Epigeneettisiä mekanismeja ero MDR1mRNA ilmaisun välillä mahalaukun ja paksusuolen syövän solulinjojen ja sovitusmenetelmät kliinisen chemotherapy

epigeneettisiä mekanismeja ero MDR1
mRNA: n ilmentymisen välillä mahalaukun ja paksusuolen syövän solulinjojen ja sovitusmenetelmät kliinisen kemoterapian
Abstract
tausta
kalvo kuljettajat kuten P-glykoproteiinin (Pgp), MDR1
geenituotetta, ovat yksi syy hoidon epäonnistumisen syöpäpotilailla. Tässä tutkimuksessa, epigeneettinen mekanismeja ero MDR1
mRNA: n ilmentymisen verrattiin 10 maha- ja 9 koolonsyöpäsolulinjoissa.
Menetelmät
MDR1
mRNA-tasot määritettiin käyttäen PCR: ää ja reaaliaikaista PCR-määrityksissä, kun käänteisen transkription. Sytotoksisuus suoritettiin käyttäen MTT-määritystä. Metylaatiostatuksen selvitettiin kvantitoimalla PCR-pohjainen metylaatio ja bisulfiitti DNA sekvensointi analyysejä.
Tulokset
MDR1
mRNA-tasot saadaan 35 sykliä RT-PCR mahasyövän soluissa olivat vain verrattavissa saatu 22 sykliä RT-PCR paksusuolen syöpäsoluissa. Reaaliaikainen RT-PCR-analyysi paljasti, että MDR1
-mRNA: ta ei havaittu 10 mahasyövän solulinjoissa, mutta vaihteleva MDR1
mRNA-tasot 7 ja 9 koolonsyöpäsolulinjoissa paitsi SNU-C5 ja HT-29-solujen . MTT-analyysi osoitti, että Pgp inhibiittorit kuten syklosporiini A, verapamiili ja PSC833 herkistyneet Colo320HSR (paksusuoli, korkein MDR1
lauseke), mutta ei SNU-668 (mahalaukun, korkein) ja SNU-C5 (mahalaukun, ei ilmaus) paklitakselille. Kvantifiointi PCR-pohjainen metylaatio analyysi paljasti, että 90% mahalaukun syövän solujen, ja 33% paksusuolen syövän soluja metyloitu, joka on kokonaan sovitettu saatuja tuloksia bisulfiitti DNA-sekvenssianalyysi. 5-atsa-2'-deoxcytidine (5AC, DNA metyylitransferaasin estäjä) lisäsi MDR1
mRNA-tasoja 60% mahalaukun solujen ja 11% paksusuolen syövän soluja. Trikostatiini A (TSA, histonideasetylaasi-inhibiittori) lisäsi MDR1
mRNA-tasoja 70% mahalaukun syövän solujen ja 55% paksusuolen syövän soluja. Yhdistetyt hoito 5AC TSA lisäsi MDR1
mRNA-tasot additiivisesti 20% mahalaukun syövän soluja, mutta synergistisesti 40% maha- ja 11% paksusuolen syöpäsoluissa.
Päätelmä
Nämä tulokset osoittavat, että MDR1
mRNA mahasyövän solut ovat huomattavasti alhaisemmat kuin koolonkarsinoomasoluissa, joka on ainakin osittain erilaisten epigeneettiset asetuksia, kuten DNA: n metylaation ja /tai histoni deasetylaatiolla. Nämä tulokset voivat tarjota paremman käsityksen tehoa yhdistettynä kemoterapia sekä niiden biologinen hyötyosuus suun kautta.
Tausta
Maha- ja peräsuolen syövät ovat syynä sairastavuuden ja kuolleisuuden maailmassa. Jos parantava kirurginen resektio on mahdotonta, näiden syöpien reagoivat erittäin huonosti kemoterapiaa ja tuloksena on huono ennuste. Mahasyövän potilailla, 5-fluorourasiili (5-FU), joka yhdistelmä kemoterapiaa on yritetty parantamiseksi hoitotuloksiin [1]. Kolorektaalisyöpään, 5-FU on ollut laajimmin käytetty lääkeaine yli 40 vuotta. Kuitenkin muut aineet, kuten irinotekaani tai oksaliplatiini on käytetty parantamaan tuumorin vastaista tehokkuutta yhdistelmässä 5-FU [2]. 5-FU häiritsee DNA: n synteesiä estämällä tuotantoa pyrimidiininukleotidin dTMP päässä dUMP aikana de novo
DNA-synteesin inhibition kautta tymidylaattisyntaasin kautta sekä sisällyttämällä fluori-nukleotidien DNA: han ja RNA: n [3].
P-glykoproteiinin (Pgp) koodaa usealle vastus 1 (MDR1
) geeni on edustava kalvo effluksipumpun ATP-sitova kasetti (ABC) kuljettajat [4-6]. Pgp toimii energiariippuvainen effluksipumppujen erilaisia ​​rakenteellisesti erilaisten kemoterapeuttisten aineiden, kuten doksorubisiinin, vinkristiinin, vinblastiinin, paklitakselin, colhicine, aktinomysiini D ja mitomysiini C [7], joka voi vähentää solunsisäisen tason lääkeaineen kertymistä. Tämän seurauksena, yliekspressio näiden proteiinien antaa MDR syöpäsolujen kiertää sytotoksisten lääkkeiden vaikutuksia. Ihmisen suolistossa, Pgp ilmentyy voimakkaasti apikaalisella pinnalla pinnallinen columnar epiteelisolujen sykkyräsuolen ja paksusuolen, ja sen ekspressiotaso alenee vähitellen proksimaalisesti osaksi tyhjäsuolen pohjukaissuoli ja mahan [8]. Asetus transkriptionaalisen aktiivisuuden MDR1
geeni on riippuvainen useista trans-toimivia proteiineja, jotka sitoutuvat konsensus-cis-elementit [9]. Esteettömyys promoottorielementeistä niiden sitovien tekijöiden säännellään tasolla kromatiinin kokoonpano. Tasot Sekä DNA: n metylaation ja histonien deasetylaatiolla säädellä MDR1
geeniekspressiota [10-12]. Toistaiseksi transkription säätelyyn MDR1
geeniekspression epigeneettisellä mekanismien on raportoitu ilmentymisen koolonkarsinoomasoluissa [13-16], mutta ei yhtään mahasyövistä soluissa. Lisäksi väliset suhteet transkriptionaalisen ekspression MDR1
geenin ilmentymisen ja epigeneettisiä mekanismeja mahalaukun ja paksusuolen syövän soluja ei ole verrattu. Siksi on epäselvää, miksi kemoterapiahoitojen on eri käytetty hoitoon mahalaukun ja paksusuolen ja peräsuolen syöpiä ja miksi MDR1
mRNA ilmentyy differentiaalisesti mahalaukun ja peräsuolen syövän soluja. Näin ollen tämä tutkimus tutki tai aste metylaation promoottorin paikalla MDR1
geeni liittyy läheisesti MDR1
geeni-ilmentymisen sekä syöpäsolut.
Menetelmät
Soluviljely
10 ihmisen mahalaukun syövän solulinjat (SNU-1, -5, -16, -216, -484, -601, -620, -638, -668 ja -719) ja 9 koolonsyöpäsolulinjoissa (SNU-C1, C4, C5, Colo320HSR, LoVo, DLD-1, HT-29, HCT-8 ja HCT-116) saatiin Cancer Research Center Seoul National University (Etelä-Korea). Kaikki solut viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO 2 ilmakehässä käyttäen RPMI 1640-alustassa (GibcoBRL, Gland Island, NY, USA), jossa oli 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (Sigma, ST. Louis, MO, YHDYSVALLAT). Soluja pidettiin joko suspension tai yksikerrosviljelmään, ja jatkoviljeltiin kunnes ne saavuttivat konfluenssin.
Käänteinen transkriptio-polymeraasi ketjureaktio (RT-PCR) määritys
kokonais-RNA uutettiin käyttäen MagExtractor ® varten MFX-2100 (Toyobo, Osaka, Japani) auto-nukleiinihappo puhdistus järjestelmän mukaan valmistajan ohjeiden. MDR1
ja β-aktiini
mRNA-transkriptit havaittiin käyttäen RT-PCR-määrityksessä. MDR1
ilmentymistä havaittiin 5 'ja 3'-alukkeina vastaa nukleotideja 907-930 (5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3') ja 1179-1201 (5'-TGCCAAG-ACCTCTTCAGCTACTG-3 '), vastaavasti, julkaistuun cDNA-sekvenssi [17], jolloin saatiin 296 bp: n PCR-tuotteen. β-aktiinin
mRNA: n ekspressio käytettiin kontrollina RNA: n määrä, ja havaittiin 5 'ja 3'-alukkeina vastaa nukleotidejä 1912-1932 (5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3') ja 2392-2412 ( 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3 '), vastaavasti, julkaistun cDNA-sekvenssin [18], jolloin saatiin 501 bp: n PCR-tuotteen. RNA: ta kustakin näytteestä käänteiskopioitiin käyttäen 200 yksikköä Moloneyn käänteistranskriptaasia (Gibco-Bethesta Research Laboratory, Grand Island, NY, USA) ja 0,18 ug /ml oligo (dT 20) aluke 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Saatu cDNA mahasyövän soluja (2-kertaisesti laimennettua cDNA paksusuolen syövän soluja) monistettiin 1,25 yksikköä Taq-polymeraasia (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 1 mM MgCI 2 ja 10 pmol kumpaakin aluketta lämpösyklilaitteessa (GeneAmp 2400, PE Applied Biosystems, Boston, MA, USA) 22 syklin kanssa koolonkarsinoomasoluissa mutta 35 jaksoa kanssa mahasyövän solujen MDR1
ja 17 jaksoa varten β-aktiini
vaiheittaisen denaturaatio (94 ° C: ssa 30 s), hehkutus (65 ° C: ssa MDR1
, 53 ° C: ssa β-aktiini
), ja laajennuksen (72 ° C 30 s). Sen jälkeen, kun viimeinen sykli, kaikki PCR-tuotteet alistettiin lopullinen pidennys 5 minuutin ajan 72 ° C: ssa. Kvantitoimiseksi, 3 uCi [α- 32P] dCTP: tä lisättiin kuhunkin reaktioseokseen. PCR: n jälkeen PCR-tuotteet yhdistettiin ja sitten elektroforeesi 7,5% denaturoivassa polyakryyliamidigeelissä. Bändit skannattiin densitometrillä (Pdi, Huntington Station, NY, USA). Kunkin mRNA-transkriptin oli normalisoitu, että kunkin β-aktiini
mRNA.
Protein erotus- ja Western blot-analyysi
Yhteensä solulysaatteja valmistettiin hajottamalla korjattu soluja uuttopuskuria (1% NP-40 , 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa), jota oli täydennetty 2 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (Sigma) ja 10 ug /ml leupeptiiniä (Sigma). DNA hajotettiin sonikoimalla ja Western-blottaus-analyysi suoritettiin käyttäen pientä muunnelmaa menetelmästä, jonka ensimmäisenä kuvasi Towbin et ai. [19]. Proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvolle elektroforeesin käyttäen virran 60 V yön yli. Kaivoa inkuboitiin blokkausliuoksessa (5% rasvatonta maitoa) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, pestiin, ja sitten inkuboitiin ensisijaisen vuohen polyklonaalisella vasta-aineella (1: 1000, Santa Cruz, Biotechnology, CA, USA) Pgp. Membraani pestiin ja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (laimennettu 1: 1000) vastakkain IgG isännät ensisijaisen vasta-aineiden 1 tunnin ajan. Membraani värjättiin sitten käyttämällä detektioreagenssia ECL havaitseminen (Amersham, Piscataway, NJ, USA).
Reaaliaikainen PCR
uuttaminen mRNA suoritettiin RNeasy proctocol (Qiagen, Hilden, Saksa ). Yksi mikrogramma kokonais-RNA: ta käänteisesti cDNA: ksi, jonka tilavuus oli 20 ui 200 yksikköä Moloneyn käänteistranskriptaasia (Gibco-Bethesta Research Laboratory, Grand Island, NY, USA) ja 0,18 ug /ml oligo (dT 20) (Promega, Madison, USA) mukaisesti valmistajan ohjeen. Reaaliaikainen PCR suoritettiin Light Cycler 2.0 Instrument (Roche, Mannheim, Saksa) käyttäen Fast Start DNA Master SYBR Green I Kit (Roche). Tarkastamiseksi oikean monistustuotteen, PCR: t analysoitiin 2% agaroosigeelillä värjätty etidiumbromidilla. Sekvenssit alukkeiden ovat seuraavat: ja β-aktiini
, 5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 'ja 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3'; for MDR1
, 5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 'ja 5'-TGCCAAGACCTCTTCAGCTACTG-3'. Kukin reaktio (20 ui) sisälsi 4 ui cDNA: ta (10-kertainen laimennus), 4 mM MgCl 2, 10 pmol kutakin aluketta ja 2 ui Fast Start DNA Master SYGR Green I Mix, joka sisältää puskuria, dNTP: t, SYBR Green väriaine ja Tag-polymeraasin. Amplifikaatiomenetelmän kohdegeenien oli seuraava: pre-denaturointi 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan, 40 sykliä denaturointi 95 ° C 15 sekuntia, pariutuminen ja MDR1
67 ° C: ssa (β-aktiini
55 ° C: ssa) 5 sekunnin ajan, ja pidennys 72 ° C: ssa 7 sekuntia (β-aktiini
21 s). Sulamiskäyräanalyysi suoritettiin vahvistaa tuotantoon yhden tuotteen. Negatiiviset kontrollit ilman mallia tuotettiin kussakin ajossa. Geenien ilmentyminen arvot (suhteellinen mRNA) ilmaistaan ​​suhteet (ero Ct-arvoja = Piste käyrällä, jossa fluoresenssin määrää alkaa kasvaa nopeasti, yleensä muutamia standardipoikkeamaa yli lähtötason, kutsutaan kynnyssykli ( ct-arvo).) välillä geeni (MDR1
mRNA), ja sisäisenä referenssinä geenin (β-aktiini
mRNA), jotka tarjoavat normalisointi tekijä määrän RNA eristettiin näytteestä. Tietojen analysointi suoritettiin käyttäen Light Cycler ohjelmistoversio 4.0 (Roche).
Sytotoksisuus testi käyttäen MTT-määritystä
in vitro
sytotoksisuus lääkkeiden mitattiin käyttäen MTT-määritystä, kuten muualla on kuvattu [20]. Solut ympättiin 2 x 10 4cells /ml ja inkuboitiin yön yli, jotta kiinnitys ja stabilointia. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 3 päivää, ja MTT [3- (4,5-dimetyylitiatsoli-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi, Sigma] lisättiin sitten kuhunkin kuoppaan, jotka sisältävät soluja. Kun on ravisteltu 1 min, levyä inkuboitiin 5 tunnin ajan. Formatsaanikiteet suspension kulttuurin liuotettiin 150 ul: aan dimetyylisulfoksidia (DMSO), supernatantin poistamisen jälkeen. Optinen tiheys kuopat mitattiin mikrolevylukijalla (μQuant, Bio-tek Instruments Inc., Winooski, VT, USA) 540 nm: ssä.
Kvantifiointi PCR-pohjainen metylointianalyysi
Viisi mikrogrammaa genomista DNA: ta pilkottiin 50 U MSP
I tai Hpa
II (Fermentas MBI, Vilna, Liettua) 37 ° C: ssa 16 tunnin ajan, lisättiin 1/15 tilavuus 0,6 M Tris (pH 7,5) ja 1,5 M NaCl, ja pilkottiin 50 U: lla PstI
I (New England Biolabs, MA, USA) 37 ° C: ssa 8 tunnin ajan. Metylaatiostatuksen, että MDR1
5'CpG promoottorialueen tutkittiin analysoimalla 100 ng rajoitusta-hajotetun DNA: n PCR: llä 25 ui reaktiot sisälsi 1,25 yksikköä Taq-DNA-polymeraasia ja 10 pmol kutakin aluketta. Kvantifiointia PCR-pohjainen metylaatio analyysi suoritettiin menetelmän mukaisesti, on raportoitu aiemmin [11]. PCR Käytetyt alukkeet olivat 5'-TCTAGAGAGGTGCAACGGAAG-3 'ja 5'-TCAGCCTCACCACAGATGAC-3' varten MS1 ​​metylaatioherkät alukkeita (121 bp), 5'-TGAAGTCCTCTGGCAAGTCC-3 'ja 5'-ATTCTCCCTCCCGGTTCC-3' varten MS2 metylaatioherkät alukkeita (206 bp), 5'-ATTTCACGTCTTGGTGGCC-3 'ja 5'-TCCAGTGCCACTACGGTTT-G-3'for MC positiivisen kontrollin alukkeet (240 bp), ja 5'-GGCGAAGGAGGT-TGTCTATTC-3' ja 5 ' -AACGTTCTAGGAGAGTCGGG-3 'MN negatiivisen kontrollin alukkeet (240 bp) peräisin trioosifosfaatti-isomeraasi-geenin promoottorialue. Monistaminen suoritettiin DNA-lämpösyklilaitteessa 35 syklin MN, MC, MS1 ja MS2-alukkeita, joissa peräkkäin denaturaatio (95 ° C: ssa 30 s), hehkutus (60 ° C: ssa 30 s), ja laajennuksen (72 ° C 30 s). Sen jälkeen, kun viimeinen sykli, kaikki PCR-tuotteet alistettiin lopullinen laajennus 5 minuuttia 72 ° C: ssa. PCR-tuotteet erotettiin elektroforeesilla 7% PAGE-geeleillä. Sitten geelejä värjättiin etidiumbromidilla ja valokuvattiin käyttämällä Kodak Image Station 4000 MM (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA).
Bisulfiittimodifiointi DNA-sekvenssianalyysi
Yksi ug genomista DNA: ta on modifioitu natrium- bi- käyttämällä EZ DNA metylointi kit (Zymo Research, Orange, CA, USA) muuntaa metyloitumattomat sytosiinit urasiileja jättäen metyloituja sytosiineja muuttumattomana. Bisulfiitti-modifioitua DNA: ta käytettiin PCR-monistuksessa. Laajennettu MS1 pohjamaali sisältää 10 CpG sivustoja, ja 2 SP-1 sivustot, jotka ovat pakollisia toiminnalliset MDR1
promoottori aktivoitava [21]. Alukesekvenssit monistamiseen ui bisulfiittikäsiteltyä säikeiden (223 bp) olivat seuraavat: S: 5'-GGAAGTTAGAATATTTTTTTTGGAAAT-3 '; AS: 5'-ACCTCTACTTCTTTAAACTTAAAAAAACC-3 '. Monistaminen suoritettiin samalla PCR-olosuhteita, paitsi 48 ° C: n pariutumisen lämpötila ja 45 PCR-sykliä. Sen jälkeen, kun viimeinen sykli, kaikki PCR-tuotteet alistettiin lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 5 min. Sekvenssi PCR-tuotteet analysoitiin käyttäen automaattista sekvensseriä (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
Tilastollinen analyysi
Tulokset esitetään keskiarvona ± SE ja tiedot analysoitiin käyttäen Studentin t-testiä
. P-arvot < 0,05 pidettiin merkittävinä.
Tulokset
vertailu ilmentymisen profiilit MDR1 mRNA mahalaukun ja paksusuolen syöpäsoluissa
MDR1
mRNA-ekspressiota analysoitiin RT-PCR-määrityksessä ilmaisu taso on normalisoitu kanssa β-aktiinin
mRNA-tasot on saatu sen jälkeen, kun 17 sykliä PCR: llä. MDR1
mRNA: ta ei havaittu sen jälkeen, kun 22 sykliä PCR: llä 10 mahasyövän solulinjoissa, mutta ei voitu havaita vaihtelevia määriä jälkeen 35 PCR-syklin kanssa, lukuun ottamatta SNU-16, mikä viittaa merkittävästi alhainen MDR1
mRNA: n ekspression mahalaukun syövän solut testattiin (kuvio 1). Kuten kuviossa 1 on esitetty, sijoitus mukaisessa järjestyksessä MDR1-β-aktiini
suhde mahasyövän solulinjoja on seuraava: SNU-668 (1,51) > SNU-484 (1,37) > SNU-5 (0,63) > SNU-601 (0,33) > SNU-719 (0,32) > SNU-216 (0,29) > SNU-638 (0,07) > SNU-1 (0,04) > SNU-16 (0). Ja 9 koolonsyöpäsolulinjoissa, muuttuja MDR1
mRNA-tasoja ei voitu havaita 7 koolonsyöpäsolulinjoissa jälkeen 22 PCR-syklin mutta ei SNU-C5 ja HT-29-soluja. MDR1
mRNA: t kahden jälkimmäisen soluja voitiin ei havaittu edes sen jälkeen, kun 35 sykliä PCR: llä. Nämä tulokset viittaavat siihen, suhteellisen korkea MDR1
mRNA: n ilmentymisen huolimatta joitakin poikkeuksia paksusuolessa syöpäsoluja. Kuten kuviossa 2 on esitetty, sijoitus mukaisessa järjestyksessä MDR1
/β-aktiini
suhde koolonsyöpäsolulinjoissa on seuraava: Colo320HSR (0,90) > SNU-C4 (0,45) > HCT-8 (0,26) > SNU-C1 (0,12) > HCT-116 (0,11) > LoVo (0,10) > DLD-1 (0,07) > SNU-C5 (0) = HT-29 (0). Kuva 1 MDR1 mRNA: n ekspression mahasyövässä solulinjoissa. Taso MDR1
mRNA: n ilmentymisen määritettiin RT-PCR: llä, ja normalisoidaan, että mRNA: n β-aktiini
, jota käytettiin kontrollina RNA: ta. CDNA takaisinmallinnuksella transkriptoidaan mRNA monistettiin erikseen kunkin alukeparia MDR1
ja β-aktiini
geenejä. Alikvootit kutakin PCR-reaktioseos erotettiin 7% polyakryyliamidigeelillä. Geeli kuivattiin ja valotettiin röntgen- kalvon yli yön.
Kuvio 2 MDR1 mRNA: n ilmentymisen paksusuolen syöpäsolulinjoissa. Samaa menetelmää kuviossa 1 esitetyllä tavalla on käytetty.
Me suoritetaan uudelleen reaaliaikaisen RT-PCR-määritys määrällisen validointi MDR1
mRNA-tasojen on saatu RT-PCR-määritystä. MDR1
mRNA: ta ei havaittu 10 mahasyövän solulinjat. Kuitenkin on 9 koolonsyöpäsolulinjoissa, muuttuja MDR1
mRNA-tasoja ei voitu havaita 7 koolonsyöpäsolulinjoissa paitsi SNU-C5 ja HT-29-soluja, koska RT-PCR-data (kuva 3). Kuvio 3 MDR1 mRNA: n ekspression mahalaukun ja paksusuolen syövän solulinjat. Taso MDR1
mRNA: n ilmentymisen määritettiin reaaliaikaisella RT-PCR: llä, ja normalisoidaan, että mRNA: n β-aktiini
, jota käytettiin kontrollina RNA: ta. CDNA käänteistranskriptoidaan mRNA: sta monistettiin erikseen kunkin alukeparia MDR1
ja β-aktiini
geenejä.
Yhdessä nämä MDR1
mRNA-tasot mahan syöpäsolulinjoissa olivat merkittävästi alhaisemmat kuin vuonna koolonsyöpäsolulinjaa.
Kemoherkistävät vaikutukset Pgp estäjien mahalaukun ja koolonkarsinoomasoluissa
Vaikka proteiinin tasot ei tutkittu tässä tutkimuksessa, toiminnalliset tutkimukset suoritettiin käyttäen Pgp inhibiittorit mahan ja paksusuolen syöpä, jotka ilmentävät korkeimmat MDR1
mRNA: n ilmentymisen. Kuten kuviossa 4A on esitetty, Colo320HSR solut (paksusuoli, mutantti p53, korkein ilmentymä MDR1
mRNA) olivat 14-kertaisesti ja > 200 kertaa resistentti paklitakselia kuin SNU-C5 ja SNU-668-soluja (mahalaukun, mutantti p53, korkein ilmentymä MDR1
mRNA) verrattuna perusteella IC 50-arvot, vastaavasti, jotka edustavat merkittävää eroa että Pgp tasoilla. Lisäksi vastus Colo320HSR solujen paklitakselia purettiin Pgp-inhibiittorit, mukaan lukien syklosporiini A, verapamiili, ja PSC833 (kuvio 4B). Tämä suunnanmuutos ei havaittu SNU-C5 (paksusuoli, ei MDR1
mRNA) soluihin sekä SNU-668. Tämä viittaa siihen, että Pgp ilmaistu paksusuolen syöpäsoluissa mutta ei mahan syöpäsolujen toimii toiminnallisesti, ja ne voidaan estää Pgp-inhibiittorit. Kuvio 4 vertailu Pgp ilmentymistä ja toimintaa mahalaukun ja paksusuolen syövän solulinjat. (A) Comparative herkkyys Colo320HSR (paksusuoli, korkein), SNU-668 (mahalaukun, korkein) ja SNU-C5 (paksusuoli, ei ilmaus) paklitakselille; (B) Effects of Pgp estäjien herkkyydestä Colo320HSR, SNU-668 ja SNU-C5 paklitakselille (IC10 pitoisuus; 50 uM, 0,3 nM ja 0,5 nM). Herkkyys paklitakselin määritettiin käyttäen MTT-määritystä läsnä ollessa tai poissa ollessa Pgp-inhibiittorit (syklosporiini A, verapamiili ja PSC833 0,8 uM kutakin). *, P < 0,05 verrattuna kontrolliryhmään.
Vertailu metylaatiostatuksen MDR1 mahalaukun ja paksusuolen syöpäsoluissa
metylaatiostatuksen määritettiin määrällisesti PCR-pohjainen metylointianalyysi varten CpG-rikas domain olevan noin 1 kb sisältäviä eksonin 1 ja introni 1 välillä MDR1
promoottori. Asteen määrittämiseksi metylaation, että MDR1
-geenin promoottorialueen, kaksi aluketta (MS1 ja MS2), joka sisältää Msp
I /Hpa
II sivustoja suunniteltiin eksonista 1 ja intronista 1, vastaavasti. Alukeparin MC käytettiin positiivisena kontrollina laadun määrittämiseksi lähteen genomisen DNA: n. Sen sijaan, MN, joka ylittää Msp
I /Hpa
II sivuilla trioosifosfaatti-isomeraasi-geenin promoottorialue ja ei koskaan metyloitu käytettiin negatiivisena kontrollina. Kuvio 5B esittää tyypillisen kvantifiointiin PCR-pohjainen metylointianalyysi kuvia SNU-5 (mahalaukun) ja HT-29 (paksusuolen) soluja. Kvantifiointia PCR-pohjainen metylointianalyysi kävi ilmi, että mitä tahansa PCR tuotteita MS1 ja MS2 ei tuotettu Pst
1-pilkottu genominen DNA käsitellään Msp
I (metylaatio erottelua entsyymi). Toisaalta, PCR-tuotteita sekä MS1 ja MS2 on SNU-5-soluissa, mutta PCR-tuotteen MS1 ​​yksin HT-29-solut saatiin sen jälkeen, kun Hpa
II (metylaatioherkät entsyymi) käsittely, mikä osoittaa, metylointi CpG klo MS1 ja MS2 sivustoja SNU-5-solut ja vasta MS2 sivuston HT-29-soluja. Kuten esitetty taulukossa 1, metylaatio havaittiin MS1 ​​ja MS2 kohtiin 9 mahasyövän solulinjoissa lukuun ottamatta SNU-484, mutta 2 (SNU-C5 ja HCT-116) 9 koolonsyöpäsolulinjoissa. Toisaalta, HT-29-soluja metyloituja vain MS2 päällä. SNU-C5, HT-29 (paksusuolen) ja SNU-16 (mahalaukun) solut eivät ilmennä MDR1
mRNA metyloituja. Bisulfiitti DNA sekvenssianalyysi suoritettiin vahvistamiseksi metylointi. Kuten näyttää taulukosta 1, metylointi aste (%) 10 CpG sivustoja kulutettu MS1 sivusto on täysin sovitettu saatujen tulosten kvantifiointia PCR-pohjainen metylaatio analysis.Table 1 Metylointi tila ja vaikutukset 5AC ja /tai TSA MDR1
mRNA ilmaisun ja eri maha- ja koolonsyöpäsolulinjaa




DNA metylaatiomääritystä




Tissue
Cell line
5AC
restriktioentsyymillä
Natriumbisulfiitti
TSA

5AC + TSA


Taita
Effect
Site
Degree (%)1

Fold

Effect

Fold

Effect

Gastric
SNU-1
32.6
O
MS1
MS2
100
20.7
O
+23.6
D
SNU-5
5.8
O
MS1
MS2
100
1,03
X
6,8

SNU-16
nd
X
MS1
MS2
60
8,4
O
28,9
S
SNU-216
-1,0
X
MS1
MS2
50
8,4
O
8.2
N
SNU-484
-1,3
X -
-
0
-5,1
X
-0,17
- SNU-601
3,2
O
MS1
MS2
100
3,3
O
13,7
S
SNU-620
67,6
O
MS1
MS2
100
*
X
*
*
SNU-638
68,9
O
MS1
MS2
100
5,7
O
72,9

SNU- 668
-1,0
X
MS1
MS2
80
1,8
O
4,4
S
SNU-719
5.8
O
MS1
MS2
100
4.2
O
12.4
S
Colon
SNU-C1
-1.96
X
n.d.
n.d.
0
1.7
O
+1.0
D
SNU-C4
1.0
X
nd
nd
0
-1
X
-1,6
N
SNU-C5
nd
X
MS1
MS2
100
nd
X
8
S
Colo320HSR
1,4
X
nd
nd
0
1,6
O
1,3
D
LoVo
-1,9
X
nd
nd
0
1.1
X
-2
N
DLD-1
1.1
X
nd
nd
0
3,5
O
1,1
D
HT-29
*
X
nd
MS2
0
∞
O
*
*
HCT-8
1.0
X
nd
nd
0
1.0
X
1,1
N
HCT-116
1.7
O
MS1
MS2
100
1,6
O
1,6
N
1Sequence analysoitiin PCR-tuotteita, jotka sisältävät laajennetun MS1 ​​sivusto, on osoitettu olevan tärkeä rooli MDR1
mRNA ilmaisun. n.d., ei havaittu; *, Erittäin sytotoksinen; ∞, kasvua verrattuna ei MDR1 mRNA
ilmaisu; D, vähentynyt; A, lisäaine; S, synergistinen; N, ei ole muuttunut
Kuva 5 määrän PCR-pohjainen metylointianalyysi mahalaukun ja paksusuolen syövän solulinjat. (A) CpG sivustoja ja Hpa II Twitter /MspI
sivustoja ihmisen MDR1
promoottorialueen. Top: CpG sivustot edustaa lyhyt pystypalkit. Sijainnit eksonien 1 ja 2 on merkitty suljettu laatikoita. Asennossa, joka vastaa näitä fragmentteja on merkitty. Keskellä: Hpa II Twitter /MspI
tunnustamista sivustoja edustaa lyhyt pystypalkit. Pohja, PCR-alukkeet käytetään metylointianalyysi. (B) edustaja metylaatio tilan MDR1
promoottorialueen kvantifiointia PCR-pohjainen metylointianalyysi in SNU-5 (mahalaukun) ja HT-29 (paksusuolen). 1: MN, Never-metyloituja Hpa II Twitter /MspI
sivuilla trioosifosfaatti-isomeraasi geenin promoottorialue (negatiivinen kontrolli) (240 bp); 2: MC, positiivinen kontrolli alukeparia (240 bp); 3: MS1, Hpa II Twitter /MspI Sivuston 1 (121 bp); 4: MS2, Hpa II
/MspI
päällä 2 (206 bp).
Vaikutukset 5-atsa-2'-deoxcytidine (5AC) ja /tai trikostatiini A (TSA) on ilmaus MDR1 mRNA mahalaukun ja paksusuolen syövän solulinjoissa
DNA metyylitransferaasi estäjä 5AC ja histonideasetylaasi (HDAC) estäjä TSA ovat hyvin tiedossa lievittää epigeneettiset geeni tukahduttaminen [22]. Tutkimuksessa tutkittiin, mikä vaikutus 5AC ja /tai TSA MDR1
mRNA ilmaisun mahalaukun ja paksusuolen syöpä linjat. 10 maha- ja 9 koolonsyöpäsoluja, MDR1
mRNA: n ekspressio määritettiin RT-PCR: llä sen jälkeen, kun käsittelemällä ne 2,5 uM 5AC 96 tuntia ja /tai 100 ng /ml TSA 48 tuntia. Lisäys määriteltiin tapauksissa osoittaa yli 1,5-kertainen. Kuten on esitetty taulukossa 1 5AC hoito lisäsi MDR1
mRNA tasoilla SNU-1, -5, -601, -620, -638 ja -719 mahasyövän solulinjoja, ja että HCT-116 koolonin syövän solulinja (kuviot 6 ja 7). Kuitenkin, 5AC ei aiheuttanut MDR1
mRNA: n ilmentymisen jopa SNU-16 ja SNU-C5 ja HT-29-solujen, joiden MDR1
geeni metyloitu. TSA käsittely lisäsi MDR1
mRNA tasot SNU-1, -16, -216, -601, -638, -668 ja -719 mahasyövän solulinjoissa ja SNU-C1, Colo320HSR, DLD-1, H29 ja HCT-116 koolonsyöpäsolulinjoissa (kuvio 6 ja 7). 5AC osoitti korkea sytotoksisuus yksin tai yhdessä TSA, erityisesti HT-29-soluja. Myös TSA näytti erittäin sytotoksinen aktiivisuus yksin tai yhdessä 5AC erityisesti SNU-620 soluja. Tutkimuksessa tarkasteltiin myös vaikutuksia yhdistetyn hoidossa 5AC TSA, mikä lisäsi MDR1
mRNA-tasoja additiivisesti vuonna SNU-5 ja -638 soluissa, mutta synergistisesti vuonna SNU-16, -601, -668, -719 ja SNU-C5-soluissa (taulukko 1). Kuva 6 aktivointi MDR1 mRNA ilmentymisen 5AC ja /tai TSA mahalaukun syöpäsoluja. Ilmaisu taso ilmoitetaan suhteena MDR1 Twitter /β-aktiini. Kokonais-RNA eristettiin käsittelyn jälkeen 2,5 uM 5AC 96 tuntia ja /tai 100 ng /ml TSA 48 tuntia. RT-PCR suoritettiin käyttäen samaa menetelmää raportoitu kuviossa 1.
Kuvio 7 aktivointi MDR1 mRNA ilmentymisen 5AC ja /tai TSA eri koolonsyöpäsolulinjoissa. RT-PCR-määritys jälkeen käsittelemällä soluja 5AC ja /tai TSA käyttämällä samaa menetelmää on kuvattu kuviossa 6. MDR1 /β-aktiini
suhde saadaan 35-syklin PCR jälkeen TSA yhdessä 5AC, ja yksin SNU C5 ja HT-29-ilmentävät ei MDR1
mRNA, vastaavasti, jätettiin pois histogrammin.
Nämä tulokset viittaavat siihen, että MDR1
mRNA: n ekspressio säädellään eri tavalla mahalaukun ja paksusuolen syövän solujen suhteen hiljentämisen MDR1
ilmaisun epigeneettisellä mekanismeja, kuten DNA: n metylaation ja /tai histoni deasetylaatiolla.
keskustelu
tässä tutkimuksessa havaitsimme, että MDR1
mRNA tasoilla mahasyövän solulinjat olivat merkittävästi alhaisemmat kuin paksusuolen syövän solulinjat, vaikkakin oli joitakin eroja. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​raportti osoittaa, että Pgp ilmentyy voimakkaasti sykkyräsuolen ja paksusuolen, tasolle, joka vähitellen pienenee proksimaalisesti osaksi tyhjäsuolen pohjukaissuoli ja mahan [8]. Koska mahan ja paksusuolen pelata suuria rooleja ruoansulatus ja imeytyminen, vastaavasti, ei ole yllättävää, että kuljettajat kuten Pgp oli differentiaalisesti ilmaistut kaksi normaaleissa kudoksissa. Meidän havainto, että ero ilmentyminen MDR1
mRNA syöpäsolulinjoissa peräisin vatsa ja paksusuolen on sopusoinnussa myös julkaistu raportteja [23-26]. Immunopatologisia tutkimukset paljastivat, että Pgp ilmaus ihmisen kasvainten yleisimmin havaittu paksusuolen, munuaisten, ja lisämunuaisen karsinoomien mutta harvoin keuhko- ja mahakarsinoomat ja tiettyjen itusolukasvaimet [27].
Kolmitie yhteys DNA: n metylaatio, chromatin rakenne ja geeniekspressio tarkasteli hiljattain [28-30]. Tärkeä seuraus CpG metylaation on paikallinen hiljentäminen geenin ilmentymisen, joka voidaan välittää suoraan häiriön metylaation sitoutumisen kanssa eri transkriptiotekijöiden. Pääkomponentti hiljentäminen geenin ilmentymisen näyttää sitoutumisen metyyli-CpG: tä sitova proteiini 2 (MeCP2), jolla on affiniteettia metyyli-CpG [31, 32]. DNA demetylaatio 5AC aiheuttaa vapauttamaan MeCP2 promoottorista, joka aktivoi transkription geenin ilmentymistä [10]. Tiedetään, että MeCP2 on myös rikastunut on MDR1
promoottori ja liittyy sen äänenvaimennusjärjestelmän [33]. 5AC muuttaa mety- MDR
1 promoottorin Pgp-negatiivisten solujen muistuttamaan Pgp-positiivisia soluja ja aktivoi promoottorin siten, että MDR1
mRNA on havaittavissa [34].
Tässä tutkimuksessa metylaatiostatuksen analysoitiin myös sen määrittämiseksi, jos MDR1
hiljentäminen johtuu hypermetylaation promoottorialueen.

• Imaging arvioitaessa maksan ja vatsakalvon etäpesäkkeitä mahasyövän: järjestelmällinen katsaus
• Mahalaukun putki lisäys suorassa visio käyttäen kuningas Vision ™ video Laryngoskoopin: satunnaistettu, prospektiivinen, kliininen tutkimus