Les mécanismes épigénétiques impliqués dans l'expression de MDR1mRNA différentiel entre les lignes et les justifications cellulaires gastriques et cancer du côlon pour la chimiothérapie clinique

Les mécanismes épigénétiques impliqués dans différentiel MDR1 de l'expression de l'ARNm entre les lignes et les justifications cellulaires gastriques et cancer du côlon pour la chimiothérapie clinique
Résumé de l'arrière-plan
Les transporteurs membranaires tels que la P-glycoprotéine (Pgp), le MDR1
produit du gène, sont l'une des causes de l'échec du traitement chez les patients cancéreux. Dans cette étude, les mécanismes épigénétiques impliqués dans différentiel MDR1 de l'ARNm de l'expression ont été comparés entre 10 gastrique et 9 côlon lignées cellulaires de cancer.
Méthodes
Les niveaux d'ARNm
MDR1 ont été déterminés par PCR en temps réel et dosages PCR après transcription inverse. La cytotoxicité a été réalisée en utilisant le test MTT. basée sur la PCR état de méthylation a été examinée par quantification méthylation et un séquençage d'ADN au bisulfite analyse.: Résultats Les taux d'ARNm

MDR1 obtenus par 35 cycles de RT-PCR dans les cellules cancéreuses gastriques étaient juste comparables à ceux obtenus par 22 cycles de RT-PCR dans les cellules cancéreuses du côlon. Analyse en temps réel RT-PCR a révélé que MDR1 de l'ARNm n'a été détecté dans les 10 lignées gastriques de cellules cancéreuses, mais les taux d'ARNm variables MDR1
à 7 de lignées de cellules cancéreuses 9 du colon, à l'exception du SNU-C5 et des cellules HT-29 . test MTT a montré que les inhibiteurs de Pgp tels que la cyclosporine A, le vérapamil et PSC833 sensibilisés Colo320HSR (côlon, expression
le plus MDR1) mais pas SNU-668 (gastrique, la plus élevée) et SNU-C5 (gastrique, pas d'expression) au paclitaxel. l'analyse de méthylation à base de PCR a révélé que la quantification 90% des cellules de cancer de l'estomac, et 33% des cellules cancéreuses du côlon étaient méthylés, qui ont été complètement en correspondance avec les résultats obtenus par analyse de séquençage au bisulfite de l'ADN. 5-aza-2'-deoxcytidine (5AC, un inhibiteur d'ADN méthyltransférase) a augmenté la MDR1 des niveaux d'ARNm dans 60% des cellules gastriques, et dans 11% des cellules cancéreuses du côlon. Trichostatine A (TSA, un inhibiteur d'histone désacétylase), le MDR1 des niveaux d'ARNm a augmenté dans 70% des cellules cancéreuses gastriques et 55% des cellules cancéreuses du côlon. Le traitement combiné de 5AC TSA augmente la MDR1 des niveaux d'ARNm additivement dans 20% des cellules cancéreuses gastriques, mais de manière synergique dans 40% des ulcères gastriques et 11% des cellules cancéreuses du côlon.

Conclusion Ces résultats indiquent que le MDR1 de niveaux d'ARNm dans les cellules de cancer gastrique sont nettement inférieurs à ceux dans les cellules cancéreuses du côlon, qui est au moins en partie en raison de différentes régulations épigénétiques telles que la méthylation de l'ADN et /ou la désacétylation des histones. Ces résultats peuvent fournir une meilleure compréhension de l'efficacité de la chimiothérapie combinée, ainsi que leur biodisponibilité orale.
Contexte
gastrique et le cancer colorectal sont une cause de morbidité et de mortalité dans le monde d'aujourd'hui. Si une exérèse chirurgicale est impossible, ces cancers réagissent très mal à la chimiothérapie et aboutissant à un mauvais pronostic. Chez les patients atteints de cancer gastrique, le 5-fluorouracile (5-FU) la chimiothérapie combinée à base ont été tentées afin d'améliorer les résultats du traitement [1]. Avec le cancer colorectal, le 5-FU a été le médicament le plus largement utilisé depuis plus de 40 ans. Cependant, d'autres agents tels que l'oxaliplatine ou l'irinotécan ont été utilisés pour améliorer l'efficacité anti-tumorale en combinaison avec le 5-FU [2]. 5-FU interfère avec la synthèse de l'ADN en bloquant la production de pyrimidine nucléotide dTMP partir de dUMP lors de novo
la synthèse d'ADN par l'inhibition de la thymidylate synthase, ainsi que par l'incorporation de fluoro-nucléotides dans l'ADN et de l'ARN [3].
P-glycoprotéine (Pgp) codée par la multirésistance 1 (MDR1
) gène est une pompe à efflux membranaire représentant de ATP-binding cassette (ABC) transporteurs [4-6]. les fonctions de Pgp que les pompes à efflux dépendant de l'énergie d'une variété de structures diverses agents chimiothérapeutiques tels que la doxorubicine, la vincristine, la vinblastine, le paclitaxel, colhicine, l'actinomycine D et la mitomycine C [7], ce qui peut diminuer le taux intracellulaire d'accumulation du médicament. Par conséquent, la surexpression de ces protéines MDR confère aux cellules cancéreuses en évitant les effets cytotoxiques de la drogue. Dans l'intestin humain, Pgp est fortement exprimé à la surface apicale des cellules épithéliales superficielles de l'iléon et du côlon, et son niveau d'expression diminue progressivement du côté proximal dans le jéjunum, du duodénum et de l'estomac [8]. Régulation de l'activité transcriptionnelle du gène de la MDR1 dépend de plusieurs protéines agissant en trans qui lient les consensus cis-éléments [9]. L'accessibilité des éléments promoteurs à leurs facteurs de liaison est régulée au niveau de l'assemblage de la chromatine. Les deux niveaux de méthylation de l'ADN et la désacétylation des histones régulent l'expression du gène MDR1 de [10-12]. Jusqu'à présent, la régulation transcriptionnelle de l'expression génique de MDR1 par des mécanismes épigénétiques a été rapporté dans l'expression dans les cellules cancéreuses du côlon [13-16], mais aucun dans les cellules des cancers gastriques. En outre, les rapports entre l'expression transcriptionnelle de l'expression du gène MDR1 et des mécanismes épigénétiques dans les cellules de cancer de l'estomac et du côlon n'a pas été comparées. Par conséquent, on ne sait pas pourquoi les régimes de chimiothérapie ont été utilisés pour traiter différemment gastrique et le cancer colorectal et pourquoi MDR1 de l'ARNm est exprimé de manière différentielle dans les cellules cancéreuses gastriques et colorectaux. Par conséquent, cette étude a examiné si oui ou non le degré de méthylation au niveau du site du promoteur du gène de la MDR1 est étroitement associée à l'expression du gène de la MDR1 dans les cellules cancéreuses.

Méthodes Culture cellulaire
les 10 lignées humaines gastriques de cellules cancéreuses (SNU-1, -5, -16, -216, -484, -601, -620, -638, -668 et -719) et des lignées cellulaires du cancer du côlon 9 (SNU-C1, C4, C5, Colo320HSR, LoVo, DLD-1, HT-29, HCT-8 et HCT-116) ont été obtenus à partir du Centre de recherche sur le cancer à l'Université nationale de Séoul (Corée du Sud). Toutes les cellules ont été cultivées à 37 ° C dans un CO 5% 2 atmosphère à l'aide du milieu RPMI 1640 (GibcoBRL, Île Gland, NY, USA) avec du sérum fœtal bovin inactivé 10% de la chaleur (Sigma, ST. Louis, MO, ETATS-UNIS). Les cellules ont été maintenues soit sous forme d'une suspension ou d'une culture monocouche, et repiquées jusqu'à ce qu'ils atteignent la confluence.
Inverse réaction en chaîne transcription-polymerase (RT-PCR)
L'ARN total a été extrait en utilisant MagExtractor ® pour MFX-2100 (Toyobo, Osaka, Japon), système de purification d'acide nucléique automatique, selon les instructions du fabricant. Le Site MDR1 et
transcrits d'ARNm de ß-actine ont été détectés à l'aide du dosage par RT-PCR. L'expression de MDR1 a été détectée avec le 5 'et 3' des amorces correspondant aux nucléotides 907-930 (5 'CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3') et 1179 à 1201 (5'-TGCCAAG-ACCTCTTCAGCTACTG-3 '), respectivement, la séquence publiée de l'ADNc [17], ce qui donne un produit de PCR de 296 pb. β-actine
expression de l'ARNm a été utilisé comme témoin pour la quantité d'ARN, et a été détectée avec le 5 'et 3' des amorces correspondant aux nucléotides 1912-1932 (5 'GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3') et 2392-2412 ( GTTGAACTCTCTACATACTTCCG 5'-3 '), respectivement, de la séquence publiée de l'ADNc [18], ce qui donne un produit de PCR de 501 pb. L'ARN de chaque échantillon a été transcrit inverse en utilisant 200 unités de virus de la leucémie murine de Moloney transcriptase inverse (Laboratoire Gibco-Bethesta Research, Grand Island, NY, USA) et 0,18 pg /ml d'oligo (dT 20) amorce pendant 1 h à 37 ° C. L'ADNc résultant des cellules de cancer gastrique (2 fois dilué l'ADNc dans les cellules du cancer du côlon) ont été amplifiés avec 1,25 unités de Taq polymérase (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 1 mM MgCl 2 et 10 pmole de chaque amorce dans un cycleur thermique (GeneAmp 2400, PE Applied Biosystems, Boston, MA, USA) pendant 22 cycles avec les cellules du cancer du côlon, mais 35 cycles avec les cellules de cancer gastrique pour MDR1
et 17 cycles pour β-actine
de la dénaturation séquentielle (94 ° C pendant 30 s), de recuit (65 ° C pendant MDR1
, 53 ° C pendant β-actine
) et extension (72 ° C pendant 30 s). Après le cycle final de tous les produits de la PCR ont été soumis à une extension finale de 5 min à 72 ° C. Pour la quantification, 3 pCi de [α- 32P] dCTP ont été ajoutés à chaque mélange réactionnel. Après que PCR, les produits de PCR ont été combinés, puis soumis à une électrophorèse sur un gel dénaturant de Polyacrylamide à 7,5%. Les bandes ont été analysés avec un densitomètre (Pdi, Huntington Station, NY, USA). La quantité de chaque transcrit d'ARNm a été normalisée avec celle de chaque
ARNm β-actine.
Extraction des protéines et analyse par Western Blot
lysats cellulaires totaux ont été préparés par lyse des cellules récoltées dans un tampon d'extraction (1% de NP-40 , 0,5% de désoxycholate de sodium, 0,1% de SDS dans une solution saline tamponnée au phosphate) supplémenté avec 2 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (Sigma) et 10 pg /ml de leupeptine (Sigma). L'ADN a été cisaillé par sonication et l'analyse Western Blot a été effectuée en utilisant une légère modification de la méthode décrite en premier lieu par Towbin et al. [19]. Les protéines ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose par électrotransfert en utilisant un courant de 60 V pendant la nuit. La membrane a été incubée en solution (5% de lait écrémé) bloquant pendant 1 h à température ambiante, lavé, puis incubé avec l'anticorps polyclonaux de chèvre primaire (1: 1000, Santa Cruz, Biotechnology, CA, USA) pour Pgp. La membrane a été lavée et incubée avec du raifort anticorps secondaire conjugué à la peroxydase (dilué à 1: 1000) contre chacune des IgG pour les hôtes des anticorps primaires pendant 1 heure. La membrane a été ensuite coloré en utilisant le réactif de détection du kit de détection ECL (Amersham, Piscataway, NJ, USA).
Temps réel Extraction PCR de l'ARNm a été réalisée selon la proctocol RNeasy (Qiagen, Hilden, Allemagne ). Un microgramme d'ARN total a été inversement transcrit en ADNc dans un volume de 20 ul avec 200 unités de virus de la leucémie murine de Moloney transcriptase (Laboratoire de recherche Gibco-Bethesta, Grand Island, NY, USA) inverse et 0,18 pg /oligo ml (dT 20) amorces (Promega, Madison, Etats-Unis) selon le manuel du fabricant. PCR en temps réel a été réalisée avec le Cycler 2.0 Instrument Light (Roche, Mannheim, Allemagne) en utilisant le Fast Start DNA Master SYBR Green I Kit (Roche). Pour la vérification du produit d'amplification correct, PCR ont été analysés sur un gel d'agarose 2% coloré au bromure d'éthidium. Les séquences des amorces sont les suivantes: pour la β-actine
, 5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 'et 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3';
pour MDR1, 5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 'et 5'-TGCCAAGACCTCTTCAGCTACTG-3'. Chaque réaction (20 pi) contenait 4 pi d'ADNc (10 fois la dilution), 4 mM MgCl 2, 10 pmol de chaque amorce et 2 ul d'ADN Fast Start Maître SYGR Green I Mix contenant un tampon, des dNTP, SYBR colorant vert et Tag polymerase. La procédure d'amplification des gènes cibles étaient les suivantes: pré-dénaturation à 95 ° C pendant 10 min, 40 cycles de dénaturation à 95 ° C pendant 15 sec, recuit de la MDR1
à 67 ° C (β-actine
à 55 ° C) pendant 5 secondes, et l'extension à 72 ° C pendant 7 secondes (β-actine
pendant 21 s). Melting analyse de la courbe a été effectuée pour confirmer la production d'un seul produit. Des contrôles négatifs sans modèle ont été produits pour chaque exécution. Les valeurs d'expression génique (niveaux d'ARNm relatifs) sont exprimés sous forme de ratios (différence entre les valeurs Ct = Le point sur la courbe dans laquelle la quantité de fluorescence commence à augmenter rapidement, généralement quelques écarts types au-dessus de la ligne de base, est appelée le cycle de seuil ( la valeur de Ct.)) entre le gène d'intérêt (MDR1 d'ARNm) et d'un gène de référence interne (β-actine
ARNm) qui fournissent un facteur de normalisation de la quantité d'ARN isolé à partir d'un spécimen. L'analyse des données a été réalisée en utilisant la version légère Cycler 4.0 du logiciel (Roche). Test
de cytotoxicité en utilisant un test MTT The vitro
cytotoxicité des médicaments a été mesurée en utilisant un test MTT, comme décrit par ailleurs [20]. Les cellules ont été ensemencées à 2 x 10 4cells /ml et on fait incuber pendant une nuit pour permettre la fixation et la stabilisation. Les cellules ont été incubées à 37 ° C pendant 3 jours, et le MTT [bromure de 3- (4,5-diméthylthiazole-2-yl) -2,5-diphényl tétrazolium, Sigma] solution a ensuite été ajouté à chaque puits contenant les cellules. Après avoir agité pendant 1 min, la plaque a été incubée pendant 5 heures. cristaux de formazan de la culture en suspension ont été dissous dans 150 ul de diméthylsulfoxyde (DMSO) après avoir éliminé le surnageant. La densité optique des puits a été mesurée avec un lecteur de microplaques (μQuant, Bio-tek Instruments Inc., Winooski, VT, USA) à 540 nm.
Analyse de la méthylation par PCR Quantification
Cinq microgrammes de l'ADN génomique a été digéré avec 50 U de Msp
I ou Hpa
II (Fermentas MBI, Vilnius, Lituanie) à 37 ° C pendant 16 heures, ajouté à un volume 1/15 de 0,6 M Tris (pH 7,5) et 1,5 M de NaCl, et digéré avec 50 U de Pst
I (New England Biolabs, MA, USA) à 37 ° C pendant 8 heures. L'état de méthylation de la région de promoteur de la 5'CpG MDR1 a été examiné par analyse de l'ADN digéré par restriction de 100 ng par PCR dans des réactions de 25 ul contenant 1,25 unités d'ADN polymerase Taq et 10 pmol de chaque amorce. L'analyse de méthylation à base de PCR de quantification a été réalisée selon la méthode décrite précédemment [11]. Les amorces de PCR utilisées étaient 5'-TCTAGAGAGGTGCAACGGAAG-3 'et 5'-TCAGCCTCACCACAGATGAC-3' pour les amorces MS1 sensibles à la méthylation (121 pb), 5'-TGAAGTCCTCTGGCAAGTCC-3 'et 5'-ATTCTCCCTCCCGGTTCC-3' pour la MS2 des amorces sensibles à la méthylation (206 pb), 5'-ATTTCACGTCTTGGTGGCC-3 'et 5'-TCCAGTGCCACTACGGTTT-G-3'for MC amorces de contrôle positif (240 pb) et 5' GGCGAAGGAGGT-TGTCTATTC-3 'et 5' -AACGTTCTAGGAGAGTCGGG-3 'pour les amorces MN de contrôle négatif (240 pb) provenant de la région du promoteur du gène de la triose phosphate isomérase. L'amplification a été effectuée dans un cycleur thermique d'ADN pendant 35 cycles pour les amorces MN, MC, MS1 et MS2 impliquant successivement la dénaturation (95 ° C pendant 30 secondes), hybridation (60 ° C pendant 30 s) et extension (72 ° C, pendant 30 s). Après le cycle final de tous les produits de la PCR ont été soumis à une extension finale pendant 5 min à 72 ° C. Les produits de PCR ont été séparés par électrophorèse sur des gels à 7% PAGE. Les gels ont ensuite été colorés avec du bromure d'éthidium et photographiés à l'aide d'une station d'image Kodak 4000 MM (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA).
Bisulfite analyse de séquençage d'ADN
Un pg d'ADN génomique a été chimiquement modifié par le sodium bisulfite en utilisant le kit EZ méthylation de l'ADN (Zymo Research, orange, CA, USA) pour convertir les cytosines non méthylés à uraciles tout en laissant cytosines méthylés inchangée. L'ADN au bisulfite modifié a été utilisé pour l'amplification par PCR. amorce MS1 prolongée contient 10 sites CpG, et 2 SP-1 des sites qui sont obligatoires pour le promoteur du MDR1 fonctionnelle à activer [21]. Les séquences d'amorces pour l'amplification de brins traité au bisulfite (223 pb) ont été les suivants: S: 5'-GGAAGTTAGAATATTTTTTTTGGAAAT-3 '; AS: 5'-ACCTCTACTTCTTTAAACTTAAAAAAACC-3 '. L'amplification a été réalisée dans les mêmes conditions de PCR à l'exception de 48 ° C la température de recuit et 45 cycles de PCR. Après le cycle final de tous les produits de la PCR ont été soumis à une extension finale à 72 ° C pendant 5 min. Séquence des produits de PCR a été analysé à l'aide d'un séquenceur automatisé (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) Analyse statistique de.
Les résultats sont présentés comme une moyenne ± SE et les données ont été analysées à l'aide du test t de Student
. P valeurs < 0,05 étaient considérées comme significatives.
Résultats La comparaison des profils d'expression de l'ARNm MDR1 dans l'expression de l'ARNm des cellules gastriques MDR1 et le cancer du côlon a été analysée en utilisant le test de RT-PCR avec le niveau d'expression étant normalisée par la ß-actine
niveaux d'ARNm obtenus après 17 cycles de PCR. l'ARNm du gène MDR1 n'a pas été détecté après 22 cycles de PCR dans les 10 lignées cellulaires de cancer gastrique mais n'a pu être détectée à des niveaux variables après 35 cycles de PCR à l'exception de SNU-16, ce qui suggère un niveau significativement bas de la MDR1
l'expression de l'ARNm dans les cellules cancéreuses gastriques testées (figure 1). Comme le montre la figure 1, l'ordre de classement en fonction du rapport de
MDR1-β-actine dans les lignées cellulaires de cancer gastrique est la suivante: SNU-668 (1.51) > SNU-484 (1.37) > SNU-5 (0,63) > SNU-601 (0,33) > SNU-719 (0,32) > SNU-216 (0,29) > SNU-638 (0,07) > SNU-1 (0,04) > SNU-16 (0). Parmi les lignées cellulaires de cancer du côlon 9, MDR1 variables de niveaux d'ARNm ont pu être détectés dans les lignées cellulaires du cancer du côlon 7 après 22 cycles de PCR, mais pas dans le SNU-C5 et cellules HT-29. Les ARNm de la MDR1 des deux dernières cellules peuvent être pas détectés, même après 35 cycles de PCR. Ces résultats suggèrent un niveau relativement élevé d'ARNm expression de MDR1 en dépit de quelques exceptions dans les cellules du cancer du côlon. Comme le montre la figure 2, l'ordre de classement selon le MDR1
/β-actine rapport dans les lignées cellulaires du cancer du côlon
est la suivante: Colo320HSR (0.90) > SNU-C4 (0,45) > HCT-8 (0,26) > SNU-C1 (0,12) > HCT-116 (0,11) > LoVo (0.10) > DLD-1 (0,07) > SNU-C5 (0) = HT-29 (0). La figure 1 MDR1 expression de l'ARNm dans des lignées cellulaires de cancer gastrique. Le niveau d'ARNm de l'expression de MDR1 a été déterminée par RT-PCR, et normalisée par celle de l'ARNm de β-actine
, qui a été utilisé comme témoin pour l'ARN. L'ADNc transcription inverse de l'ARNm a été amplifié séparément avec chaque paire d'amorces pour MDR1 et
gènes de ß-actine. Des aliquotes de chaque mélange réactionnel de PCR ont été séparés sur un gel de Polyacrylamide à 7%. Le gel a été séché et exposé à un film radiographique pendant une nuit.
Figure 2 MDR1 expression de l'ARNm dans les lignées cellulaires du cancer du côlon. La même méthode rapportée dans la figure 1 a été utilisé.
Nous avons effectué de nouveau en temps réel RT-PCR pour la validation quantitative des niveaux d'ARNm obtenues à partir de MDR1 dosage par RT-PCR. l'ARNm du gène MDR1 n'a pas été détectée dans les 10 lignées cellulaires de cancer gastrique. Cependant, des lignées de cellules cancéreuses 9 du côlon, une variable MDR1 des niveaux d'ARNm ont pu être détectés dans les lignes 7 du côlon de cellules cancéreuses, à l'exception du SNU-C5 et des cellules HT-29 en tant que données de RT-PCR (figure 3). La figure 3 MDR1 expression de l'ARNm dans des lignées de cellules gastriques et le cancer du côlon. Le niveau d'ARNm de l'expression de MDR1 a été déterminée en temps réel RT-PCR, et normalisée par celle de l'ARNm de β-actine
, qui a été utilisé comme témoin pour l'ARN. L'ADNc à une transcription inverse à partir de l'ARNm a été amplifiée séparément avec chaque paire d'amorces pour la MDR1 et
gènes de ß-actine.
Pris ensemble, le MDR1 des niveaux d'ARNm dans les lignées cellulaires de cancer gastrique ont été significativement inférieures à celles dans les lignées cellulaires du cancer du côlon.
effets chimiosensibilisateurs des inhibiteurs de Pgp dans des cellules de cancer de l'estomac et du côlon
Bien que les teneurs en protéines ont pas été examinées dans cette étude, des études fonctionnelles ont été effectuées en utilisant les inhibiteurs de Pgp dans l'estomac et le cancer du côlon lignées cellulaires exprimant le plus haut niveau d'ARNm de l'expression de MDR1. Comme on le voit sur la figure 4A, les cellules (Colo320HSR du côlon, la p53 mutante, la plus haute expression de l'ARNm du gène MDR1) étaient 14 fois et > 200 fois résistantes au paclitaxel que le SNU-C5 et SNU-668 cellules (gastrique, p53 mutante, la plus haute expression de l'ARNm de MDR1) par comparaison sur la base de l'IC 50 valeurs, respectivement, représentant une différence significative dans les niveaux Pgp. En outre, la résistance des cellules Colo320HSR au paclitaxel a été inversé par les inhibiteurs de Pgp, notamment la cyclosporine A, le vérapamil et PSC833 (figure 4B). Cependant, ce renversement n'a pas été observée dans le SNU-C5 (colon, ARNm no MDR1) des cellules ainsi que SNU-668. Ceci suggère que la Pgp exprimée dans les cellules du cancer du côlon, mais non les cellules cancéreuses gastriques fonctionne fonctionnellement et peut être inhibée par les inhibiteurs de Pgp. Figure 4: Comparaison de l'expression et de la fonction Pgp dans des lignées cellulaires gastriques et cancer du côlon. (A) de sensibilité comparée des Colo320HSR (colon, le plus élevé), SNU-668 (gastrique, la plus élevée) et SNU-C5 (colon, pas d'expression) au paclitaxel; (B) Effets des inhibiteurs de Pgp sur la sensibilité des Colo320HSR, SNU-668 et SNU-C5 au paclitaxel (concentration IC10, 50 uM, 0,3 nM et 0,5 nM, respectivement). La sensibilité au paclitaxel a été déterminée en utilisant un dosage MTT en présence ou en l'absence des inhibiteurs de Pgp (cyclosporine A, PSC833 vérapamil et de 0,8 pM chacune). *, P <. 0,05 par rapport au contrôle
comparaison de l'état de méthylation de MDR1 dans les cellules de cancer gastrique et du côlon
Le statut de méthylation a été déterminée par analyse de la méthylation par PCR de quantification pour un domaine riche en CpG à environ 1 Kb contenant l'exon 1 et intron 1 entre le promoteur du gène MDR1. Pour déterminer le degré de méthylation de la région du promoteur du gène de la MDR1, deux amorces (MS1 et MS2) contenant le Msp
I /Hpa
les sites II ont été conçus à partir de l'exon 1 et intron 1, respectivement. La paire d'amorces MC a été utilisé comme témoin positif pour déterminer la qualité de l'ADN génomique de la source. En revanche, le MN qui traverse I /Hpa II
site du MSP à la région du promoteur du gène de la triosephosphate isomérase et est méthylé jamais été utilisé comme témoin négatif. La figure 5B montre à base de PCR typique quantification des images d'analyse de la méthylation de l'SNU-5 (gastrique) et HT-29 (côlon) cellules. L'analyse de la méthylation par PCR de quantification a révélé que tous les produits de PCR pour le MS1 et MS2 ne sont pas fabriqués à partir de Pst
1 digéré l'ADN génomique traité avec Msp
I (enzyme de méthylation insensible). D'autre part, les produits de PCR pour les deux MS1 et MS2 dans les cellules SNU-5, mais un produit de PCR pour le MS1 seul dans les cellules HT-29 ont été obtenues après
Hpa II (enzyme sensible à la méthylation) le traitement, ce qui indique une méthylation de CpG au niveau des sites MS1 et MS2 dans les cellules SNU-5 et seulement au niveau du site MS2 dans les cellules HT-29. Comme cela est résumé dans le tableau 1, la méthylation a été détectée dans les sites MS1 et MS2 des 9 gastriques lignées de cellules cancéreuses à l'exception du SNU-484, mais 2 (SNU-C5 et HCT-116) des lignées de cellules cancéreuses 9 du côlon. D'un autre côté, les cellules HT-29 ont été méthylés seulement au niveau du site MS2. Le SNU-C5, HT-29 (côlon) et SNU-16 (gastrique), les cellules n'exprimant MDR1
ARNm ont été méthylé. Bisulfite analyse de séquençage d'ADN a été effectuée pour confirmer la méthylation. Comme le montre le tableau 1, le degré de méthylation (%) des 10 sites CpG sur le site MS1 dépensé est complètement appariés avec les résultats obtenus par quantification par PCR à base de méthylation analysis.Table 1 état de méthylation et les effets de 5AC et /ou TSA sur MDR1
expression de l'ARNm et dans diverses lignées cellulaires gastrique et le cancer du côlon




test de méthylation d'ADN




Tissue
lignée cellulaire
5AC
Restriction Enzyme
bisulfite de sodium
TSA

5AC + TSA


Fold
effet de site officiel

Degree (%)1

Fold

Effect

Fold

Effect

Gastric
SNU-1
32.6
O
MS1
MS2
100
20.7
O
+23.6
D
SNU-5
5.8
O
MS1
MS2
100
1,03
X
6.8
A
SNU-16
e
X
MS1
MS2
60
8.4
O
28,9
S
SNU-216
-1.0
X
MS1
MS2
50
8.4
O
8.2
N
SNU-484
-1.3
X
-
- 0
-5.1
X
-0.17
- SNU-601
3.2
O
MS1
MS2
100
3.3
O
13,7
S
SNU-620
67,6
O
MS1
MS2
100
*
X
*
*
SNU-638
68,9
O
MS1
MS2
100
5.7
O
72,9
A
SNU- 668
-1.0
X
MS1
MS2
80
1.8
O
4.4
S
SNU-719
5.8
O
MS1
MS2
100
4.2
O
12.4
S
Colon
SNU-C1
-1.96
X
n.d.
n.d.
0
1.7
O
+1.0
D
SNU-C4
1.0
X
nd
nd
0
-1
X
-1.6
N
SNU-C5
nd
X
MS1
MS2
100
nd
X 8
S
Colo320HSR
1.4
X
e
nd
0
1.6
O
+1,3
D
LoVo
-1.9
X
nd nd

0
1.1
X
-2
N de DLD-1
1.1
X
nd
nd
0
3.5
O
+1,1
D
HT-29
*
X
nd
MS2
0
∞
O
*
*
HCT-8
1.0
X
nd
nd
0
1.0
X
1.1
HCT-116
N
1.7
O
MS1
MS2
100
1.6
O
1.6
N
1Sequence a été analysé à l'aide des produits de PCR contenant le site de MS1 étendu qui a été montré à jouer un rôle important dans l'expression de l'ARNm MDR1. n.d., non détecté; * Hautement cytotoxique; ∞, une augmentation par rapport à l'expression de l'ARNm ne MDR1; D, a diminué; Un additif; S, synergique; N, non modifié
Figure 5 La quantification de l'analyse de la méthylation à base de PCR des lignées de cellules gastriques et le cancer du côlon. (A) sites CpG et Hpa II
/Msp I
sites dans la région du promoteur du MDR1 humain. En haut: Les sites CpG sont représentés par les barres verticales courtes. Les positions des exons 1 et 2 sont indiqués par des boîtes fermées. La position correspondant à ces fragments sont indiqués. Moyen: Hpa II
/Msp I
sites de reconnaissance sont représentés par de courtes barres verticales. En bas, des amorces de PCR utilisées dans l'analyse de la méthylation. (B) représentant l'état de méthylation du gène MDR1 de la région promotrice par une analyse de méthylation à base de PCR de quantification dans SNU-5 (gastrique) et HT-29 (côlon). 1: MN, Never-méthylé Hpa II
/Msp I
site à la région triosephosphate isomérase promoteur du gène (contrôle négatif) (240 pb); 2: MC, la paire d'amorces de contrôle positif (240 pb); 3: MS1, Hpa II
/Msp I
site 1 (121 pb); 4: MS2, Hpa II
/Msp I
site 2 (206 pb)
Effets de la 5-aza-2'-deoxcytidine (de 5AC) et /ou la trichostatine A (TSA) sur l'expression de. MDR1 ARNm dans des lignées cellulaires gastriques et cancer du côlon
l'inhibiteur 5AC ADN méthyltransférase et l'histone déacétylase (HDAC) TSA ont été bien connu pour soulager la répression génique épigénétique [22]. Cette étude a examiné l'effet de 5AC et /ou TSA sur l'expression de l'ARNm de la MDR1 dans les lignées de cancer de l'estomac et du côlon. Dans 10 gastrique et 9 cellules de cancer du côlon, l'expression de l'ARNm de la MDR1 a été déterminée par RT-PCR après leur traitement avec 2,5 uM 5AC pendant 96 heures et /ou 100 ng /ml de TSA pendant 48 heures. Une augmentation a été définie dans les cas montrant une augmentation de plus de 1,5 fois. Comme on le voit dans le tableau 1, le traitement a augmenté l'5AC MDR1 des niveaux d'ARNm dans les lignées cellulaires de cancer gastrique SNU-1, -5, -601, -620, -638 et -719, et dans le côlon HCT-116 lignée cellulaire de cancer (figures 6 et 7). Cependant, 5AC n'a pas induit l'expression de l'ARNm de la MDR1, même dans le SNU-16 et SNU-C5 et cellules HT-29 dont le gène MDR1
a été méthylée. Le traitement a augmenté la TSA MDR1 des niveaux d'ARNm dans le SNU-1, -16, -216, -601, -638, -668 et -719 lignées cellulaires de cancer gastrique et le SNU-C1, Colo320HSR, DLD-1, H29 et HCT-116 lignées cellulaires de cancer du côlon (figure 6 et 7). 5AC a montré une cytotoxicité élevée, seul ou en combinaison avec la TSA, en particulier dans les cellules HT-29. En outre, la TSA a montré une activité hautement cytotoxique seul ou en combinaison avec 5AC, en particulier dans les cellules SNU-620. Cette étude a également examiné les effets du traitement combiné de 5AC avec TSA, qui a augmenté le MDR1 de niveaux d'ARNm additive dans les cellules SNU-5 et -638, mais en synergie dans le SNU-16, -601, -668, -719 et les cellules SNU-C5 (voir le tableau 1). Figure 6 L'activation de l'expression de l'ARNm par la MDR1 5AC et /ou TSA dans les cellules cancéreuses gastriques. Le niveau d'expression est rapportée comme étant le rapport de la MDR1
/β-actine. L'ARN total a été isolé après traitement avec 2,5 uM 5AC pendant 96 heures et /ou 100 ng /ml de TSA pendant 48 heures. La RT-PCR a été réalisée en utilisant la même méthode rapportée dans la figure 1. La figure 7
L'activation de l'expression d'ARNm par MDR1 5AC et /ou TSA dans diverses lignées cellulaires de cancer du côlon. RT-PCR après traitement des cellules avec 5AC et /ou TSA en utilisant la même méthode décrite dans la figure 6. Le MDR1 /β-actine ratio
obtenu par PCR de 35 cycles après la TSA en combinaison avec 5AC, et seul dans SNU C5 et HT-29 exprimant l'ARNm de ne MDR1, respectivement, a été omis dans l'histogramme.
Ces résultats suggèrent que l'ARNm de l'expression de MDR1 est différentiellement régulée dans les cellules gastriques et le cancer du côlon par rapport à la mise sous silence des MDR1 de l'expression grâce à des mécanismes épigénétiques tels que la méthylation de l'ADN et /ou de discussion de
désacétylation des histones. dans cette étude, nous avons constaté que le MDR1 de niveaux d'ARNm dans les lignées cellulaires de cancer gastrique ont été nettement inférieurs à ceux dans les lignées cellulaires du cancer du côlon, bien qu'il y ait quelques différences. Ces résultats sont cohérents avec un rapport montrant que Pgp est fortement exprimé sur l'iléon et du côlon, à un niveau qui diminue progressivement proximalement dans le jéjunum, le duodénum et de l'estomac [8]. Etant donné que l'estomac et du côlon jouent un rôle majeur dans la digestion et l'absorption, respectivement, il est donc pas surprenant que les transporteurs tels que Pgp ont été exprimés de manière différentielle dans les deux tissus normaux. Notre conclusion que l'expression différentielle de MDR1 de l'ARNm dans des lignées cellulaires cancéreuses dérivées de l'estomac et du côlon est également compatible avec les rapports publiés [23-26]. Des études immunopathologiques ont révélé que l'expression Pgp sur les tumeurs humaines a été le plus souvent détecté dans le côlon, du rein, et les carcinomes surrénales, mais rarement dans les poumons et les carcinomes gastriques et certaines tumeurs des cellules germinales [27].
La connexion à trois voies entre méthylation de l'ADN, la chromatine la structure et l'expression du gène a été récemment passé en revue [28-30]. Une conséquence importante de méthylation de CpG est le silençage locale de l'expression génique, qui peut être médiée par l'intervention directe de la méthylation avec la liaison de divers facteurs de transcription. La principale composante de faire taire l'expression du gène semble être la liaison de la protéine méthyl-CpG liaison 2 (MeCP2), qui a une affinité pour méthyl-CpG [31, 32]. Déméthylation de l'ADN par 5AC provoque la libération de la MeCP2 à partir du promoteur qui active l'expression du gène de la transcription [10]. Il est connu que MeCP2 est enrichi sur le promoteur du gène MDR1 et est lié à son silençage [33]. 5AC modifie le modèle de méthylation du MDR
1 promoteur dans les cellules Pgp-négatives pour ressembler à celle des cellules Pgp positive et active le promoteur tel que MDR1 de l'ARNm est détectable [34].
Dans cette étude, l'état de méthylation a également été analysée afin de déterminer si le silençage du gène MDR1 est due à l'hyperméthylation de la région de promoteur.

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