Epigenetische Mechanismen der differentiellen MDR1mRNA Ausdruck zwischen Magen- und Darmkrebs-Zelllinien und Gründe für die klinische chemotherapy

epigenetische Mechanismen in Differential MDR1
mRNA-Expression zwischen Magen- und Darmkrebs-Zelllinien und Gründe für die klinische Chemotherapie
Zusammenfassung
Hintergrund
Die Membrantransporter wie P-Glykoprotein (Pgp), die MDR1
Genprodukts, sind eine der Ursachen für ein Therapieversagen bei Krebspatienten. In dieser Studie wurden die epigenetischen Mechanismen in der Differential MDR1
mRNA-Expression zwischen 10 Magen- und 9 Darmkrebs-Zelllinien verglichen.
Methoden
Die mRNA-Spiegel
MDR1 wurden mittels PCR ermittelt und in Echtzeit PCR-Assays nach der reversen Transkription. Die Zytotoxizität wurde unter Verwendung des MTT-Assay durchgeführt. Methylierungsstatus durch Quantifizierung PCR-basierte Methylierung und Bisulfit-DNA-Sequenzierung untersucht wurde analysiert.
Ergebnisse | MDR1
mRNA-Spiegel von 35 Zyklen von RT-PCR in Magenkrebszellen erhalten wurden, waren nur vergleichbar mit denen von 22 erhalten Zyklen von RT-PCR in Dickdarmkrebszellen. Echtzeit-RT-PCR-Analyse zeigte, dass MDR1
mRNA nicht in den 10 Magenkrebs festgestellt wurde Zelllinien, aber variable MDR1
mRNA Niveaus in 7 von 9 Kolon-Krebszelllinien mit Ausnahme der SNU-C5 und HT-29-Zellen . MTT-Test zeigte, dass Pgp-Inhibitoren wie Cyclosporin A, Verapamil und PSC833 Colo320HSR sensibilisiert (Kolon, höchste MDR1
Ausdruck), aber nicht SNU-668 (Magen-, höchste) und SNU-C5 (Magen-, kein Ausdruck) Paclitaxel. Quantifizierung PCR-basierten Methylierungsanalyse ergab, dass 90% der Magenkrebszellen, und 33% der Dickdarmkrebszellen wurden methyliert, die vollständig mit den durch Bisulfit-DNA-Sequenzierungsanalyse erhaltenen Ergebnissen übereinstimmten. 5-Aza-2'-deoxcytidine (5AC, eine DNA-Methyltransferase-Inhibitor) erhöht die MDR1
mRNA-Mengen in 60% der Magen-Zellen und in 11% der Dickdarmkrebszellen. Trichostatin A (TSA, Histon-Deacetylase-Inhibitor) erhöht die MDR1
mRNA-Spiegel in 70% von Magenkrebszellen und 55% der Zellen Darmkrebs. Die kombinierte Behandlung mit TSA 5AC erhöht die mRNA-Spiegel
MDR1 additiv in 20% von Magenkrebszellen, aber synergistisch in 40% der Magen-und 11% der Dickdarmkrebszellen.
Schlussfolgerung
Diese Ergebnisse zeigen, daß der MDR1-mRNA-Spiegel in
sind Magenkrebszellen deutlich niedriger als die in Dickdarmkrebszellen, die aufgrund unterschiedlicher epigenetische Vorschriften zumindest teilweise ist, wie beispielsweise DNA-Methylierung und /oder Histon-Deacetylierung. Diese Ergebnisse können zu einem besseren Verständnis der Wirksamkeit von kombinierten Chemotherapie liefern sowie ihre orale Bioverfügbarkeit.
Hintergrund
Magen-und Darmkrebs heute eine Ursache für Morbidität und Mortalität in der Welt sind. Wenn eine kurative chirurgische Resektion unmöglich ist, reagieren diese Krebsarten sehr schlecht auf Chemotherapie und was zu einer schlechten Prognose. Bei Patienten mit Magenkrebs, 5-Fluorouracil (5-FU) basierte Kombinationschemotherapie haben, um die Behandlungsergebnisse zu verbessern [1] versucht worden. Mit Darmkrebs hat 5-FU die am weitesten verbreitete Droge seit mehr als 40 Jahren. Jedoch können auch andere Mittel, wie Irinotecan oder Oxaliplatin verwendet wurden, um die Anti-Tumor-Wirksamkeit in Kombination mit 5-FU [2] zu verbessern. 5-FU stört die DNA-Synthese durch die Herstellung von Pyrimidin-Nukleotid-dTMP von dUMP Blockierung während de novo
DNA-Synthese durch die Hemmung der Thymidylat-Synthase als auch durch den Einbau von Fluor-Nukleotiden in die DNA und RNA [3].
P-Glykoprotein (gp) kodiert durch die multidrug resistance 1 (MDR1
) Gen ist eine repräsentative Membran Effluxpumpe der ATP-bindenden Kassette (ABC) Transporter [4-6]. Pgp fungiert als energieabhängige Effluxpumpen von einer Vielzahl von strukturell verschiedenen chemotherapeutischen Mitteln, wie Doxorubicin, Vincristin, Vinblastin, Paclitaxel, colhicine, Actinomycin D und Mitomycin C [7], die die intrazellulären Pegel von Arzneimittelakkumulation verringern kann. Als Ergebnis Überexpression dieser Proteine ​​verleiht MDR zu Krebszellen durch die cytotoxischen Wirkungen von Medikamenten zu entziehen. Im menschlichen Darm ist Pgp auf der apikalen Oberfläche der oberflächlichen säulen Epithelzellen des Ileum und Colon stark exprimiert und dessen Expressionsniveau allmählich abnimmt proximal in das Jejunum, Duodenum und den Magen [8]. Regulierung der Transkriptionsaktivität des Gens MDR1
hängt von mehreren trans-wirkenden Proteine, die die Konsensus-cis-Elemente [9] binden. Die Zugänglichkeit der Promotorelemente, um ihre Bindungsfaktoren auf der Ebene des Chromatins Anordnung geregelt. Die Pegel der beiden DNA-Methylierung und Histondeacetylierung regulieren MDR1
Genexpression [10-12]. Bisher ist die transkriptionelle Regulation von MDR1
Genexpression durch epigenetische Mechanismen wurde in Expression in Dickdarmkrebszellen [13-16], aber keine in Magenkarzinome Zellen berichtet. Darüber hinaus haben die Beziehungen zwischen der transkriptionelle Expression von MDR1
Genexpression und epigenetische Mechanismen in Magen und Dickdarmkrebszellen nicht verglichen worden. Daher ist es unklar, warum haben Chemotherapien anders Magen- und Darmkrebs eingesetzt zu behandeln und warum MDR1
mRNA differentiell in Magen-und Darmkrebs-Zellen exprimiert wird. Daher dieser Studie untersucht, ob der Methylierungsgrad an der Promotorstelle des MDR1
Gen eng mit MDR1
Genexpression in sowohl Krebszellen.
Methods
Zellkultur
zugeordnet ist Die 10 menschlichen Magenkrebszelllinien (SNU-1, -5, -16, -216, -484, -601, -620, -638, -668 und -719) und 9 Darmkrebs-Zelllinien (SNU-C1, C4, -C 5, Colo320HSR, LoVo, DLD-1, HT-29, HCT-8 und HCT-116) wurden aus dem Krebsforschungszentrum an der Seoul National University (Südkorea) erhalten wird. Alle Zellen wurden bei 37 ° C in einer 5% CO 2 -Atmosphäre unter Verwendung von RPMI 1640-Medium (GibcoBRL, Gland Island, NY, USA) mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (Sigma, St. Louis, MO, USA). Die Zellen wurden entweder als Suspension oder einer Monolayer-Kultur gehalten und subkultiviert, bis sie Konfluenz erreichten.
Transkriptions-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) -Assay Rückwärts
Die Gesamt-RNA wurde extrahiert unter Verwendung MagExtractor ® für die MFX-2100 (Toyobo, Osaka, Japan) auto-Nukleinsäure-Reinigungssystem, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die MDR1
und β-Actin-mRNA-Transkripte
wurden unter Verwendung des RT-PCR-Assay nachgewiesen. MDR1
Expression wurde mit dem 5 detektiert 'und 3'-Primer entsprechend den Nukleotiden 907 bis 930 (5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3') und 1179 bis 1201 (5'-TGCCAAG-ACCTCTTCAGCTACTG-3 ') jeweils von die veröffentlichten cDNA-Sequenz [17], ein 296-bp-PCR-Produkt erhalten. β-Actin-mRNA-Expression
wurde als Kontrolle für die Menge an RNA verwendet, und wurde mit der 5 erkannt 'und 3'-Primer entsprechend den Nukleotiden 1912 bis 1932 (5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3') und 2392 bis 2412 ( 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3 ') jeweils von der cDNA-Sequenz veröffentlicht [18], ein 501-bp-PCR-Produkt ergeben. Die RNA aus jeder Probe wurde revers transkribiert unter Verwendung von 200 Einheiten Moloney murine Reverse Transkriptase-Leukämie-Virus (Gibco-Bethesta Research Laboratory, Grand Island, NY, USA) und 0,18 &mgr; g /ml Oligo (dT 20) Primer 1 h bei 37 ° C. Die resultierende cDNA des Magenkrebszellen (2-fold cDNA in den Dickdarmkrebszellen verdünnt) wurden mit 1,25 Einheiten Taq-Polymerase (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) amplifiziert, 1 mM MgCl 2 und 10 pmol eines jeden Primers in einem Thermocycler (GeneAmp 2400, PE Applied Biosystems, Boston, MA, USA) für 22 Zyklen mit den Dickdarmkrebszellen, aber 35 Zyklen mit den Magenkrebszellen für MDR1
und 17 Zyklen für β-Actin
der sequentiellen Denaturierung (94 ° C für 30 s), Annealing (65 ° C für MDR1
, 53 ° C für β-Actin
) und Verlängerung (72 ° C für 30 s). Nach dem letzten Zyklus wurden alle PCR-Produkte bis zu einer endgültigen Verlängerung von 5 Minuten bei 72 ° C unterzogen. Zur Quantifizierung, 3 &mgr; Ci [α- 32P] dCTP zu jeder Reaktionsmischung zugesetzt. Nach der PCR wurden die PCR-Produkte kombiniert und dann auf einem 7,5% denaturierenden Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt. Die Banden wurden mit einem Densitometer (PDI, Huntington Station, NY, USA) gescannt. Die Menge jedes Transkript mRNA wurde normiert, dass jedes β-Actin-mRNA
.
Protein Extraktion und Western blot analysis
Gesamt-Zelllysate wurden hergestellt, indem geernteten Zellen in Extraktionspuffer Lysieren (1% NP-40 , 0,5% Natriumdesoxycholat, 0,1% SDS in phosphatgepufferter Kochsalzlösung), supplementiert mit 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (Sigma) und 10 ug /ml Leupeptin (Sigma). DNA wurde durch Beschallung und Western-Blotting-Analyse geschert wurde unter Verwendung einer geringfügigen Modifikation des Verfahrens durchgeführt, zuerst von Towbin et al. [19]. Proteine ​​wurden auf eine Nitrocellulosemembran überführt durch Elektroblotting einen Strom von 60 V über Nacht verwendet. Die Membran wurde in Blockierungslösung (5% Magermilch) für 1 h bei Raumtemperatur, gewaschen, inkubiert und dann mit primären polyklonalen Ziegen-Antikörper (1: 1000, Santa Cruz, Biotechnology, CA, USA) inkubiert Pgp. Die Membran wurde gewaschen und mit Meerrettich-Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörper (1: 1000 verdünnt) inkubiert für 1 Stunde gegen je IgG für Hosts von primären Antikörpern. Die Membran wurde dann gefärbt unter Verwendung des Nachweisreagens des ECL-Nachweis-Kit (Amersham, Piscataway, NJ, USA).
Real-time PCR
Extraktion der mRNA durchgeführt wurde nach dem RNeasy proctocol (Qiagen, Hilden, Deutschland ). Ein Mikrogramm Gesamt-RNA wurde revers transkribiert in cDNA in einem Volumen von 20 ul mit 200 Einheiten Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transkriptase (Gibco-Bethesta Research Laboratory, Grand Island, NY, USA) und 0,18 &mgr; g /ml Oligo (dT 20) Primer (Promega, Madison, USA) gemäß der Bedienungsanleitung des Herstellers. Real-time PCR wurde mit dem Light Cycler 2.0 Instrument (Roche, Mannheim, Deutschland) unter Verwendung der Fast Start DNA Master SYBR Green I Kit (Roche) durchgeführt. Zur Überprüfung der korrekten Amplifikationsprodukts wurden PCRs auf einem 2% Agarosegel analysiert, mit Ethidiumbromid angefärbt. Die Sequenzen der Primer sind wie folgt: für β-Actin
, 5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 'und 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3'; für MDR1
, 5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 'und 5'-TGCCAAGACCTCTTCAGCTACTG-3'. Jede Reaktion (20 ul) enthielt 4 ul cDNA (10-fache Verdünnung), 4 mM MgCl 2, 10 pmol von jedem Primer und 2 ul Fast Start DNA Master SYGR Green I Mix mit Puffer, dNTPs, SYBR Green Farbstoff und Taq-Polymerase. Das Amplifikationsverfahren von Zielgenen war wie folgt: bei 95 ° C vorge Denaturierung für 10 min, 40 Zyklen von 15 sec, Annealing für MDR1
bei 67 ° C (β-Actin
bei 95 ° C denaturieren bei 55 ° C) für 5 sec, und Verlängerung bei 72 ° C für 7 sec (β-Actin
für 21 sec). Schmelzkurvenanalyse erfolgte Erzeugung eines einzelnen Produktes zu bestätigen. Negative Kontrollen ohne Vorlage wurden für jeden Durchlauf produziert. Die Genexpression Werte (relative mRNA-Spiegel) als Verhältnisse ausgedrückt (Differenz zwischen den Ct-Werten = Der Punkt auf der Kurve, in der die Menge der Fluoreszenz schnell zu erhöhen beginnt, in der Regel ein paar Standardabweichungen oberhalb der Basislinie wird die Schwellenzyklus bezeichnet ( Ct-Wert).), die zwischen dem Gen von Interesse (MDR1
mRNA) und einem internen Referenzgens (β-Actin
mRNA), die einen Normierungsfaktor für die Menge an RNA bereitzustellen, aus einer Probe isoliert. unter Verwendung von MTT-Test Die Analyse der Daten wurde unter Verwendung von Light Cycler-Software Version 4.0 (Roche).
Zytotoxizitätstest durchgeführt
Die in-vitro-Zytotoxizität
der Medikamente gemessen wurde ein MTT-Test unter Verwendung, wie an anderer Stelle beschrieben [20]. Die Zellen wurden mit einer 2 ausgesät × 10 4cells /ml und über Nacht zur Befestigung und Stabilisierung zu ermöglichen, inkubiert. Die Zellen wurden 3 Tage lang bei 37 ° C inkubiert und MTT [3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide, Sigma] Lösung wurde dann zu jeder Vertiefung, die Zellen enthält. Nach dem Schütteln für 1 min wurde die Platte für 5 Stunden inkubiert. Formazan-Kristalle der Suspensionskultur wurden in 150 &mgr; l Dimethylsulfoxid (DMSO) nach dem Entfernen der Überstand gelöst. Die optische Dichte der Wells wurde mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät (μQuant, Bio-tek Instruments Inc., Winooski, VT, USA) bei 540 nm gemessen. Die Quantifizierung
PCR-basierten Methylierungsanalyse
Fünf Mikrogramm der genomischen DNA wurde mit 50 U Msp verdaut
I oder Hpa
II (Fermentas MBI, Vilnius, Litauen) bei 37 ° C für 16 Stunden, zu einer 1/15 Volumen von 0,6 M Tris (pH 7,5) und 1,5 M NaCl, und mit 50 U PstI verdaut
I (New England Biolabs, MA, USA) bei 37 ° C für 8 Stunden. Der Methylierungsstatus der Promotorregion 5'CpG
MDR1 wurde durch die Analyse von 100 ng restriktionsverdaut DNA durch PCR in 25 ul-Reaktionen, enthaltend 1,25 Einheiten Taq-DNA-Polymerase und 10 pmol von jedem Primer untersucht. Die Quantifizierung der PCR-basierten Methylierungsanalyse wurde nach früher berichtet dem Verfahren durchgeführt [11]. Die verwendeten PCR-Primer waren 5'-TCTAGAGAGGTGCAACGGAAG-3 'und 5'-TCAGCCTCACCACAGATGAC-3' für die MS1 methylierungssensitiven Primern (121 bp), 5'-TGAAGTCCTCTGGCAAGTCC-3 'und 5'-ATTCTCCCTCCCGGTTCC-3' für die MS2 Methylierungs-sensitive Primer (206 bp), 5'-ATTTCACGTCTTGGTGGCC-3 'und 5'-TCCAGTGCCACTACGGTTT-G-3'for die MC positive Kontroll-Primer (240 bp) und 5'-GGCGAAGGAGGT-TGTCTATTC-3' und 5 ' -AACGTTCTAGGAGAGTCGGG-3 'für MN negativen Kontroll-Primer (240 bp) von der Triosephosphatisomerase-Gen-Promotorregion abgeleitet. Die Amplifikation wurde in einem DNA-Thermocycler für 35 Zyklen für den MN, MC, MS1 und MS2 Primern denen in Folge der Denaturierung (95 ° C für 30 s), Annealing (60 ° C für 30 s) und Verlängerung (72 ° C durchgeführt, für 30 s). Nach dem letzten Zyklus werden alle PCR-Produkte wurden für 5 min bei 72 ° C bis zu einer endgültigen Verlängerung unterzogen. Die PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese auf 7% PAGE Gelen getrennt. Die Gele wurden dann mit Ethidiumbromid gefärbt und fotografiert von Kodak Image Station mit 4000 mm (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA). Bisulfit-DNA-Sequenzanalyse
Eine ug genomische DNA chemisch durch Natrium modifiziert wurde Bisulfit die EZ DNA-Methylierungs-Kit (Zymo Research, orange, CA, USA) nicht methylierten Cytosine zu urazile zu konvertieren, während methylierte Cytosine unverändert bleiben. Die Bisulfit-modifizierte DNA wurde zur PCR-Amplifikation verwendet. Erweiterte MS1 Primer enthält 10 CpG-Stellen und 2 SP-1-Stellen, die obligatorisch sind für die funktionelle MDR1
Promotor aktiviert werden [21]. Die Primersequenzen für die Amplifikation von Bisulfit-behandelter Stränge (223 bp) waren wie folgt: S: 5'-GGAAGTTAGAATATTTTTTTTGGAAAT-3 '; AS: 5'-ACCTCTACTTCTTTAAACTTAAAAAAACC-3 '. Amplifikation wurde unter den gleichen PCR-Bedingungen, ausgenommen 48 ° C Annealing-Temperatur und 45 PCR-Zyklen durchgeführt. Nach dem letzten Zyklus werden alle PCR-Produkte wurden für 5 min bei 72 ° C bis zu einer endgültigen Verlängerung unterzogen. Sequenz der PCR-Produkte wurde mit Hilfe eines automatisierten Sequenzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) analysiert.
Statistische Analyse
Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SE dargestellt und die Daten wurden unter Verwendung des t-Tests von Student analysiert
. P-Werte < 0,05 wurden als signifikant angesehen.
Ergebnisse | Vergleich der Expressionsprofile von MDR1 mRNA in Magen-und Darmkrebs-Zellen
MDR1
mRNA-Expression wurde mit der RT-PCR-Assays mit dem Expressionsniveau analysiert normalisiert mit der β-Actin
mRNA-Spiegel nach 17 Zyklen PCR erhalten. Die MDR1
mRNA wurde nicht nach 22 Zyklen von PCR in den 10 Magenkrebs-Zelllinien festgestellt, konnte aber mit variablen Ebenen nach 35 PCR-Zyklen mit Ausnahme von SNU-16 erfasst werden, einen signifikant niedrigen Pegel des MDR1 darauf hindeutet
mRNA-Expression in den Magenkrebszellen getestet (Abbildung 1). Wie in 1 gezeigt ist, entsprechend der Rangfolge auf der MDR1-β-Actin
Verhältnis in den Magenkrebszelllinien wie folgt: SNU-668 (1,51) > SNU-484 (1,37) > SNU-5 (0,63) > SNU-601 (0,33) > SNU-719 (0,32) > SNU-216 (0,29) > SNU-638 (0,07) > SNU-1 (0,04) > SNU-16 (0). Der 9 Kolonkrebs-Zelllinien konnte variable MDR1
mRNA-Spiegel in 7 Kolon-Krebszelllinien nach 22 Zyklen der PCR, aber nicht in der SNU-C5 und HT-29-Zellen nachgewiesen werden. Die MDR1
mRNAs der beiden letztgenannten Zellen werden konnten auch nach 35 Zyklen der PCR nachgewiesen. Diese Ergebnisse deuten auf eine relativ hohe MDR1
mRNA-Expression trotz einiger Ausnahmen in den Darmkrebszellen. Wie in 2 gezeigt ist, entsprechend der Rangfolge auf der MDR1
/β-Actin
Verhältnis in den Zelllinien, Colonkrebs ist wie folgt: Colo320HSR (0,90) > SNU-C4 (0,45) > HCT-8 (0,26) > SNU-C1 (0,12) > HCT-116 (0,11) > LoVo (0,10) > DLD-1 (0,07) > SNU-C5 (0) = HT-29 (0). Abbildung 1 MDR1 mRNA-Expression in Magenkrebs-Zelllinien. Die Höhe der MDR1
mRNA-Expression wurde durch RT-PCR bestimmt und durch die von mRNA β-Actin
normiert, die als Kontrolle für die RNA verwendet wurde. Die cDNA revers transkribiert aus der mRNA separat mit jedem Primerpaar für MDR1
und β-Actin
Gene amplifiziert. Aliquots jeder PCR-Reaktionsgemisches wurden auf 7% Polyacrylamid-Gel aufgetrennt. Das Gel wurde getrocknet und über Nacht auf einem Röntgenfilm belichtet.
2 MDR1 mRNA-Expression in den Zelllinien Darmkrebs Abbildung. Die gleiche Methodik berichtet in Figur 1 verwendet.
Wir führten wieder die Echtzeit-RT-PCR-Assay für die quantitative Validierung von MDR1
mRNA-Mengen von RT-PCR-Assay erhalten. Die MDR1
mRNA wurde nicht in den 10 Magenkrebs-Zelllinien nachgewiesen. Jedoch der 9 Kolon-Krebszelllinien, variable MDR1
mRNA-Spiegel in 7 Kolon-Krebszelllinien mit Ausnahme der SNU-C5 und HT-29-Zellen, wie die RT-PCR-Daten (Figur 3) festgestellt werden konnte. Abbildung 3 MDR1 mRNA-Expression in Magen- und Darmkrebs-Zelllinien. Die Höhe der MDR1
mRNA-Expression wurde durch real-time RT-PCR bestimmt und dadurch, dass der mRNA-β-Actin
normalisiert, die als Kontrolle für die RNA verwendet wurde. Die cDNA aus der mRNA-revers transkribiert wurde separat mit jedem Primerpaar für MDR1
und β-Actin
Gene verstärkt. Zusammengenommen
, die MDR1
mRNA-Spiegel in den Magen-Krebs-Zelllinien waren signifikant niedriger als die in den Darmkrebs-Zelllinien.
chemosensibilisierenden Effekte von P-gp-Inhibitoren bei Magen- und Darmkrebszellen
Obwohl die Proteinspiegel wurden in dieser Studie nicht untersucht, funktionelle Studien wurden unter Verwendung der Pgp-Inhibitoren in der Magen durchgeführt und Darmkrebs-Zelllinien, die höchste Stufe der MDR1
mRNA-Expression exprimieren. Wie in 4A gezeigt, sind die Colo320HSR Zellen (Colon, mutant p53, höchste Expression von MDR1
mRNA) wurden 14-fach und > 200mal resistenter gegenüber Paclitaxel als die SNU-C5 und SNU-668-Zellen (Magen-, mutiertem p53, höchste Expression von MDR1
mRNA) im Vergleich auf der Basis des IC 50 Werte, die jeweils, was ein signifikanter Unterschied in den Pgp Ebenen. Darüber hinaus wurde der Widerstand der Colo320HSR Zellen zu Paclitaxel durch die gp-Inhibitoren wie Ciclosporin A umgekehrt, Verapamil und PSC833 (4B). Allerdings wurde diese Umkehr nicht in der SNU-C5 (Kolon, keine MDR1
mRNA) Zellen sowie SNU-668 beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass Pgp in Darmkrebszellen exprimiert, aber nicht Magenkrebszellen wirkt funktionell und können durch die gp-Inhibitoren gehemmt werden. Abbildung 4 Vergleich der Pgp-Expression und Funktion in Magen- und Darmkrebs-Zelllinien. (A) Vergleichs Empfindlichkeit von Colo320HSR (Kolon, am höchsten), SNU-668 (Magen-, höchste) und SNU-C5 (Kolon, kein Ausdruck) zu Paclitaxel; (B) Wirkung von Pgp-Inhibitoren auf die Empfindlichkeit von Colo320HSR, SNU-668 und SNU-C5 zu Paclitaxel (IC10-Konzentration; 50 &mgr; M, 0,3 nM und 0,5 nM, respectively). Die Empfindlichkeit gegenüber Paclitaxel wurde mit MTT-Test in Gegenwart oder Abwesenheit der Pgp-Inhibitoren (Cyclosporin A, Verapamil und PSC833 von 0,8 &mgr; M jedes) bestimmt. * P <. 0,05 gegenüber der Kontrolle
Vergleich der Methylierungsstatus von MDR1 in wurde Magen-und Darmkrebs-Zellen
Die Methylierungsstatus durch Quantifizierung PCR-basierte Methylierungsanalyse für eine CpG-reiche Domäne bestimmt werden etwa 1 enthält Kb Exon 1 und Intron 1 unter den Promotor
MDR1. Um den Grad der Methylierung des Gens Promotorregion, zwei Primern (MS1 und MS2) enthält, die Msp
I /Hpa II-Stellen

MDR1 bestimmen, von Exon 1 und Intron 1 sind entworfen wurden. Das Primerpaar MC als eine positive Kontrolle verwendet wurde, die Qualität der Quelle der genomischen DNA zu bestimmen. Im Gegensatz dazu, dass der MN die I /Hpa
II-Stelle an der Triosephosphat-Isomerase-Gen Promotorregion
Msp kreuzt und nie wurde als negative Kontrolle verwendet methyliert. 5B zeigt typische Quantifizierung PCR-basierte Methylierungsanalyse Bilder des SNU-5 (Magen) und HT-29 (Kolon) Zellen. Die Quantifizierung PCR-basierte Methylierungsanalyse ergab, dass alle PCR-Produkte für die MS1 und MS2 wurden nicht von Pst hergestellt
1-verdauter genomischer DNA mit Msp behandelt
I (Methylierungsunempfindlichen Enzym). Auf der anderen Seite, PCR-Produkte für beide MS1 und MS2 in den SNU-5-Zellen als ein PCR-Produkt für die MS1 allein in den HT-29-Zellen wurden nach Hpa II
(methylierungssensitive enzyme) Behandlung erhalten, was darauf hinweist Methylierungs von CpG an den MS1 ​​und MS2 Stellen in den SNU-5-Zellen und nur am MS2 Ort in den HT-29-Zellen. Wie in Tabelle 1 zusammengefaßt, wurde Methylierung an die MS1 und MS2 Seiten der 9 Magenkrebszelllinien mit Ausnahme von SNU-484, aber 2 (SNU-C5 und HCT-116) der 9 Kolonkrebs-Zelllinien nachgewiesen. Auf der anderen Seite wurden die HT-29-Zellen nur auf der Seite MS2 methyliert. Die SNU-C5, HT-29 (Kolon) und SNU-16 (Magen-Zellen) MDR1
mRNA nicht zum Ausdruck brachten methyliert. Die Bisulfit-DNA-Sequenzierung Analyse wurde durchgeführt, die Methylierung zu bestätigen. Als zeigen in Tabelle 1 Methylierungsgrad (%) von 10 CpG-Stellen auf der MS1 aufgewandt Website vollständig mit den Ergebnissen durch Quantifizierung PCR-basierte Methylierung analysis.Table 1 Methylierungsstatus und die Auswirkungen von 5AC und /oder TSA auf MDR1 erhalten abgestimmt ist
mRNA-Expression und in verschiedenen Magen-und Darmkrebs-Zelllinien




DNA-Methylierungs-Assay




Tissue Bei
Zelllinie
5AC
Restriction Enzyme
Natriumbisulfit
TSA

5AC + TSA


Falten
Effekt
Website
Grad
(%)1

Fold

Effect

Fold

Effect

Gastric
SNU-1
32.6
O
MS1
MS2
100
20.7
O
+23.6
D
SNU-5
5.8
O
MS1
MS2
100
1,03
X
6.8
A
SNU-16
nd
X
MS1
MS2
60
8.4
O
28,9
S
SNU-216
-1,0
X
MS1
MS2
50
8.4
O
8.2
N
SNU-484
-1,3
X
- -
0
-5,1
X
-0,17
- SNU-601
3.2
O
MS1
MS2
100
3.3
O
13,7
S
SNU-620
67,6
O
MS1
MS2
100
*
X
*
*
SNU-638
68,9
O
MS1
MS2
100
5.7
O
72,9
A
SNU- 668
-1,0
X
MS1
MS2
80
1.8
O
4.4
S
SNU-719
5.8
O
MS1
MS2
100
4.2
O
12.4
S
Colon
SNU-C1
-1.96
X
n.d.
n.d.
0
1.7
O
+1.0
D
SNU-C4
1.0
X
ND | ND | 0
-1
X
-1,6
N
SNU-C5
ND | X
MS1
MS2
100
ND | X
8 S
Colo320HSR
1.4
X
nd
ND | 0
1.6
O
+1,3
D
LoVo
-1,9
X
ND | ND | 0
1.1
X
-2
N
DLD-1 | 1.1
X
ND | ND | 0
3.5
O
+1,1
D
HT-29
*
X
ND | MS2
0
∞
O
*
*
HCT-8
1.0
X
ND | ND | 0
1.0
X
1.1
N
HCT-116
1.7
O
MS1
MS2
100
1.6
O
1.6
N
1Sequence analysiert wurde unter Verwendung von PCR-Produkten die erweiterte MS1-Website enthalten, wurde eine wichtige Rolle in MDR1
mRNA-Expression gezeigt spielen. n.d., nicht erfasst wird; *, Hochcytotoxisch; ∞, was einer Steigerung im Vergleich mit keine MDR1 mRNA
Ausdruck; D, verringert; A, Zusatzstoff; S, synergistische; N, nicht
Abbildung 5 Die Quantifizierung PCR-basierte Methylierungsanalyse von Magen- und Darmkrebs-Zelllinien verändert. (A) CpG-Stellen und HpaII
/Msp I
Websites in den menschlichen MDR1
Promotorregion. Oben: Die CpG-Stellen werden durch die kurzen vertikalen Balken dargestellt. Die Positionen der Exons 1 und 2 sind als geschlossene Kästen angegeben. Die Position dieser Fragmente entsprechen, sind angegeben. Mitte: HpaII
/Msp I
Erkennungsstellen durch kurze vertikale Balken dargestellt werden. Unten, PCR-Primer in der Methylierungsanalyse eingesetzt. (B) Repräsentative Methylierungsstatus der Promotorregion durch Quantifizierung der PCR-basierten Methylierungsanalyse in SNU-5 (Magen) und HT-29 (Kolon)
MDR1. 1: MN, Nie-methylierten HpaII
/Msp I
-Stelle an der Triosephosphatisomerase-Gen-Promotorregion (Negativkontrolle) (240 bp); 2: MC, die positive Kontrollprimerpaar (240 bp); 3: MS1, HpaII
/Msp I
Seite 1 (121 bp); 4: MS2, HpaII
/Msp I
Seite 2 (206 bp)
Auswirkungen von 5-Aza-2'-deoxcytidine (5AC) und /oder Trichostatin A (TSA) auf die Expression. MDR1 mRNA in Magen- und Darmkrebs-Zelllinien
der Inhibitor 5AC DNA-Methyltransferase und die Histon-Deacetylase (HDAC) Inhibitor TSA wurden gut bekannt epigenetischen Gen Repression [22] zu entlasten. Diese Studie untersuchte die Wirkung von 5AC und /oder TSA auf MDR1
mRNA-Expression in den Magen- und Darmkrebs Linien. In 10 Magen- und 9 Kolonkarzinomzellen wurde MDR1
mRNA-Expression durch RT-PCR bestimmt, nachdem sie mit 2,5 uM 5AC für 96 h und /oder 100 ng /ml TSA für 48 Stunden behandelt wird. Eine Zunahme wurde in definierten Fällen mehr als eine 1,5-fache Steigerung zeigt. Wie in Tabelle 1 gezeigt, erhöhte sich die 5AC Behandlung der mRNA-Spiegel
MDR1 in den SNU-1, -5, -601, -620, -638 und -719 Magenkrebszelllinien, und dass in dem HCT-116-Dickdarm Krebszelllinie (6 und 7). Allerdings hat 5AC nicht MDR1
mRNA-Expression auch in der SNU-16 und SNU-C5 und HT-29-Zellen, deren MDR1
Gen methyliert wurde induzieren. Die TSA-Behandlung erhöht die MDR1
mRNA-Spiegel in der SNU-1, -16, -216, -601, -638, -668 und -719 Magenkrebszelllinien und der SNU-C1, Colo320HSR, DLD-1, H29 und HCT-116-Dickdarmkrebszelllinien (6 und 7). 5AC zeigten hohe Zytotoxizität allein oder in Kombination mit TSA, insbesondere in den HT-29-Zellen. Auch zeigte TSA stark cytotoxische Aktivität allein oder in Kombination mit 5AC, insbesondere in den SNU-620-Zellen. Diese Studie untersuchte auch die Wirkung der kombinierten Behandlung von 5AC mit TSA, der die MDR1
mRNA Niveaus additiv in den SNU-5 und -638-Zellen erhöht, aber synergistisch im SNU-16, -601, -668, -719 und SNU-C5-Zellen (Tabelle 1). Abbildung 6 Aktivierung von MDR1 mRNA-Expression durch 5AC und /oder TSA in Magenkrebszellen. Der Expressionsgrad ist als das Verhältnis von MDR1
/β-Actin berichtet. Die Gesamt-RNA wurde 96 h mit 2,5 &mgr; M 5AC nach der Behandlung isoliert und /oder 100 ng /ml TSA für 48 Stunden. RT-PCR wurde unter Verwendung der gleichen Methodik in Abbildung 1. Abbildung 7
Aktivierung der MDR1-mRNA berichtet durchgeführt Expression durch 5AC und /oder TSA in verschiedenen Kolon-Krebszelllinien. RT-PCR-Assay nach der Zellen mit 5AC Behandlung und /oder TSA-Verfahren in der gleichen Figur beschrieben unter Verwendung 6. Die MDR1 /β-Actin
Verhältnis erhalten durch 35-Zyklus-PCR nach TSA in Kombination mit 5AC und allein in SNU -C5 und HT-29 Nr MDR1
mRNA exprimierende bzw. wurde in dem Histogramm weggelassen.
Diese Ergebnisse legen nahe, dass MDR1
mRNA-Expression in Magen und Dickdarmkrebszellen in Bezug auf die Stumm differentiell reguliert von MDR1
Ausdruck durch epigenetische Mechanismen wie DNA-Methylierung und /oder Histondeacetylierung.
Diskussion
in dieser Studie haben wir festgestellt, dass die MDR1
mRNA-Spiegel in den Magenkrebszelllinien als die deutlich niedriger waren in den Zelllinien Kolonkrebs, obwohl es einige Unterschiede. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit dem Bericht hervorgeht, dass Pgp stark auf dem Ileum und Colon ausgedrückt wird, auf einem Niveau, das nach und nach proximal in das Jejunum abnimmt, Duodenum und Magen [8]. Da der Magen und Dickdarm wichtige Rollen bei der Verdauung und Absorption spielen bzw. ist es nicht verwunderlich, dass die Transport wie Pgp unterschiedlich in den beiden normalen Geweben exprimiert wurden. Unsere Erkenntnis, dass die differentielle Expression von MDR1
mRNA in Krebszelllinien aus dem Magen und Dickdarm mit veröffentlichten Berichten auch konsistent ist [23-26]. Immunopathologischen Studien zeigten, dass Pgp-Expression auf humanen Tumoren wurde am häufigsten in Darm-, Nieren- erkannt und Neben Karzinomen, aber selten in der Lunge und Magenkarzinome und bestimmte Keimzelltumoren [27].
Die Drei-Wege-Verbindung zwischen DNA-Methylierung, Chromatin Struktur und Genexpression wurde vor kurzem überprüft [28-30]. Eine wichtige Konsequenz des CpG Methylierungs ist die lokale Silencing der Genexpression, die durch die direkte Einmischung von Methylierung mit der Bindung von verschiedenen Transkriptionsfaktoren vermittelt werden kann. Die Hauptkomponente der Genexpression von Silencing scheint die Bindung von Methyl-CpG-bindendes Protein 2 (MeCP2), die für Methyl-CpG [31, 32] eine Affinität zu werden. DNA-Demethylierung von 5AC verursacht die Freisetzung des MECP2 aus dem Promotor, der die Expression Transkriptions-Gen aktiviert [10]. Es ist bekannt, dass MeCP2 auch auf den Promotor
MDR1 angereichert ist und an seinem silencing Zusammenhang [33]. 5AC ändert das Methylierungsmuster des MDR
1-Promotor in Pgp-negativen Zellen, die von P-gp-positiven Zellen zu ähneln und aktiviert den Promotor, dass MDR1
mRNA nachweisbar [34] ist.
In dieser Studie, der Methylierungsstatus wurde ebenfalls analysiert, um, wenn das Silencing zu hypermethylation der Promotorregion durch
MDR1 zu bestimmen ist.

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