meccanismi epigenetici coinvolti nell'espressione MDR1mRNA differenziale tra linee di cellule gastriche e cancro del colon e motivazioni per la chemioterapia clinica

meccanismi epigenetici coinvolti nella differenziale MDR1
espressione di mRNA tra linee di cellule gastriche e cancro del colon e motivazioni per la chemioterapia clinica
Abstract
sfondo
I trasportatori di membrana, come P-glicoproteina (Pgp), il MDR1
prodotto del gene, sono una delle cause di fallimento del trattamento nei pazienti affetti da cancro. In questo studio, i meccanismi epigenetici coinvolti nel differenziale MDR1
espressione di mRNA sono stati confrontati tra 10 gastrica e 9 linee di cellule di cancro del colon.
Metodi
I MDR1
livelli di mRNA sono stati determinati utilizzando PCR e real-time PCR dopo trascrizione inversa. La citotossicità è stata effettuata utilizzando il saggio MTT. stato di metilazione è stato esplorato da quantificazione PCR-based metilazione e bisolfito di sequenziamento del DNA analisi.
Risultati
I MDR1
livelli di mRNA ottenute per 35 cicli di RT-PCR in cellule di cancro gastrico erano solo paragonabili a quelli ottenuti da 22 cicli di RT-PCR in cellule tumorali del colon. Analisi in tempo reale RT-PCR ha rivelato che MDR1
mRNA non è stato rilevato nei 10 linee di cellule di cancro gastrico, ma MDR1
livelli di mRNA variabile a 7 di linee cellulari di cancro del colon 9 tranne il SNU-C5 e HT-29 cellule . saggio MTT ha mostrato che gli inibitori della Pgp come la ciclosporina A, verapamil e PSC833 sensibilizzati Colo320HSR (due punti, il più alto MDR1
espressione), ma non SNU-668 (gastrica, più alto) e SNU-C5 (gastrica, nessuna espressione) di paclitaxel. analisi della metilazione quantificazione PCR basato rivelato che il 90% delle cellule di cancro gastrico, e 33% delle cellule tumorali del colon erano metilato, che sono stati completamente abbinato con i risultati ottenuti con bisolfito analisi di sequenziamento del DNA. 5-aza-2'-deoxcytidine (5AC, un inibitore della DNA metiltransferasi) ha aumentato la MDR1
livelli di mRNA nel 60% delle cellule gastriche, e nel 11% delle cellule tumorali del colon. Trichostatin A (TSA, inibitore delle istone deacetilasi) ha aumentato la MDR1
livelli di mRNA nel 70% delle cellule di cancro gastrico e il 55% delle cellule tumorali del colon. Il trattamento combinato di 5AC con TSA ha aumentato il MDR1
livelli di mRNA additivo nel 20% delle cellule di cancro gastrico, ma sinergicamente nel 40% dei gastrica e l'11% delle cellule tumorali del colon.
Conclusione
Questi risultati indicano che il MDR1
livelli di mRNA in cellule di cancro gastrico sono significativamente inferiori a quelli nelle cellule tumorali del colon, che è almeno in parte, a causa di diversi regolamenti epigenetici come la metilazione del DNA e /o istone deacetilazione. Questi risultati possono fornire una migliore comprensione della efficacia della chemioterapia combinata così come la loro biodisponibilità orale.
Sfondo
gastrica e colon-retto sono una causa di morbilità e mortalità nel mondo di oggi. Se una resezione chirurgica curativa è impossibile, questi tipi di cancro rispondono molto male alla chemioterapia e conseguente prognosi infausta. In pazienti affetti da cancro gastrico, 5-fluorouracile (5-FU) chemioterapia di combinazione a base sono stati tentati al fine di migliorare i risultati del trattamento [1]. Con il cancro del colon-retto, 5-FU è stato il farmaco più utilizzato per più di 40 anni. Tuttavia, altri agenti come irinotecan o oxaliplatino sono stati utilizzati per migliorare l'efficacia antitumorale in combinazione con [2] 5-FU. 5-FU interferisce con la sintesi del DNA bloccando la produzione di pirimidina nucleotidi dTMP dal deposito durante de novo
sintesi del DNA attraverso l'inibizione della timidilato sintasi nonché attraverso l'incorporazione di fluoro-nucleotidi nel DNA e RNA [3].
P-glicoproteina (Pgp) codificata dal 1 (MDR1
) gene di multiresistenza ai farmaci è una pompa di efflusso rappresentante membrana ATP-binding cassette (ABC) trasportatori [4-6]. funzioni di PGP come pompe di efflusso energia-dipendente di una varietà di strutturalmente diversi agenti chemioterapici come la doxorubicina, vincristina, vinblastina, paclitaxel, colhicine, actinomicina D e mitomicina C [7], che possono diminuire il livello intracellulare di accumulo del farmaco. Come risultato, l'iperespressione di queste proteine ​​conferisce MDR alle cellule tumorali eludendo gli effetti citotossici di farmaci. Nel intestino umano, Pgp è fortemente espresso sulla superficie apicale delle cellule epiteliali superficiali colonnari di ileo e colon, e il suo livello di espressione diminuisce gradualmente prossimalmente nel digiuno, duodeno e dello stomaco [8]. Regolamento delle attività trascrizionale del MDR1
gene dipende da diverse proteine ​​trans-acting che legano il consenso cis-elementi [9]. L'accessibilità degli elementi promotori ai loro fattori di legame è regolamentato a livello di assemblaggio della cromatina. I livelli di entrambi metilazione del DNA e degli istoni deacetylation regolano MDR1
espressione genica [10-12]. Finora, la regolazione trascrizionale di MDR1
genica attraverso meccanismi epigenetici è stata riportata in espressione in cellule del cancro del colon [13-16], ma nessuno nelle cellule tumori gastrici. Inoltre, le relazioni tra l'espressione trascrizionale di MDR1
genica e meccanismi epigenetici in cellule di cancro gastrico e del colon non sono stati confrontati. Pertanto, non è chiaro il motivo per cui regimi chemioterapici sono stati diversamente utilizzato per il trattamento gastrica e tumori colorettali e perché MDR1
mRNA è espresso in modo differenziale in cellule di cancro gastrico e del colon-retto. Pertanto, questo studio ha esaminato se il livello di metilazione nel sito promotore del gene MDR1
è strettamente associato con MDR1
l'espressione genica in entrambe le cellule tumorali.
Metodi
cultura cellulare
le 10 linee di cellule di cancro gastrico umano (SNU-1, -5, -16, -216, -484, -601, -620, -638, -668 e -719) e linee cellulari di cancro del colon (9 SNU-C1, C4, C5, Colo320HSR, LoVo, DLD-1, HT-29, HCT-8 e HCT-116) sono stati ottenuti dal Centro di ricerca sul cancro presso la Seoul National University (Corea del Sud). Tutte le cellule sono state coltivate a 37 ° C in un CO 5% 2 atmosfera con RPMI 1640 medium (GibcoBRL, Gland Island, NY, USA) con il 10% di calore inattivato siero fetale bovino (Sigma, St. Louis, MO, STATI UNITI D'AMERICA). Le cellule sono state mantenute sia come sospensione o una cultura monostrato, e subcoltura fino a raggiungere confluenza.
Saggio di reversione trascrizione-polymerase chain reaction (RT-PCR)
L'RNA totale è stato estratto utilizzando MagExtractor ® per la MFX-2100 (Toyobo, Osaka, Giappone) sistema di purificazione dell'acido nucleico automatico, secondo le istruzioni del produttore. Il
MDR1 e beta-actina
trascritti di mRNA sono stati rilevati utilizzando il saggio RT-PCR. MDR1
espressione è stata rilevata con il 5 'e 3' primers corrispondente ai nucleotidi 907-930 (5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 ') e 1179-1201 (5'-TGCCAAG-ACCTCTTCAGCTACTG-3'), rispettivamente, la sequenza pubblicata cDNA [17], ottenendo un prodotto di 296 bp PCR. β-actina espressione
mRNA è stato usato come controllo per la quantità di RNA, ed è stata rilevata con il 5 'e 3' primers corrispondente ai nucleotidi 1912-1932 (5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 ') e 2392-2412 ( 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3 '), rispettivamente della sequenza pubblicata cDNA [18], ottenendo un prodotto di 501 bp PCR. L'RNA da ogni campione è stato trascritto inversa usando 200 unità di Moloney virus della leucemia murina trascrittasi inversa (Gibco-Bethesta Research Laboratory, Grand Island, NY, USA) e 0,18 mg /ml di oligo (dT 20) primer per 1 ora a 37 ° C. Il cDNA risultante delle cellule di cancro gastrico (2 volte diluito cDNA nelle cellule tumorali del colon) sono stati amplificati con 1,25 unità di Taq polimerasi (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 1 mM MgCl 2 e 10 pmoli di ciascun primer in un termociclatore (GeneAmp 2400, PE Applied Biosystems, Boston, mA, USA) per 22 cicli con le cellule del cancro del colon, ma 35 cicli con le cellule di cancro gastrico per MDR1
e 17 cicli per β-actina Immagini di denaturazione sequenziale (94 ° C per 30 s), ricottura (65 ° C per MDR1
, 53 ° C per β-actina
), e l'estensione (72 ° C per 30 s). Dopo il ciclo finale, tutti i prodotti di PCR sono stati sottoposti ad una estensione finale di 5 min a 72 ° C. Per la quantificazione, 3 pCi di [α- 32P] dCTP sono stati aggiunti a ciascuna miscela di reazione. Dopo la PCR, i prodotti di PCR sono stati combinati e poi ad elettroforesi su un gel denaturante di poliacrilammide al 7,5%. Le bande sono stati scansionati con un densitometro (Pdi, Huntington Station, NY, USA). L'importo di ciascuna mRNA trascritto era normalizzata con quella di ogni β-actina
mRNA.
L'estrazione di proteine ​​e analisi Western Blot
lisati cellulari totali sono stati preparati da lisi delle cellule raccolte in tampone di estrazione (1% NP-40 , 0,5% sodio desossicolato, 0,1% SDS in tampone fosfato salino) supplementato con 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (Sigma) e 10 ug /ml leupeptina (Sigma). DNA è stato tranciato mediante sonicazione e analisi Western blotting è stato eseguito utilizzando una leggera modifica del metodo prima descritto da Towbin et al. [19]. Le proteine ​​sono state trasferite su una membrana di nitrocellulosa da elettroblotting utilizzando una corrente di 60 V durante la notte. La membrana è stata incubata nel bloccare soluzione (5% latte scremato) per 1 ora a temperatura ambiente, lavato, e poi incubate con l'anticorpo policlonale di capra primario (1: 1000, Santa Cruz, Biotecnologia, CA, USA) per Pgp. La membrana è stato lavato e incubato con rafano anticorpo coniugato con perossidasi secondario (diluito 1: 1000) contro l'IgG per gli host di anticorpi primari per 1 ora. La membrana è stata poi macchiata con il reagente di rilevamento del kit di rilevazione ECL (Amersham, Piscataway, NJ, USA). Real-time PCR
Estrazione di mRNA è stata eseguita secondo il proctocol RNeasy (Qiagen, Hilden, Germania ). Un microgrammo di RNA totale è stato inversamente trascritto in cDNA in un volume di 20 ml con 200 unità di Moloney virus della leucemia murina trascrittasi (Gibco-Bethesta Research Laboratory, Grand Island, NY, USA) inversa e 0,18 mg /oligo ml (dT 20) primer (Promega, Madison, USA) in base al manuale del produttore. Real-time PCR è stata eseguita con il Cycler 2.0 strumento Luce (Roche, Mannheim, Germania) utilizzando la Fast Start DNA Maestro SYBR Green I kit (Roche). Per la verifica del prodotto di amplificazione corretta, PCR sono stati analizzati su un gel di agarosio al 2% colorato con bromuro di etidio. Le sequenze dei primer sono le seguenti: per β-actina
, 5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 'e 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3'; per MDR1
, 5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 'e 5'-TGCCAAGACCTCTTCAGCTACTG-3'. Ogni reazione (20 ml) contiene 4 ml di cDNA (diluizione 10 volte), 4 mM MgCl 2, 10 pmoli di ciascun primer e 2 ml di Fast Start DNA Maestro SYGR Green I Mix contenente tampone, dNTP, SYBR colorante verde e Tag polimerasi. La procedura di amplificazione di geni bersaglio è la seguente: pre-denaturazione a 95 ° C per 10 minuti, 40 cicli di denaturazione a 95 ° C per 15 sec, ricottura per MDR1
a 67 ° C (β-actina
a 55 ° C) per 5 secondi, e estensione a 72 ° C per 7 secondi (β-actina
per 21 sec). Melting analisi della curva è stata effettuata per confermare la produzione di un singolo prodotto. I controlli negativi senza modello sono stati prodotti per ogni corsa. valori di espressione genica (livelli relativi di mRNA) sono espressi come rapporti (differenza tra i valori Ct = Il punto sulla curva in cui la quantità di fluorescenza comincia ad aumentare rapidamente, solitamente alcune deviazioni standard al di sopra della linea di base, viene definito il ciclo soglia ( valore Ct).) tra il gene di interesse (MDR1
mRNA) e un gene di riferimento interna (β-actina
mRNA) che forniscono un fattore di normalizzazione per la quantità di RNA isolato da un campione. L'analisi dei dati è stata effettuata utilizzando software Light Cycler versione 4.0 (Roche). Test
citotossicità mediante saggio MTT
Il vitro
citotossicità in dei farmaci è stata misurata utilizzando un saggio MTT, come descritto altrove [20]. Le cellule sono state seminate a 2 × 10 4cells /ml e incubate durante la notte per consentire fissaggio e stabilizzazione. Le cellule sono state incubate a 37 ° C per 3 giorni, e MTT [3- (4,5-dimetiltiazolo-2-il) -2,5-difenil tetrazolio bromide, Sigma] soluzione è stata quindi aggiunti a ciascun pozzetto contenente le cellule. Dopo aver agitato per 1 min, la piastra è stata incubata per 5 ore. cristalli formazano della coltura in sospensione sono stati sciolti in 150 ml di dimetilsolfossido (DMSO) dopo aver rimosso il supernatante. La densità ottica dei pozzetti è stata misurata con un lettore di micropiastre (μQuant, Bio-Tek Instruments Inc., Winooski, VT, USA) a 540 nm
. Analisi della metilazione quantificazione PCR-based
Cinque microgrammi di DNA genomico è stato digerito con 50 U di Msp
I o II Hpa
(Fermentas MBI, Vilnius, Lituania) a 37 ° C per 16 ore, aggiunto a un 1/15 di volume di 0,6 M Tris (pH 7.5) e 1.5 M NaCl, e digerito con 50 U di Pst
I (New England Biolabs, MA, USA) a 37 ° C per 8 ore. Lo stato di metilazione del MDR1
regione del promotore 5'CpG è stata esaminata analizzando 100 ng DNA restrizione digerito mediante PCR in 25 microlitri reazioni contenenti 1,25 unità di Taq DNA polimerasi e 10 pmoli di ciascun primer. L'analisi di metilazione quantificazione PCR-based è stata effettuata secondo il metodo riportato in precedenza [11]. I primer PCR utilizzati sono stati 5'-TCTAGAGAGGTGCAACGGAAG-3 'e 5'-TCAGCCTCACCACAGATGAC-3' per i primer MS1 metilazione-sensibili (121 bp), 5'-TGAAGTCCTCTGGCAAGTCC-3 'e 5'-ATTCTCCCTCCCGGTTCC-3' per il MS2 metilazione-sensibile primer (206 bp), 5'-ATTTCACGTCTTGGTGGCC-3 'e 5'-TCCAGTGCCACTACGGTTT-G-3'for i primer di controllo positivo MC (240 bp), e 5'-GGCGAAGGAGGT-TGTCTATTC-3' e 5 ' -AACGTTCTAGGAGAGTCGGG-3 'per MN primer di controllo negativo (240 bp) derivati ​​dalla regione promotore del gene triosephosphate isomerasi. Amplification è stata eseguita in un termociclatore DNA per 35 cicli per i primer MN, MC, MS1 e MS2 coinvolgono in sequenza denaturazione (95 ° C per 30 s), ricottura (60 ° C per 30 s), e l'estensione (72 ° C per 30 s). Dopo il ciclo finale, tutti i prodotti di PCR sono stati sottoposti ad una estensione finale per 5 min a 72 ° C. I prodotti di PCR sono stati separati mediante elettroforesi su gel 7% PAGE. I gel sono stati poi colorati con bromuro di etidio e fotografati utilizzando una stazione di immagine Kodak 4000 mm (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA).
Bisolfito analisi del sequenziamento del DNA
Uno mg di DNA genomico è stato chimicamente modificato da sodio bisolfito utilizzando il kit EZ metilazione del DNA (Zymo Research, Orange, CA, USA) per convertire cytosines non metilato per uracils lasciando inalterata cytosines denaturato. Il DNA bisolfito-modificato è stato utilizzato per l'amplificazione PCR. Estesa Primer MS1 contiene 10 siti CpG, e 2 SP-1 siti che sono obbligatori per il funzionale MDR1
promotore da attivare [21]. Le sequenze di primer per l'amplificazione dei fili bisolfito trattati (223 bp) sono stati i seguenti: S: 5'-GGAAGTTAGAATATTTTTTTTGGAAAT-3 '; AS: 5'-ACCTCTACTTCTTTAAACTTAAAAAAACC-3 '. Amplification è stata eseguita nelle stesse condizioni di PCR eccetto 48 ° C temperatura di ricottura e 45 cicli di PCR. Dopo il ciclo finale, tutti i prodotti di PCR sono stati sottoposti ad una estensione finale a 72 ° C per 5 min. Sequenza dei prodotti di PCR è stato analizzato utilizzando un sequenziatore automatico (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)
. Analisi statistica
I risultati sono presentati come media ± SE ei dati sono stati analizzati utilizzando il test t di Student
. valori e lt P; 0.05 sono stati considerati significativi.
Risultati
confronto dei profili di espressione di mRNA MDR1 in gastriche e cancro del colon cellule
MDR1
espressione di mRNA è stato analizzato utilizzando il saggio RT-PCR con il livello di espressione di essere normalizzata con la beta-actina
livelli di mRNA ottenuti dopo 17 cicli di PCR. Il MDR1
mRNA non è stato rilevato dopo 22 cicli di PCR in 10 linee di cellule di cancro gastrico ma potrebbe essere rilevato a livelli variabili dopo 35 cicli di PCR con l'eccezione di SNU-16, suggerendo un livello significativamente basso di MDR1
espressione mRNA nelle cellule di cancro gastrico testati (Figura 1). Come mostrato in figura 1, l'ordine di classificazione secondo il MDR1-β-actina rapporto
nelle linee di cellule di cancro gastrico è la seguente: SNU-668 (1.51) > SNU-484 (1.37) > SNU-5 (0.63) > SNU-601 (0,33) > SNU-719 (0,32) > SNU-216 (0,29) > SNU-638 (0,07) > SNU-1 (0.04) > SNU-16 (0). Delle linee cellulari di cancro del colon 9, variabile MDR1
livelli di mRNA potrebbe essere rilevato in linee cellulari di cancro del colon 7 dopo 22 cicli di PCR, ma non nel SNU-C5 e HT-29 cellule. Il MDR1
mRNA delle ultime due cellule potrebbero non essere rilevati anche dopo 35 cicli di PCR. Questi risultati suggeriscono un livello relativamente alto di MDR1
espressione di mRNA, nonostante alcune eccezioni nelle cellule tumorali del colon. Come mostrato in figura 2, l'ordine di classificazione secondo il MDR1
/β-actina rapporto
nelle linee cellulari di cancro del colon è il seguente: Colo320HSR (0.90) > SNU-C4 (0,45) > HCT-8 (0,26) > SNU-C1 (0,12) > HCT-116 (0,11) > LoVo (0,10) > DLD-1 (0,07) > SNU-C5 (0) = HT-29 (0). Figura 1 MDR1 mRNA espressione in linee cellulari di cancro gastrico. Il livello di MDR1
mRNA è stata determinata mediante RT-PCR, e normalizzato da quello di mRNA β-actina
, che è stato utilizzato come controllo per l'RNA. Il cDNA retrotrascritto da mRNA è stato amplificato separatamente con ogni coppia di primer per MDR1
e beta-actina
geni. Aliquote di ciascuna miscela di reazione PCR sono stati separati su gel di poliacrilamide al 7%. Il gel è stato essiccato ed esposto su pellicola a raggi X durante la notte.
Figura 2 MDR1 mRNA espressione nelle linee di cellule di cancro al colon. La stessa metodologia riportata in figura 1 è stato usato.
Abbiamo eseguito nuovamente il real-time RT-PCR per la validazione quantitativa di MDR1
livelli di mRNA ottenute da saggio RT-PCR. Il MDR1
mRNA non è stato rilevato nei 10 linee di cellule di cancro gastrico. Tuttavia, le linee cellulari di cancro del colon 9, variabile MDR1
livelli di mRNA potrebbe essere rilevato in 7 colon linee cellulari di cancro, ad eccezione del SNU-C5 e HT-29 cellule, come i dati di RT-PCR (Figura 3). Figura espressione 3 MDR1 mRNA nelle linee di cellule gastriche e cancro del colon. Il livello di MDR1
espressione di mRNA è stato determinato mediante real-time RT-PCR, e normalizzato da quello di mRNA β-actina
, che è stato utilizzato come controllo per l'RNA. Il cDNA retrotrascritto da mRNA è stato amplificato separatamente con ogni coppia di primer per MDR1
e beta-actina
geni.
Nel loro insieme, il MDR1
livelli di mRNA nelle linee di cellule di cancro gastrico erano significativamente inferiori a quelli nelle linee di cellule di cancro al colon.
effetti Chemosensitizing degli inibitori della Pgp in cellule di cancro gastrico e del colon
Anche se i livelli di proteine ​​non sono stati esaminati in questo studio, studi funzionali sono stati eseguiti utilizzando gli inibitori PGP gastrici e il cancro del colon linee cellulari che esprimono il più alto livello di MDR1
espressione di mRNA. Come illustrato nella figura 4A, le cellule Colo320HSR (colon, p53 mutante, massima espressione della MDR1
mRNA) erano 14 volte e > 200 volte resistenti al paclitaxel rispetto al SNU-C5 e SNU-668 cellule (gastrico, p53 mutante, massima espressione della MDR1
mRNA) in confronto sulla base della IC 50 valori rispettivamente, che rappresenta una differenza significativa nei livelli PGP. Inoltre, la resistenza delle cellule Colo320HSR a paclitaxel è stato invertito inibitori Pgp inclusi ciclosporina A, verapamil, e PSC833 (Figura 4B). Tuttavia, questa inversione non è stato osservato nel SNU-C5 (colon, senza MDR1
mRNA) cellule così come SNU-668. Ciò suggerisce che Pgp espresso nelle cellule tumorali del colon, ma non le cellule di cancro gastrico funziona in modo funzionale e può essere inibita da inibitori PGP. Figura 4 Confronto di espressione e la funzione Pgp in linee cellulari gastriche e cancro del colon. (A) sensibilità comparativa di Colo320HSR (due punti, il più alto), SNU-668 (gastrica, più alto) e SNU-C5 (due punti, nessuna espressione) di paclitaxel; (B) effetti degli inibitori Pgp sulla sensibilità di Colo320HSR, SNU-668 e SNU-C5 al paclitaxel (concentrazione IC10, 50 micron, 0,3 Nm e 0,5 Nm, rispettivamente). La sensibilità al paclitaxel è stata determinata mediante saggio MTT in presenza o assenza di inibitori Pgp (ciclosporina A, verapamil e PSC833 di 0,8 mM ciascuno). *, P. ≪ 0,05 rispetto al controllo
Confronto di stato di metilazione di MDR1 in cellule di cancro gastrico e del colon
Lo stato di metilazione è stata determinata mediante l'analisi della metilazione quantificazione PCR-based per un CpG-ricca dominio essere di circa 1 Kb contenente esone 1 e introne 1 tra il MDR1
promotore. Per determinare il grado di metilazione del MDR1
regione promotore del gene, due primer (MS1 e MS2) contenenti l'Msp
I /Hpa
siti II sono stati progettati da esone 1 e introne 1, rispettivamente. La coppia di primer MC è stato usato come controllo positivo per determinare la qualità del DNA genomico di origine. Al contrario, il MN che attraversa il Msp
I /Hpa sito
II nella regione del promotore del gene trioso fosfato isomerasi e non viene mai metilato è stato utilizzato come controllo negativo. Figura 5B mostra le immagini di analisi della metilazione tipico quantificazione basati sulla PCR del HT-29 cellule (due punti) SNU-5 (gastrico) e. L'analisi della metilazione quantificazione PCR-based ha rivelato che tutti i prodotti di PCR per l'MS1 e MS2 non sono stati prodotti dal Pst
1 digerito DNA genomico trattato con Msp
I (enzima metilazione-insensitive). D'altra parte, i prodotti di PCR sia MS1 e MS2 nelle SNU-5 cellule, ma un prodotto di PCR per la MS1, solo le HT-29 cellule sono stati ottenuti dopo
Hpa II trattamento (enzima metilazione-sensitive), indicando metilazione di CpG nei siti MS1 e MS2 nei SNU-5 celle e solo nel sito MS2 nelle cellule HT-29. Come riassunto in Tabella 1, metilazione è stata rilevata nei siti MS1 e MS2 delle 9 linee di cellule di cancro gastrico con l'eccezione di SNU-484 ma 2 (SNU-C5 e HCT-116) delle linee cellulari di cancro del colon 9. D'altro canto, le cellule HT-29 sono stati metilati solo nel sito MS2. Il SNU-C5, HT-29 (due punti) e SNU-16 (gastrico) cellule non esprimono MDR1
mRNA sono stati metilato. Bisolfito analisi del sequenziamento del DNA è stata eseguita per confermare la metilazione. metilazione analysis.Table Come esposizione in Tabella 1, grado di metilazione (%) di 10 siti CpG sul sito MS1 consumato completamente abbinati con i risultati ottenuti con quantificazione PCR basato-1 stato di metilazione e gli effetti di 5AC e /o TSA su MDR1
espressione di mRNA e in varie linee gastrici e del colon cellule




saggio di metilazione del DNA




tessuto
linea cellulare
5AC
enzima di restrizione
bisolfito di sodio
TSA

5AC + TSA


Fold
effetto Il portale
Grado (%)1

Fold

Effect

Fold

Effect

Gastric
SNU-1
32.6
O
MS1
MS2
100
20.7
O
+23.6
D
SNU-5
5.8
O
MS1 MS2

100

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