Epigenetické mechanizmy zapojené do diferenciálnej expresie medzi MDR1mRNA karcinóm, karcinóm hrubého čreva bunkových línií a zdôvodnenie pre klinické chemoterapie

Epigenetické mechanizmy podieľajúce sa na diferenciálnym MDR1
expresie mRNA medzi žalúdočné a rakovinou hrubého čreva bunkových línií a zdôvodnenie pre klinickú chemoterapie
abstraktné
pozadia
membránových transportérov, ako je P-glykoproteín (Pgp) je MDR1
génového produktu, sú jednou z príčin zlyhania liečby u pacientov s nádorovým ochorením. V tejto štúdii sú epigenetické mechanizmy zapojené do diferenciálnych MDR1
expresie mRNA boli porovnané medzi 10 žalúdočných a 9 bunkových línií karcinómu hrubého čreva.
Metódy
Hladiny mRNA MDR1
boli stanovené s použitím PCR v reálnom čase PCR po reverznej transkripcii. Cytotoxicita bola vykonaná za použitia testu MTT. Stav metylácie bola preskúmaná kvantifikácie PCR na báze metylácie a hydrogensiričitanom DNA sekvenčné analýzy. Výsledky

MDR1
hladín mRNA získané 35 cyklov RT-PCR vo buniek karcinómu žalúdka boli len porovnateľné s výsledkami získanými 22 cykly RT-PCR v rakovinových buniek hrubého čreva. Real-time RT-PCR analýza ukázala, že MDR1
mRNA nebola v 10 žalúdočných nádorových bunkových línií, ale premenlivý MDR1
hladín mRNA v 7 z bunkových línií karcinómu hrubého čreva 9 s výnimkou SNU-C5 a HT-29 bunky detekované , MTT test ukázal, že inhibítory P-gp ako je cyklosporín A, verapamil a PSC833 citlivé Colo320HSR (karcinóm hrubého čreva, najvyššie MDR1
výrazu), ale nie SNU-668 (žalúdka, najvyšší) a SNU-C5 (žalúdka, žiadny výraz) s paklitaxelom. Kvantifikácia na báze PCR analýza metylácie ukázala, že 90% z buniek karcinómu žalúdka, a 33% nádorových buniek hrubého čreva boli methylata, ktoré boli úplne uzavreté s výsledkami získanými hydrogensiričitanom sekvenačnej analýzou DNA. 5-aza-2'-deoxcytidine (5AC, inhibítor DNA metyltransferázy) zvýšil na MDR1
hladiny mRNA v 60% žalúdočných buniek, a v 11% nádorových buniek hrubého čreva. Trichostatin A (TSA, inhibítor histondeacetylázy) sa zvýšila na MDR1
hladiny mRNA v 70% buniek karcinómu žalúdka a 55% nádorových buniek hrubého čreva. Kombinovaná liečba 5AC TSA zvýšená na MDR1
hladiny mRNA aditívne v 20% buniek karcinómu žalúdka, ale synergicky v 40% žalúdočné a 11% nádorových buniek hrubého čreva.
Záver
Tieto výsledky ukazujú, že v MDR1
hladiny mRNA buniek karcinómu žalúdka sú podstatne nižšie ako tie, ktoré v rakovinových bunkách hrubého čreva, ktorá je aspoň čiastočne v dôsledku rozdielnych epigenetických predpisov, ako je metylácie DNA a /alebo deacetyláciou histónov. Tieto výsledky môžu poskytnúť lepšie porozumenie účinnosti kombinovanej chemoterapie rovnako ako ich orálny biologickú dostupnosť.
Pozadie
žalúdka a kolorektálnych sú príčinou chorobnosti a úmrtnosti v dnešnom svete. V prípade, že liečebná chirurgická resekcia je nemožné, tieto nádory reagujú veľmi zle na chemoterapiu a čo má za následok zlou prognózou. U pacientov s rakovinou žalúdka, 5-fluorouracil (5-FU), založené na kombinácii chemoterapie neboli vykonané s cieľom zlepšiť výsledok liečby [1]. S kolorektálnym karcinómom, 5-FU je najpoužívanejším liek pre viac ako 40 rokov. Avšak, iné prostriedky, ako je irinotekan, alebo oxaliplatinu boli použité pre zlepšenie protinádorovú účinnosť v kombinácii s 5-FU [2]. 5-FU bráni tvorbe DNA tým, že blokuje tvorbu pyrimidín nukleotidové dTMP z dUMP počas novo syntézy de
DNA inhibíciou thymidylátsyntázu, ako aj prostredníctvom začlenenia fluórovaných nukleotidov do DNA a RNA [3].
P-glykoproteín (Pgp), kódovaný 1 (MDR1)
génu mnohopočetné liekovej rezistencie je reprezentatívna membrána efluxnej pumpy of ATP-viažuci kazeta (ABC) transportérov [4-6]. PGP funguje ako energeticky závislú efluxnej pumpa z rôznych štrukturálne rôznych chemoterapeutických činidiel, ako je napríklad doxorubicín, vinkristín, vinblastín, paklitaxel, colhicine, aktinomycín D a mitomycín C [7], ktoré môže znížiť intracelulárnu hladinu akumulácie liečiva. Výsledkom je, že nadmerná expresia týchto proteínov MDR udeľuje do nádorových buniek tým, vyhnúť sa cytotoxické účinky liekov. V ľudskom čreve, Pgp je silne exprimovaný na apikálnej povrch povrchových stĺpcovité epiteliálne bunky z ilea a hrubého čreva, a jeho úroveň expresie sa postupne znižuje proximálne do jejuna, dvanástnika a žalúdka [8]. Regulácia transkripčné aktivitu MDR1
génu je závislá na niekoľkých trans-pôsobiace proteíny, ktoré sa viažu konsenzom cis-elementy [9]. Prístupnosť promotorových elementov na ich väzobných faktorov je regulovaná na úrovni chromatínu zostavy. Hladiny ako metyláciou DNA a histónov deacetyláciou regulovať MDR1
génovú expresiu [10-12]. Zatiaľ sa regulácia transkripcie z MDR1
génovej expresie pomocou epigenetických mechanizmov bola hlásená vo výraze v rakovinových buniek hrubého čreva [13-16], ale nikto v karcinómov žalúdka bunkách. Okrem toho, neboli v porovnaní vzťahy medzi transkripčný expresie MDR1
génovej expresie a epigenetických mechanizmov žalúdočných a črevných nádorových buniek. Preto je jasné, prečo režimy chemoterapie boli inak, používa sa na liečbu žalúdka a hrubého čreva a konečníka a preto MDR1
mRNA je exprimovaný diferencovane v žalúdku a kolorektálneho rakovinových buniek. Preto sa táto štúdia skúmala, či je stupeň metylácie v promotorové mieste MDR1
génu je úzko spojená s MDR1
génovej expresie u oboch nádorových buniek.
Metódy Bunková kultúra
10 rakovina žalúdka u ľudí bunkové línie (SNU-1, -5, -16, -216, -484, -601, -620, -638, -668 a -719) a 9 hrubého čreva bunkové línie (SNU-C1, C4, C5, Colo320HSR, lovo, DLD-1, HT-29, HCT-8 a HCT-116) boli získané z Cancer Research Center na Národnej univerzite v Soule (Južná Kórea). Všetky bunky boli pestované pri teplote 37 ° C v 5% CO a 2 atmosfére za použitia RPMI 1640 (GibcoBRL, prostata Island, NY, USA) s 10% tepelne inaktivovaného fetálneho hovädzieho séra (Sigma, St. Louis, MO, USA). Bunky boli udržiavané buď ako suspenzie alebo jednovrstvovej kultúre a subkultivujú, až sa dosiahne zhlukovania.
Reverzný transkripcie-polymerázovej reťazovej reakcie (RT-PCR) Obsah
Celková RNA bola extrahovaná za použitia MagExtractor ® pre MFX-2100 (Toyobo, Osaka, Japan) auto-nukleová kyselina čistenie systém, podľa pokynov výrobcu. MDR1 stroje a p-aktínu
mRNA transkripty boli detekované použitím testu RT-PCR. MDR1
expresia bola detekovaná s 5 'a 3' priméry, zodpovedajúce nukleotidům 907 až 930 (5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 ') a 1179 až 1201 (5'-TGCCAAG-ACCTCTTCAGCTACTG-3'), v danom poradí, z publikované cDNA sekvencie [17], čím sa získa 296 bp PCR produktu. β-aktínu expresie
mRNA bol použitý ako kontrola pre množstvo RNA, a bol detekovaný s 5 'a 3' priméry zodpovedajúce nukleotidům 1912-1932 (5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 ') a 2392-2412 ( 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3 '), v danom poradí, z publikovanej cDNA sekvencie [18], čím sa získa 501 bp PCR produktu. RNA z každej vzorky bola reverzne transkribovaných s použitím 200 jednotiek Moloneyho vírusu myší leukémie reverznej transkriptázy (Gibco-Bethesta Research Laboratory, Grand Island, NY, USA) a 0,18 ug /ml oligo (dT 20) primeru po dobu 1 hodiny pri teplote 37 ° C. Výsledná cDNA z buniek karcinómu žalúdka (2-násobne zriedeného cDNA v rakovinových buniek hrubého čreva) boli amplifikovanej s 1,25 jednotiek Taq polymerázy (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 1 mM MgCl 2 a 10 pmol každého primeru v termocykléra (GeneAmp 2400, PE Applied Biosystems, Boston, MA, USA) po dobu 22 cyklov s rakovinových buniek hrubého čreva, ale 35 cyklov s žalúdočnými nádorových buniek pre MDR1 stroje a 17 cyklov pre beta-aktínu
sekvenčného denaturácia (94 ° C počas 30 s), teplotná hybridizácia (65 ° C pre MDR1
, 53 ° C pre beta-aktínu
) a predĺženie (72 ° C počas 30 s). Po poslednom cykle, všetky PCR produkty boli podrobené konečné predĺženie 5 minút pri 72 ° C. Pre kvantifikáciu, 3 UCI [α- 32P] dCTP bolo pridané do každej reakčnej zmesi. Po PCR, PCR produkty boli spojené a potom podrobia elektroforéze na 7,5% nondenaturing polyakrylamidovom gélu. Pásy boli skenované s denzitometrom (PDI, Huntington Station, NY, USA). Množstvo každého transkriptov mRNA sa normalizuje sa, že každé
mRNA beta-aktínu.
Extrakcia bielkovín a analýza Western blot
Celkom fragmenty buniek boli pripravené lýzou buniek zberu v extrakčnom pufri (1% NP-40 , 0,5% deoxycholát sodný, 0,1% SDS vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku) s prídavkom 2 mM fenylmetylsulfonyl fluorid (Sigma) a 10 ug /ml leupeptinu (Sigma). DNA sa prerezáva ultrazvuku a Western blot analýza bola vykonaná za použitia miernej modifikácie spôsobu prvýkrát popísaným Towbin et al. [19]. Proteíny boli prenesené na nitrocelulózové membránu elektropřenosového pomocou prúdu 60 V cez noc. Bola membrána inkubovaná v blokovacom roztoku (5% odtučnené mlieko) po dobu 1 hodiny pri izbovej teplote, premyté a potom inkubované s primárnou kozie polyklonálnou protilátkou (1: 1000, Santa Cruz, Biotechnology, CA, USA) za Pgp. Membrána bola premytá a inkubovaná s chrenovou peroxidázou konjugovanou sekundárnou protilátkou (zriedenej 1: 1000), alebo proti každému IgG pre hostiteľov primárnymi protilátkami po dobu 1 hodiny. Membrána bola potom zafarbené za použitia detekčného činidla na detekčné súpravy ECL (Amersham, Piscataway, NJ, USA).
PCR v reálnom čase
Extrakcia mRNA bola vykonaná v súlade s RNeasy proctocol (Qiagen, Hilden, Nemecko ). Jeden mikrogram celkovej RNA bol reverzne transkribovaných do cDNA v objeme 20 ul sa 200 jednotkami Moloneyho vírusu myší leukémie reverznej transkriptázy (Gibco-Bethesta Research Laboratory, Grand Island, NY, USA) a 0,18 ug /ml oligo (dT 20) primery (Promega, Madison, USA) podľa výrobe príručke. Real-time PCR bola vykonaná s Light Cycler 2.0 Instrument (Roche, Mannheim, Nemecko) pomocou rýchleho spustenia DNA majstra SYBR Green I Kit (Roche). Pre overenie správneho produktu amplifikácie, PCR boli analyzované na 2% agarózovom géli farbeného Ethidium bromidom. Sekvencie primérov sú nasledovné: pre p-aktínu
, 5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 'a 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3'; pre MDR1
, 5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 'a 5'-TGCCAAGACCTCTTCAGCTACTG-3'. Každá reakcia (20 ul) obsahovala 4 ul cDNA (10-násobné riedenie), 4 mM MgCI 2, 10 pmol každého primeru a 2 ul Fast štart DNA hlavného Sygrou Green Aj zmesi obsahujúce pufor, dNTPs, SYBR Green farbivo a Tag polymerázy. Amplifikačnej postup cieľových génov bola nasledujúca: pre-denaturácia pri 95 ° C počas 10 minút, 40 cyklov denaturácie pri 95 ° C počas 15 sekúnd, žíhanie na MDR1
pri 67 ° C (p-aktínu
pri 55 ° C) po dobu 5 sekúnd a predĺženie pri 72 ° C počas 7 sekúnd (β-aktínu
počas 21 sek). Teplota topenia: analýza krivky bola vykonaná za účelom potvrdenia výrobu jediného produktu. Negatívne kontroly bez šablóny boli vytvorené pre každého behu. Génovej expresie hodnoty (relatívna hladiny mRNA) sú vyjadrené ako pomery (rozdiel medzi hodnotami Ct = Bod na krivke, v ktorom je množstvo fluorescencie sa začína rýchlo zvyšovať, zvyčajne niekoľko smerodajné odchýlky nad základnej čiary, sa nazýva prah cyklu ( ct hodnota).) medzi génu MDR1 (
mRNA) a vnútorné referenčné gén (β-aktínu
mRNA), ktoré poskytujú normalizačný faktor pre množstvo RNA, odvodenej zo vzorky. Analýza dát bola vykonaná s použitím Light Cycler softvér verzie 4.0 (Roche).
Test cytotoxicity s použitím MTT testu
in vitro cytotoxicity
z liekov bola meraná s použitím testu MTT, ako je popísané na inom mieste [20]. Bunky boli schovať v 2 x 10 4cells /ml a inkubované cez noc, aby na upevnenie a stabilizáciu. Bunky boli inkubované pri 37 ° C po dobu 3 dní, a MTT [3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl tetrazolium bromid, Sigma] Roztok potom bol pridaný do každej jamky obsahujúcej bunky. Po trepanie po dobu 1 min, doštička bola inkubovaná po dobu 5 hodín. Formazanové kryštály suspenzné kultúry boli rozpustené v 150 ul dimetylsulfoxidu (DMSO) po odstránení supernatantu. Optická hustota jamiek bola meraná čítačkou mikrodoštičiek (μQuant, Bio-tek Instruments Inc., Winooski, VT, USA) pri 540 nm.
Metylačnej analýzu kvantifikáciu PCR na báze
Päť mikrogramov genómovej DNA bol štiepený s 50 u všetkých Msp
I alebo Hpa
II (Fermentas MBI, Vilnius, Litva), pri teplote 37 ° C počas 16 hodín, pridá do 1/15 objemu 0,6 M Tris (pH 7,5) a 1,5 M NaCl, a digeruje s 50 u PST
aj (New England Biolabs, MA, USA) pri teplote 37 ° C počas 8 hodín. Stav metylácie MDR1
promotorové oblasti 5'CpG bola skúmaná analýzou 100 ng restrikčné štiepená DNA pomocou PCR v 25 ul reakcii obsahujúcej 1,25 jednotiek Taq DNA polymerázy a 10 pmol každého primeru. Analýza metylácie kvantifikácie na báze PCR bola vykonaná podľa metódy bola popísaná skôr [11]. PCR priméry boli použité 5'-TCTAGAGAGGTGCAACGGAAG-3 'a 5'-TCAGCCTCACCACAGATGAC-3' pre MS1 metylačnej citlivých priméry (121 bp), 5'-TGAAGTCCTCTGGCAAGTCC-3 'a 5'-ATTCTCCCTCCCGGTTCC-3' pre MS2 metylácie citlivé priméry (206 bp), 5-ATTTCACGTCTTGGTGGCC-3 'a 5'-TCCAGTGCCACTACGGTTT-G-3'for pozitívny kontrolnými primermi MC (240 bp) a 5'-GGCGAAGGAGGT-TGTCTATTC-3' a 5 ' -AACGTTCTAGGAGAGTCGGG-3 'pre MN negatívne kontrolné priméry (240 bp), ktorý pochádza z triosefosfát izomerázou génu promótorom. Amplifikácia bola vykonávaná v termocykléri DNA pre 35 cyklov za priméry MN, MC, MS1 a MS2 zahŕňajúcich v sekvenčnom denaturácia (95 Cislo C počas 30 s), žíhanie (60 ° C po dobu 30 sekúnd) a predĺženie (72 ° C po dobu 30 s). Po poslednom cykle, všetky PCR produkty boli podrobené konečné predĺženie po dobu 5 min pri 72 ° C. PCR produkty boli oddelené elektroforézou na 7% PAGE géloch. Gély sa farbia etidiumbromidom a vyfotografovaná s použitím Kodak Image Station 4000 MM (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA).
HYDROGENSIRIČITANOV analýzu DNA sekvencií
Jedna ug genómovej DNA bol chemicky modifikovaný sodíka bisulfitového použitím súpravy EZ metylácie DNA (Zymo Research, pomaranč, CA, USA) previesť nemethylované cytozín na uracil pri odchode denaturovaný cytozín nezmenený. Bisulfitová modifikovaná DNA bola použitá pre PCR amplifikáciu. Rozšírená MS1 primer obsahuje 10 CPG miest a 2 SP-1 stránok, ktoré sú záväzné pre funkčné MDR1
promótor, ktorý bude aktivovaný [21]. Tieto sekvencie primérov pre amplifikáciu bisulfitových ošetrených vlákien (223 bp) boli nasledovné: S: 5'-GGAAGTTAGAATATTTTTTTTGGAAAT-3 '; AS: 5'-ACCTCTACTTCTTTAAACTTAAAAAAACC-3 '. Amplifikácia bola vykonaná za rovnakých podmienok, s výnimkou PCR 48 ° C Teplota žíhania a 45 cyklov PCR. Po poslednom cykle, všetky PCR produkty boli podrobené konečné predĺženie pri 72 ° C po dobu 5 minút. Sekvencie PCR produktov bola analyzovaná pomocou automatizovaného sekvenátoru (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
Štatistická analýza
Výsledky sú uvedené ako priemer ± SE a dáta boli analyzované pomocou Studentovho t-testu
. P hodnoty < 0,05 boli považované za významné.
Výsledky
Porovnanie profilov expresie MDR1 mRNA v žalúdku a karcinómu hrubého čreva
MDR1
mRNA expresia bola analyzovaná pomocou testu RT-PCR s úrovňou expresie bola normalizovaná s beta-aktínu
mRNA získanej po 17 cykloch PCR. V MDR1
mRNA bola po 22 cykloch PCR nebola detekovaná v 10 žalúdočných nádorových bunkových línií, ale môže byť detekovaný na rôznych úrovniach po 35 cykloch PCR s výnimkou SNU-16, čo naznačuje výrazne nízku úroveň MDR1
mRNA expresie v žalúdočných rakovinových bunkách testovaných (obrázok 1). Ako je znázornené na obrázku 1, poradí uvedenom v závislosti na MDR1-p-aktínu pomere
v bunkových línií karcinómu žalúdka je nasledujúci: SNU-668 (1,51) > SNU-484 (1,37) > SNU-5 (0,63) > SNU-601 (0,33) > SNU-719 (0,32) > SNU-216 (0,29) > SNU-638 (0,07) > SNU-1 (0,04) > SNU-16 (0). Z bunkových línií karcinómu hrubého čreva 9, variabilný MDR1
mRNA by mohli byť detekované v bunkových línií karcinómu hrubého čreva 7 po 22 cykloch PCR, ale nie v SNU-C5 a HT-29 bunky. V MDR1
mRNA týchto dvoch posledne menovaných buniek nemohlo byť detekované ani po 35 cyklov PCR. Tieto výsledky naznačujú, relatívne vysoká úroveň MDR1
expresie mRNA aj cez niektoré výnimky v rakovinových buniek hrubého čreva. Ako je znázornené na obrázku 2, poradí uvedenom v závislosti na MDR1
/beta-aktínu pomere
v bunkových línií karcinómu hrubého čreva je nasledujúci: Colo320HSR (0,90) > SNU-C4 (0,45) > HCT-8 (0,26) > SNU-C1 (0,12) > HCT-116 (0,11) > Lovo (0,10) > DLD-1 (0,07) > SNU-C5 (0) = HT-29 (0). Obrázok 1 MDR1 mRNA expresiu v žalúdočných nádorových bunkových línií. Hladina MDR1
mRNA expresia bola určená pomocou RT-PCR, a normalizovala sa tým, že mRNA beta-aktínu
, ktorý bol použitý ako kontrola pre RNA. CDNA reverznej transkripcii z mRNA bola amplifikovaná oddelene pri každom páre primérov pre MDR1 stroje a beta-aktínu
génov. Alikvótne každej PCR reakčnej zmesi boli oddelené na 7% polyakrylamidovom gélu. Gél sa vysuší a vystavené na röntgenovom filme cez noc.
Obrázok 2 MDR1 mRNA expresie v bunkových líniách rakoviny hrubého čreva. bola použitá rovnaká metodika uvedené v obr. 1.
Vykonali sme opäť v reálnom čase RT-PCR test pre kvantitatívnu validáciu MDR1
hladín mRNA získané z RT-PCR testu. V MDR1
mRNA nebola detekovaná v 10 žalúdočných nádorových bunkových línií. Avšak, z bunkových línií karcinómu hrubého čreva 9, variabilný MDR1
mRNA by mohla byť detekovaná v 7 hrubého čreva bunkových línií karcinómu s výnimkou SNU-C5 a HT-29 buniek, ako sú údaje o RT-PCR (obrázok 3). Obrázok 3 MDR1 mRNA expresie v žalúdku a karcinómu hrubého čreva bunkových línií. Hladina MDR1
expresie mRNA bola stanovená pomocou real-time RT-PCR, a normalizovala sa tým, že mRNA beta-aktínu
, ktorý bol použitý ako kontrola pre RNA. CDNA reverznej transkripcii z mRNA bol zosilnený zvlášť s každým pár priméru pre MDR1 stroje a beta-aktínu
génov.
Celkovo vzaté, MDR1
hladiny mRNA v rakovinových bunkových líniách žalúdočných boli významne nižšie ako tie, ktoré v rakovina hrubého čreva bunkových línií.
Chemosensitizing účinky inhibítorov PgP vo žalúdočných a črevných nádorových buniek
Hoci hladiny proteínu neboli skúmané v tejto štúdii, funkčné štúdie boli vykonávané s použitím inhibítorov PGP v žalúdočnej a rakovina hrubého čreva bunkové línie exprimujúce najvyššiu úroveň MDR1
mRNA expresie. Ako je znázornené na obrázku 4A, sa Colo320HSR buniek (karcinóm hrubého čreva, mutant p53, najvyššia expresia MDR1
mRNA) boli 14-krát a > 200 krát rezistentné k paklitaxelu ako SNU-C5 a SNU-668 buniek (žalúdka, mutant p53, najvyššia expresia MDR1
mRNA), v porovnaní na základe IC 50 hodnoty, v tomto poradí, čo predstavuje významný rozdiel v úrovniach Pgp. Okrem toho je odolnosť Colo320HSR buniek k paklitaxelu bola obrátená inhibítory Pgp, vrátane cyklosporínu A, verapamil, a PSC833 (Obrázok 4B). Avšak, toto obrátenie nebolo pozorované v SNU-C5 (karcinóm hrubého čreva, bez MDR1
mRNA) bunky, rovnako ako SNU-668. To naznačuje, že Pgp exprimovaný v rakovinových buniek hrubého čreva, ale nie buniek karcinómu žalúdka funguje funkčne a spomaliť inhibítory Pgp. Obrázok 4 Porovnanie Pgp expresie a funkcie v žalúdku a karcinómu hrubého čreva bunkových línií. (A) Porovnávací citlivosť Colo320HSR (hrubého čreva, čo je najvyššia), SNU-668 (žalúdka, najvyšší) a SNU-C5 (hrubého čreva, žiadny výraz) na paklitaxel; (B) Vplyv inhibítorov Pgp na citlivosti Colo320HSR, SNU-668 a SNU-C5 až paklitaxelu (koncentrácia IC10 50 uM, 0,3 nM a 0,5 nM, v danom poradí). Citlivosť na paklitaxel bola stanovená za použitia MTT testu, v prítomnosti alebo neprítomnosti inhibítorov Pgp (cyklosporín A, verapamil a PSC833 0,8 uM každého). *, P <. 0,05 versus kontrolná
Porovnanie metylačného statusu MDR1 v žalúdočných a črevných nádorových buniek
stav metylácie bola stanovená kvantitatívne PCR založené na analýze metylácie CPG pre doméne bohatej na približne 1 kb obsahujúci exón 1 a intronom 1 medzi MDR1
promótor. Pre určenie stupňa metylácie MDR1
gén promotorové oblasti, dva priméry (MS1 a MS2), ktoré obsahujú MSP
I /Hpa
miesta II boli navrhnuté z exónu 1 a intronom 1, v tomto poradí. Paru primérov MC bola použitá ako pozitívna kontrola pre stanovenie kvality zdrojového genómovej DNA. Na rozdiel od toho, ktorý prechádza MN stránky MSP
I /Hpa II
na izomerázou génu promotorové oblasti triosefosfát a nikdy sa methyluje bola použitá ako negatívna kontrola. Obrázok 5B znázorňuje typický kvantifikácie PCR založené na obrázky metylačnej analýzu na SNU-5 (žalúdočné) a HT-29 (hrubého čreva) buniek. Analýza metylácie kvantifikácie na báze PCR bolo zistené, že všetky PCR produkty pre MS1 a MS2 neboli vyrobené z Pst
1 štiepená genomická DNA ošetrené Msp
I (metylácie necitlivého enzýmu). Na druhej strane, PCR produkty pre oba MS1 a MS2 v bunkách SNU-5, ale PCR produktu pre MS1 sám v HT-29 bunky boli získané po Hpa
II (metylačnej citlivé na enzým) liečby, čo naznačuje, metylácii CPG v miestach MS1 a MS2 v bunkách SNU-5 a len v mieste MS2 v bunkách HT-29. Ako je zhrnuté v tabuľke 1, metylácie bola zistená v miestach MS1 a MS2 z 9 žalúdočných rakovinové bunkové línie, s výnimkou SNU-484, ale 2 (SNU-C5 a HCT-116) bunkových línií karcinómu hrubého čreva 9. Na druhej strane, bunky HT-29 boli methylata iba na mieste MS2. SNU-C5, HT-29 (karcinóm hrubého čreva) a SNU-16 (žalúdočné) bunky neexprimujúcich MDR1
mRNA boli methylata. Bisulfitového analýza Sekvenovanie DNA bolo vykonané pre potvrdenie metylácii. Ako ukazuje tabuľka 1, stupeň metylácie (%) 10 CPG miest na vynaloženú mieste MS1 je úplne uzavreté s výsledkami získanými pre kvantifikáciu PCR na báze metylácie analysis.Table 1 metylačného statusu a účinky 5AC a /alebo TSA MDR1
mRNA expresie a v rôznych žalúdku a hrubého čreva bunkových línií




metylácie DNA testu




Tissue
Bunková línia
5AC
pre restrikčné enzýmy
roztoku sodia
TSA

5AC + TSA


Preložte
účinok
Site
Titul (%)1

Fold

Effect

Fold

Effect

Gastric
SNU-1
32.6
O
MS1
MS2
100
20.7
O
+23.6
D
SNU-5
5,8
O
MS1
MS2
100
1,03
X
6,8
SNU-16
nd
X
MS1
MS2
60
8,4
O
28,9
S
SNU-216
-1,0
X
MS1
MS2
50
8,4
O
8,2
N
SNU-484
-1,3
X - -
0
-5,1
X
-0,17 -
SNU-601
3,2
O
MS1
MS2
100
3,3
O
13,7
S
SNU-620
67,6
O
MS1
MS2
100
*
X
*
*
SNU-638
68,9
O
MS1
MS2
100
5,7
O
72,9
SNU- 668
-1,0
X
MS1
MS2
80
1,8
O
4,4
S
SNU-719
5.8
O
MS1
MS2
100
4.2
O
12.4
S
Colon
SNU-C1
-1.96
X
n.d.
n.d.
0
1.7
O
+1.0
D
SNU-C4 1,0
X
nd nd
0
-1
X
-1,6
N
SNU-C5
nd
X
MS1
MS2
100
nd
X
8
S
Colo320HSR
1,4
X
nd
nd
0
1,6
O
1,3
D
lovo
-1,9
X
nd nd
0
1,1
X
-2
N
DLD-1
1,1
X
nd nd
0
3,5
O
1,1
D
HT-29
*
X
nd
MS2
0
∞
O
*
*
HCT-8 1,0
X
nd nd
0
1,0
X
1,1
N
HCT-116
1,7
o
MS1
MS2
100
1,6
o
1,6
N
1Sequence bola analyzovaná pomocou PCR produktov, ktoré obsahujú rozšírené MS1 stránky, ktoré bolo preukázané, že hrajú dôležitú úlohu v MDR1
mRNA expresie. n.d., nebola detekovaná; *, Vysoko cytotoxické; ∞, čo predstavuje nárast v porovnaní so žiadnym MDR1 mRNA
prejavu; D, znížil; A, prísada; S, synergické; N, nemení
Obrázok 5 kvantifikáciu PCR založené na analýze metylácie žalúdka a karcinómu hrubého čreva bunkových línií. (A) CPG miest a Hpa II
/MSP Aj
miest v ľudskom MDR1
promotorové oblasti. Vrchol: Miesta CPG sú predstavované krátkymi zvislými pruhmi. Polohy exónov 1 a 2 sú označené ako uzavreté boxy. Polohy, ktorá zodpovedá týchto fragmentov sú uvedené. Stredná: Hpa II
/MSP Aj
rozpoznávacie miesta sú predstavované krátkymi zvislými čiarami. Dno, PCR priméry použité v analýze metylácie. (B) Zástupca metylačného statusu MDR1
promotorové oblasti podľa kvantifikácie PCR založené na analýze metylácie v SNU-5 (žalúdočné) a HT-29 (hrubého čreva). 1: MN, Never-methyluje Hpa II
/MSP Aj
stránky na triosefosfát izomerázou gén promotorové oblasti (negatívna kontrola) (240 bp); 2: MC, pozitívna kontrola pár priméru (240 bp); 3: MS1, Hpa II
/MSP Aj
stránky 1 (121 bp); 4: MS2, Hpa II
/MSP Aj
miesto 2 (206 bp)
Účinky 5-aza-2'-deoxcytidine (5AC) a /alebo trichostatin A (TSA) na expresiu. MDR1 mRNA v žalúdku a karcinómu hrubého čreva bunkových línií
inhibítor 5AC DNA metyltransferázy a histondeacetylázy (HDAC) inhibítor TSA boli dobre známe, k úľave od epigenetické génovej represie [22]. Táto štúdia skúmala účinok 5AC a /alebo TSA MDR1
mRNA expresie v žalúdku a hrubého čreva linky. V 10 žalúdočných a 9 nádorových buniek hrubého čreva, MDR1
mRNA expresia bola určená pomocou RT-PCR po ich spracovaním s 2,5 uM 5AC po dobu 96 hodín a /alebo 100 ng /ml TSA počas 48 hodín. Nárast bol definovaný v prípadoch, ktoré má viac ako zvýšenie o 1,5-násobné. Ako je uvedené v tabuľke 1, spracovanie 5AC zvýšila na MDR1
mRNA v žalúdočnej nádorových bunkových línií SNU-1, -5, -601, -620, -638 a -719, a že v HCT-116 hrubého čreva bunková línia karcinómu (obrázky 6 a 7). Avšak, 5AC neindukoval MDR1
expresie mRNA i v SNU-16 a SNU-C5 a HT-29 buniek, ktorých MDR1
gén bol metylovaný. Ošetrenie TSA zvýšila na MDR1
hladiny mRNA v SNU-1, -16, -216, -601, -638, -668 a -719 žalúdočné nádorových bunkových línií a SNU-C1, Colo320HSR, DLD-1, H29 a HCT-116 rakovina hrubého čreva bunkové línie (obrázok 6 a 7). 5AC vykazoval vysokú cytotoxicitu samostatne alebo v kombinácii s TSA, najmä v bunkách HT-29. Tiež, TSA ukázal veľmi cytotoxickú aktivitu samotná alebo v kombinácii s 5AC, najmä v bunkách SNU-620. Táto štúdia tiež skúmala účinky kombinovanej liečby 5AC s TSA, čo zvýšilo MDR1
hladiny mRNA aditívne v SNU-5 a -638 buniek, ale synergicky v SNU-16, -601, -668, -719 a SNU-C5 bunky (tabuľka 1). Obrázok 6 Aktivácia expresie MDR1 mRNA 5AC a /alebo TSA do buniek karcinómu žalúdka. Hladina expresie je označená ako pomer MDR1
/beta-aktínu. Celková RNA bola izolovaná po liečbe 2,5 uM 5AC po dobu 96 hodín a /alebo 100 ng /ml TSA počas 48 hodín. RT-PCR bola vykonaná za použitia rovnakej metódy uvedenej na obrázku 1. Obrázok 7
Aktivácia MDR1 mRNA expresie 5AC a /alebo TSA v rôznych bunkových líniách rakoviny hrubého čreva. RT-PCR po ošetrení buniek s 5AC a /alebo TSA použitím rovnakej metódy opísané v obrázku 6. MDR1 /β-aktínu
pomer získanej 35 cykloch PCR za TSA v kombinácii s 5AC, a sám v SNU C5 a HT-29 exprimujúce ničím MDR1
mRNA, v danom poradí, bola vynechaná v histogramu.
Tieto výsledky naznačujú, že MDR1
mRNA expresie je regulovaná odlišne v žalúdku a karcinómu hrubého čreva vzhľadom k umlčanie MDR1
výraz cez epigenetických mechanizmov, ako je metylácie DNA a /alebo histónov deacetyláciou.
Diskusia
v tejto štúdii sme zistili, že MDR1
hladiny mRNA v rakovinových bunkových líniách žalúdočných boli podstatne nižšie ako ceny v bunkových líniách rakoviny hrubého čreva, aj keď boli určité rozdiely. Tieto výsledky sú v súlade so správou preukazuje, že Pgp je silne exprimovaný v ileu a hrubom čreve, na úrovni, ktorá sa postupne znižuje proximálne do jejuna, dvanástnika a žalúdka [8]. Vzhľadom k tomu, žalúdka a hrubého čreva hrajú hlavnú úlohu pri trávení a vstrebávaní, v tomto poradí, nie je prekvapujúce, že prepravcovi, ako Pgp boli odlišne exprimované v dvoch normálnych tkanivách. Naše zistenia, že diferenciálnej expresie MDR1
mRNA v rakovinových bunkových líniách odvodených od žalúdka a hrubého čreva je tiež v súlade s publikovanými správami [23-26]. Imunopatologickej štúdie odhalili, že Pgp výraz v ľudských nádorov bol najčastejšie zistený u hrubého čreva, obličiek, nadobličiek a karcinómov, ale len zriedka v pľúc a žalúdka karcinómy a niektorých tumorov zo zárodočných buniek [27].
Trojcestný spojenie medzi The metylácie DNA, chromatínu štruktúra a expresia génu bol nedávno preskúmané [28 až 30]. Dôležitým dôsledkom CPG metylácie je miestny umlčanie génovej expresie, ktorá môže byť sprostredkovaná priamy zásah metylácie s väzbou rôznych transkripčných faktorov. Hlavnou zložkou umlčanie génovej expresie sa zdá byť väzby metyl-CPG-väzbového proteínu 2 (MECP2), ktorý má afinitu k metyl-CPG [31, 32]. DNA demetylácia tým 5AC spôsobí uvoľnenie MECP2 z promótorom, ktorý aktivuje transkripčný expresiu génu [10]. Je známe, že MECP2 je tiež obohatený na MDR1
promótor a súvisí s jeho umlčanie [33]. 5AC mení metylácie vzor MDR
1 promótor v PGP negatívnych buniek, ktoré sa podobajú Pgp-pozitívnych buniek a aktivuje promótor tak, že MDR1
mRNA je detekovateľná [34].
V tejto štúdii stav metylácie sa tiež analyzuje za účelom zistenia, či v MDR1
tlmenia hluku je v dôsledku hypermetylace v oblasti promotora.

• Imaging pri posudzovaní pečeňovej a peritoneálnej metastázy rakoviny žalúdka: systematický review
• Žalúdočné sonda v rámci priameho výhľadu pomocou video laryngoscope Kráľ Vision ™: randomizovanej, prospektívna, klinický trial