgp) koji je kodiran pomoću višestruke rezistencije na lijekove 1 (MDR1
) gen je reprezentativni membrana istjecanja pumpa se veže za ATP (ABC) transportera [4-6]. PGP djeluje kao energetski ovisna crpka za istjecanje iz različitih strukturno različitih kemoterapijskih agensa kao što je doksorubicin, vinkristin, vinblastin, paklitaksel, colhicine aktinomicin D, mitomicin C [7], koji se može smanjiti intracelularnu razinu akumulacije lijeka. Kao rezultat toga, prekomjerna ekspresija tih proteina MDR prenosi na stanice raka izbjegavajući citotoksičnih efekata lijekova. U ljudskom crijevu, Pgp jako je izražen na vanjskoj površini površinskih stupčastih epitelnim stanicama tanko i debelo crijevo, a razina ekspresije postupno smanjuje proksimalno u jejunum duodenum i želuca. [8] Regulacija transkripcije aktivnošću MDR1 pregled gena ovisi o nekoliko trans-djelujući proteini koji vežu cis-elemenata konsenzus [9]. Dostupnost promotora elemenata za njihovo vezivanje čimbenika regulirana na razini kromatina okupljanja. Razine oba metilacije DNA i histona deacetilacije reguliraju MDR1 pregled gensku ekspresiju [10-12]. Do sada, regulaciji transkripcije MDR1 pregled ekspresije gena kroz epigenetičkim mehanizama je prijavljen u izrazu u stanicama raka debelog crijeva [13-16], ali nitko u želučanom rak stanica. Osim toga, odnosi između transkripcije ekspresije MDR1 pregled ekspresije gena i epigenetičkim mehanizama u želuca i debelog crijeva stanice raka nisu usporedivi. Stoga je jasno zašto kemoterapije su različito upotrijebiti za liječenje želučanih i kolorektalnim karcinomima te zato MDR1 pregled mRNA ekspresionirana je različito u želučanim i kolorektalnog stanica raka. Dakle, ova studija ispituje da li je stupanj metilacije na promotora mjestu u MDR1 pregled gena usko je povezana s MDR1 pregled ekspresije gena u oba stanica raka.
Metode pregled Kultura stanica pregled 10 ljudskih staničnih linija raka žcluca (SNU-1 -5, -16, -216, -484, -601, -620, -638, -668 i -719) i 9 kolona stanične linije raka (SNU-C1, C4, C5, Colo320HSR, LOVO, DLD-1, HT-29, HCT-8 i HCT-116) dobiveni su iz Cancer Research Center na Seoul National University (Južna Koreja). Sve stanice su uzgajane na 37 ° C u CO 5% 2 atmosfere pomoću 1640 medij (GibcoBRL, žlijezdu Island, NY, USA) s 10% toplinski inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma (Sigma, St. Louis, MO, SAD). Stanice su tako zadržane ili kao suspenzije ili jednoslojnoj kulturi, a rasađivane su sve dok nisu dostigli konfluenciju.
Unazad lančana reakcija polimeraze transkripcijom (RT-PCR), test pregled Ukupna RNA je ekstrahirana pomoću MagExtractor ® za MFX-2100 (Tovobo, Osaka, Japan) auto-nukleinske kiseline sustav za pročišćavanje, u skladu s uputama proizvođača. MDR1 pregled i P-aktin
mRNA transkripti su detektirani pomoću testa RT-PCR. MDR1 pregled je detektirana s 5 'i 3' početnice koje odgovaraju nukleotida 907-930 (5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 ') i 1179-1201 (5'-TGCCAAG-ACCTCTTCAGCTACTG-3'), respektivno, objavljena sekvenca [17], čime se dobiva 296-bp PCR produkt. β-aktin ekspresija pregled mRNA je korišten kao kontrola za količinu RNA, te se detektira s 5 'i 3' primeri odgovara nukleotidima 1912-1932 (5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 ') i 2392-2412 ( 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3 '), odnosno, objavljene cDNA sekvence [18], dajući 501-bp PCR produkt. RNA iz svakog uzorka je obratnoj transkripciji pomoću 200 jedinica Molonev mišji virus leukemije reverzne transkriptaze (Gibco-Bethesta istraživački laboratorij, Grand Island, NY, USA) i 0.18 ug /ml oligo (dT 20) početnicu za 1 sat na 37 ° C. Dobiveni cDNA od želučanih stanica raka (2-struki razrijeđen cDNA u stanicama raka debelog crijeva) su povećani sa 1,25 jedinica Taq polimeraze (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 1 mM MgCl 2 i 10 pmol svakog primera u termalni ciklički uređaj (GeneAmp 2400, PE Applied Biosystems, Boston, MA, USA) za 22 ciklusa s stanica raka debelog crijeva, ali 35 ciklusa s želučanim stanica raka za MDR1
i 17 ciklusa za P-aktin pregled sekvencijalnog denaturacije (94 ° C za 30 s), žarenje (65 ° C za MDR1 pregled, 53 ° C za P-aktin
), te nastavak (72 ° C kroz 30 s). Nakon konačnog ciklusa svi PCR produkti su podvrgnuti konačno proširenje od 5 min na 72 ° C. Za kvantitativno određivanje, 3 uCi od [α- 32P] dCTP se doda u reakcijsku smjesu. Nakon PCR, PCR proizvodi su kombinirani i zatim elektroforezi na 7,5% nondenaturing poliakrilamidnom gelu. Bendovi su skenirane sa denzitometrom (PDI, Huntington Station, NY, USA). Iznos svake mRNA transkripta je normaliziran s onom svake P-aktin
mRNA. Pregled, vađenje proteina i Western blot analiza pregled Ukupno Stanični lizati pripremljeni su od strane ližu sakupljenih stanica u ekstrakcije puferu (1% NP-40 , 0,5% natrijeva deoksikolata, 0.1% SDS u fiziološkoj otopini puferiranoj fosfatom) uz dodatak 2 mM fenilmetilsulfonil fluorida (Sigma) i 10 ug /ml leupeptina (Sigma). DNA je presječena s ultrazvukom i Western blot analiza izvedena je pomoću malo modificirani metode koju je prvi opisao Towbin et al. [19]. Proteini su prebačeni na nitroceluloznu membranu elektroblotingom pomoću struje 60 V preko noći. Membrana se inkubira u blokirajućoj otopini (5% obrano mlijeko) 1 sat na sobnoj temperaturi, isprane i zatim inkubirane s kozjim primarni poliklonskim protutijelom (1: 1000, Santa Cruz, Biotechnology, CA, USA) za PGP. Membrana je isprana i inkubirana sa peršin peroksidazu- konjugiranih sekundarnih antitijela (razrijeđenog 1: 1000), od svakog IgG za domaćina primarnih antitijela tijekom 1 sata. Membrana je označena pomoću reagensa detekcije detekciju kit ECL (Amersham, Piscataway, NJ, USA). Pregled u realnom vremenu PCR pregled Ekstrakcija mRNA provedena je prema RNeasy proctocol (Qiagen, Hilden, Njemačka ). Jedan mikrogram ukupne RNA obrnuto prepisana u cDNA u volumenu od 20 ul sa 200 jedinica Molonev murine leukemia virus reverzne transkriptaze (Gibco-Bethesta Research Laboratory, Grand Island, NY, USA) i 0.18 ug /ml oligo (dT 20) klice (Promega, Madison, SAD) prema proizvodnji priručnik. Real-time PCR je izveden sa svjetlom biciklista 2.0 instrumenta (Roche, Mannheim, Njemačka) pomoću Fast Start DNK Master SYBR Green I Kit (Roche). Za provjeru ispravnog amplifikacijskog produkta, PCR su analizirani na 2% -tnom agaroznom gelu, obojani s etidij bromidom. Sekvence prajmera su kako slijedi: za p-aktin
, 5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 'i 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3'; za MDR1 Netlogu, 5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 'i 5' TGCCAAGACCTCTTCAGCTACTG-3 '. Svaka reakcija (20 ul) sadržavala 4 jal cDNA (10 puta razrjeđivanje), 4 mM MgCl 2, 10 pmol svakog primera i 2 ul Fast Start DNA Master SYGR Green I Mix puferu, dNTP, SYBR Green boja i Tag polimeraze. Postupak amplifikacija ciljnih gena bio je sljedeći: pre-denaturacije na 95 ° C tijekom 10 minuta, 40 ciklusa denaturacije na 95 ° C tijekom 15 sekundi, povećanje otpornosti na MDR1
na 67 ° C (p-aktin
na 55 ° C) u trajanju od 5 sekundi i ekstenzijom na 72 ° C tijekom 7 sekundi (β-aktin
tijekom 21 sekundi). Analiza taljenje krivulja je izveden da bi potvrdili proizvodnju jednog proizvoda. Negativne kontrole bez predloška su proizvedeni za svaku vožnju. Gene Expression vrijednosti (relativna razina mRNA) izražena kao omjer (razlika između vrijednosti Ct = točka na krivulji u kojoj je količina fluorescencije počinje naglo rasti, obično nekoliko standardne devijacije iznad početne vrijednosti, naziva se prag ciklusa ( vrijednosti CT).) između gena od interesa (MDR1 pregled mRNA) i unutarnjeg referentnog gena (β-aktin mRNA
) koji daju Normalizirajući faktor za količinu RNA izolirane iz uzorka. Analiza podataka izvedena je pomoću Light ciklički softvera verzije 4.0 (Roche). Pregled citotoksičnosti Test pomoću MTT testa pregled In vitro pregled citotoksičnost lijekova se mjeri koristeći test MTT, kao što je opisano na drugom mjestu [20]. Stanice su zasijane u 2 × 10 4cells /ml i inkubiraju preko noći kako bi se omogućilo vezanje i stabilizaciju. Stanice su inkubirane na 37 ° C tijekom 3 dana, a MTT [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolij-bromid, Sigma] otopinu se zatim doda u svaku jažicu koja sadrži stanice. Nakon mućkanja kroz 1 min, ploča se inkubira tijekom 5 sati. Kristali formazana iz suspendirane kulture je otopljeno u 150 ul dimetilsulfoksida (DMSO) i nakon uklanjanja supernatanta. Optička gustoća jažica je mjerena s čitačem za mikroploče (μQuant, Bio-tek Instruments Inc., Winooski, VT, USA) pri 540 nm. Pregled Kvantifikacija PCR-based analizom metilacije pregled pet mikrograma genomske DNA obradi se s 50 u od MSP pregled i ili Hpa pregled II (Fermantas MBI, Vilnius, Litva), na 37 ° C tijekom 16 sati, dodan je u 1/15 volumena 0,6 M Tris (pH 7,5) i 1,5 M NaCl, i obrađeno s 50 u od Pst
i (New England Biolabs, MA, USA) na 37 ° C tijekom 8 sati. Metilacija status MDR1 pregled 5'CpG promotorske regije ispitana je analizom 100 ng restriktivnog-probavlja DNK PCR-om u 25 ul reakcije s 1,25 jedinica Taq DNA polimeraze i 10 pmol svakog primera. Analiza metilacije Kvantifikacija PCR-based provodi se u skladu s postupkom koji je ranije objavljen [11]. PCR prajmera upotrijebljene su 5'-TCTAGAGAGGTGCAACGGAAG-3 'i 5'-TCAGCCTCACCACAGATGAC-3' za MS1- metilacije osjetljiv klicama (121 bp), 5'-TGAAGTCCTCTGGCAAGTCC-3 'i 5'-ATTCTCCCTCCCGGTTCC-3' za MS2 metilacije osjetljiv primer (206 bp), 5'-ATTTCACGTCTTGGTGGCC-3 'i 5'-TCCAGTGCCACTACGGTTT-G-3'for MC pozitivna kontrola primera (240 bp), i 5'-GGCGAAGGAGGT-TGTCTATTC-3' i 5 ' -AACGTTCTAGGAGAGTCGGG-3 'za MN negativne kontrole klicama (240 bp) koji su izvedeni iz gena promotorske regije triozafosfat izomeraza. Povećavanje se provodi u DNA Thermal Cycleru 35 ciklusa za MN, MK, MS1- i MS2 primera uključuju redoslijedom denaturacije (95 ° C, 30 s), žarenja (60 ° C za 30 s), te nastavak (72 ° C 30 s). Nakon konačnog ciklusa svi PCR produkti su podvrgnuti konačno proširenje za 5 minuta na 72 ° C. PCR produkti su razdvojeni pomoću elektroforeze u 7% PAGE gelovima. Gelovi su zatim obojeni etidij bromida i fotografirao pomoću slike stanicu Kodak 4000 MM (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA).
Bisulfita DNK kako pregled Jedan J..lg genomske DNA kemijski modificirana je natrijem bisulfita pomoću EZ metilacije DNA kompleta (Zymo istraživanja, Orange, CA, USA) za pretvaranje nemetilirane citozini da uracile a ostavljajući metilirani citozini nepromijenjen. Bisulfitnog modificirani DNA korištena je za PCR amplifikaciju. Prošireni MS1 primer sadrži 10 CpG mjesta, i 2 SP-1 mjesta koja su obvezna za funkcionalnom MDR1 pregled promotor biti aktivirana [21]. Nizovi primera za amplifikaciju niti bisulfitnih tretiranih (223 bp) su kako slijedi: S: 5'-GGAAGTTAGAATATTTTTTTTGGAAAT-3 '; AS: 5'-ACCTCTACTTCTTTAAACTTAAAAAAACC-3 '. Povećavanje se provodi u istim PCR uvjetima, osim 48 ° C Temperatura žarenja i 45 PCR ciklusa. Nakon konačnog ciklusa svi PCR produkti su podvrgnuti konačno proširenje pri 72 ° C tijekom 5 minuta. Slijed PCR proizvoda je analiziran pomoću automatiziranog sekvencera (tnom City, CA, USA). Pregled, Statistička analiza pregled Rezultati su prikazani kao srednja vrijednost ± SE i podaci su analizirani korištenjem t-test pregled. P vrijednosti < 0,05 smatrano je kao značajno.

• Imaging u procjenjivanju jetrene i peritonealnih metastaze raka želuca: sustavni review
• Želučani cijev za umetanje pod izravnim viziju pomoću kralj Vision ™ videa laringoskop: randomizirano, prospektivno, klinička trial