mecanismos epigenéticos envolvidos na expressão MDR1mRNA diferencial entre linhas de células gástricas e cancro do cólon e justificativas para chemotherapy

clínica mecanismos epigenéticos envolvidos no diferencial MDR1
expressão de mRNA entre linhas de células gástricas e cancro do cólon e justificativas para a quimioterapia clínica da arte abstracta
Fundo
os transportadores de membrana, como a P-glicoproteína (PGP), o MDR1
produto do gene, são uma das causas de falha do tratamento em pacientes com câncer. Neste estudo, os mecanismos envolvidos na epigenética diferencial MDR1
expressão de ARNm foram comparados entre 10 gástrica e 9 linhas de células de cancro do cólon.
Métodos
Os MDR1
níveis de ARNm foram determinados utilizando PCR e em tempo real Os ensaios de PCR após a transcrição reversa. A citotoxicidade foi realizada utilizando o ensaio de MTT. estado de metilação foi explorada por quantificação por PCR à base de metilação e a sequenciação de ADN com bissulfito análises.

Resultados Os níveis de ARNm de MDR1
obtidos por 35 ciclos de RT-PCR em células de cancro gástrico foram apenas comparáveis ​​aos obtidos por 22 ciclos de RT-PCR em células cancerígenas do cólon. A análise em tempo real de RT-PCR revelou que MDR1
ARNm não foi detectada nas 10 linhas celulares de cancro gástrico, mas os níveis de mRNA MDR1
variáveis ​​em 7 de 9 linhas de células de cancro do cólon, excepto o SNU-C5 e células HT-29 . ensaio MTT mostraram que os inibidores de Pgp, tais como ciclosporina A, o verapamil e PSC833 sensibilizados Colo320HSR (cólon, a expressão mais elevada MDR1
) mas não SNU-668 (gástrico, mais alto) e SNU-C5 (gástrico, nenhuma expressão) para o paclitaxel. a análise de metilação com base em PCR de quantificação revelou que 90% das células de cancro gástrico, e 33% de células de cancro do cólon foram metilados, que foram completamente comparados com os resultados obtidos por análise de sequenciação de ADN com bissulfito. 5-aza-2'-deoxcytidine (5AC, um inibidor da DNA metiltransferase) aumentou a MDR1
níveis de mRNA em 60% de células gástricas, e em 11% das células de cancro do cólon. Tricostatina A (TSA, inibidor da desacetilase de histona) aumentou a MDR1
níveis de mRNA em 70% das células de cancro gástrico e 55% de células cancerígenas do cólon. O tratamento combinado de 5AC com TSA aumentou a MDR1
níveis de ARNm de forma aditiva em 20% das células de cancro gástrico, mas sinergicamente em 40% de gástrica e 11% de células cancerígenas do cólon.

Conclusão Estes resultados indicam que o MDR1
níveis de mRNA em células de cancro gástrico são significativamente mais baixos do que aqueles em células de cancro do cólon, que é, pelo menos, em parte devido aos diferentes regulamentos epigenética, tais como a metilação do DNA e /ou desacetilação da histona. Estes resultados podem proporcionar uma melhor compreensão da eficácia da quimioterapia combinada, bem como a sua biodisponibilidade oral.

Fundo gástrico e colo-rectal são uma causa de morbidade e mortalidade no mundo de hoje. Se uma ressecção cirúrgica curativa é impossível, estes cancros respondem muito mal à quimioterapia e resultando em um mau prognóstico. Em doentes com cancro gástrico, 5-fluorouracilo (5-FU) combinação de quimioterapia com base foram tentadas a fim de melhorar os resultados do tratamento [1]. Com câncer colorretal, 5-FU tem sido a droga mais usada por mais de 40 anos. No entanto, outros agentes, tais como irinotecano ou oxaliplatina têm sido utilizados para melhorar a eficácia anti-tumor em combinação com [2] 5-FU. 5-FU interfere com a síntese de ADN por bloqueio da produção de nucleótido de pirimidina dTMP a partir de dUMP Novo durante a síntese de ADN de
através da inibição da timidilato-sintase, assim como, através da incorporação de fluoro-nucleótidos no ADN e ARN [3].
P-glicoproteína (PGP) codificada pelo gene 1 (MDR1
) resistência a múltiplos fármacos é uma bomba de efluxo de membrana representativo da cassete (ABC) de ligação a ATP transportadores [4-6]. funções de Pgp como bombas de efluxo dependentes de energia de uma variedade de agentes quimioterapêuticos estruturalmente diversos, tais como doxorrubicina, vincristina, vinblastina, paclitaxel, colhicine, actinomicina D e mitomicina C [7], que podem diminuir o nível intracelular de acumulação do fármaco. Como resultado, a sobre-expressão destas proteínas MDR confere às células cancerosas por subtrair os efeitos citotóxicos de drogas. No intestino humano, Pgp é fortemente expresso na superfície apical das células epiteliais colunares superficiais do íleo e do cólon, e do seu nível de expressão diminui gradualmente para o jejuno proximal, duodeno e do estômago [8]. A regulação da actividade de transcrição do gene MDR1
é dependente de várias proteínas que actuam em trans que ligam os elementos cis de consenso [9]. A acessibilidade dos elementos promotores para os seus factores de ligação é regulado ao nível da montagem da cromatina. Os níveis de tanto a metilação do DNA e a desacetilação da histona regular a expressão do gene MDR1
[10-12]. Até agora, a regulação da transcrição da expressão do gene MDR1
através de mecanismos epigenética tem sido relatada em expressão em células de cancro do cólon [13-16], mas nenhum em células de cancros gástricos. Além disso, as relações entre a expressão transcricional de MDR1
a expressão do gene e de mecanismos epigenética em células de cancro gástrico e cancro do cólon não foram comparadas. Portanto, não está claro porque regimes de quimioterapia têm sido diferente usado para tratar gástrica e colorretal e por MDR1
mRNA é expresso diferencialmente em células de câncer gástrico e colorretal. Portanto, este estudo examinou se ou não o grau de metilação no local promotor de gene MDR1 a
está intimamente associado com a expressão do gene MDR1
tanto em células cancerosas.
Métodos
cultura celular
as 10 linhas humanas gástricas celulares de cancro (SNU-1, -5, -16, -216, -484, -601, -620, -638, -668 e -719) e linhas celulares de cancro do cólon 9 (SNU-C1, C4, C5, Colo320HSR, LoVo, DLD-1, HT-29, HCT-8 e HCT-116) foram obtidos a partir do Centro de Pesquisa do Câncer da Universidade Nacional de Seul (Coreia do Sul). Todas as células foram cultivadas a 37 ° C num CO 5% 2 atmosfera, utilizando meio RPMI 1640 (GibcoBRL, Glândula Island, NY, EUA) com 10% de soro de bovino fetal inactivado (Sigma, St. Louis, MO, EUA). As células foram mantidas quer como uma suspensão ou uma cultura em monocamada, e subcultivadas até atingirem confluência.
Teste de reversão da reacção de cadeia de polimerase (RT-PCR)
O ARN total foi extraído utilizando MagExtractor ® para MFX-2100 (Toyobo, Osaka, Japão) sistema de purificação de ácido nucleico de auto-, de acordo com as instruções do fabricante. O
MDR1 e transcritos de ARNm
p-actina foram detectadas usando o ensaio de RT-PCR. MDR1
expressão foi detectada com o 5 'e 3' iniciadores correspondendo aos nucleótidos 907-930 (5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 ') e 1179-1201 (5'-TGCCAAG-ACCTCTTCAGCTACTG-3'), respectivamente, de a sequência de ADNc publicada [17], obtendo-se um produto de PCR de 296 pb. β-actina expressão
ARNm foi utilizado como um controlo para a quantidade de ARN, e foi detectado com o 5 'e 3' iniciadores correspondendo aos nucleótidos 1912-1932 (5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 ') e 2392-2412 ( 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3 '), respectivamente, da sequência publicada de ADNc [18], obtendo-se um produto de PCR de 501 pb. O ARN de cada amostra foi transcrito de forma reversa, utilizando 200 unidades de Moloney vírus da leucemia murina de transcriptase reversa (Laboratório Gibco-Bethesta Research, Grand Island, NY, EUA) e 0,18 ug /ml de oligo (dT 20) iniciador durante 1 hora a 37 ° C. O ADNc resultante das células de cancro gástrico (2 vezes diluída cADN nas células do cancro do cólon) foram amplificados com 1,25 unidades de Taq polimerase (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), MgCl 1 mM de 2 e 10 pmol de cada iniciador num termociclador (GeneAmp 2400, PE Applied Biosystems, Boston, MA, EUA) durante 22 ciclos, com as células cancerígenas do cólon, mas 35 ciclos com as células de cancro gástrico para MDR1
e 17 ciclos para β-actina
da desnaturação sequencial (94 ° C durante 30 s), emparelhamento (65 ° C durante MDR1
, 53 ° C durante β-actina
) e extensão (72 ° C durante 30 s). Após o ciclo final, todos os produtos de PCR foram sujeitos a uma extensão final de 5 min a 72 ° C. Para quantificação, 3 uCi de [α- 32P] dCTP foram adicionadas a cada mistura reaccional. Após PCR, os produtos de PCR foram combinados e, em seguida, a electroforese num gel não desnaturante de poliacrilamida a 7,5%. As bandas foram escaneados com um densitômetro (PDI, Huntington Station, Nova Iorque, EUA). A quantidade de cada um transcrito de ARNm que foi normalizado com de cada ARNm
β-actina. Extracção de proteínas
e análise de Western blot
lisados ​​celulares totais foram preparado por lise de células colhidas em tampão de extracção (1% de NP-40 , 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS em solução salina tamponada com fosfato) suplementado com fluoreto de fenilmetilsulfonilo 2 mM (Sigma) e 10 ug /ml de leupeptina (Sigma). O DNA foi cisalhado por sonicação e a análise Western blot foi efectuada utilizando uma ligeira modificação do método descrito pela primeira vez por Towbin et ai. [19]. As proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose por electrotransferência usando uma corrente de 60 V durante a noite. A membrana foi incubada em solução de (5% de leite desnatado) de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente, lavou-se, e depois incubadas com anticorpo policlonal de cabra primário (1: 1000, Santa Cruz, Biotechnology, CA, EUA) para a Pgp. A membrana foi lavada e incubada com anticorpo conjugado com peroxidase de rábano-secundário (diluído 1: 1000) contra cada IgG para hospedeiros de anticorpos primários para 1 hr. A membrana foi, em seguida, coradas utilizando o reagente de detecção do kit de detecção ECL (Amersham, Piscataway, NJ, EUA).
-PCR em tempo real
Extracção do ARNm foi efectuada de acordo com o proctocol RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemanha ). Um micrograma de ARN total foi reversamente transcrito em ADNc, num volume de 20 ul com 200 unidades de Moloney vírus da leucemia murina de transcriptase (Gibco-Bethesta Research Laboratory, Grand Island, NY, EUA) inversa e 0,18 ug /ml de oligo (dT 20) primers (Promega, Madison, EUA) de acordo com o manual do fabricante. PCR em tempo real foi realizado com a luz Cycler 2.0 Instrumento (Roche, Mannheim, Alemanha) usando o Fast Start DNA mestre SYBR Green I Kit (Roche). Para a verificação do produto de amplificação correcta, os PCRs foram analisados ​​num gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio. As sequências dos iniciadores são como se segue: para β-actina
, 5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 'e 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3'; para MDR1
, 5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 'e 5'-TGCCAAGACCTCTTCAGCTACTG-3'. Cada reacção (20 ul) continha quatro ADNc ul (diluição de 10 vezes), MgCl 4 mM de 2, 10 pmol de cada iniciador e 2 ul de Iniciar ADN rápida mestre Mix I verde SYGR contendo tampão, dNTPs, SYBR corante verde e polimerase Tag. O procedimento de amplificação de genes alvo foi a seguinte: pré-desnaturação a 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 15 seg, emparelhamento durante MDR1
a 67 ° C (β-actina
a 55 ° C) durante 5 segundos, e extensão a 72 ° C durante 7 seg (β-actina Compra de 21 seg). Derreter análise da curva foi realizada para confirmar a produção de um único produto. Os controlos negativos sem modelo foram produzidos para cada execução. valores de expressão de genes (níveis de ARNm relativos) são expressos como razões (diferença entre os valores de Ct = O ponto da curva em que a quantidade de fluorescência começa a aumentar rapidamente, normalmente alguns desvios padrão acima da linha de base, é denominado o ciclo limiar ( valor de Ct).) entre o gene de interesse (MDR1
ARNm) e um gene de referência interna (β-actina
ARNm) que proporcionam um factor de normalização para a quantidade de RNA isolado a partir de um espécime. A análise dos dados foi realizada usando software de Luz Cycler versão 4.0 (Roche).
Teste de citotoxicidade utilizando um ensaio MTT of the in vitro
citotoxicidade das drogas foi medida utilizando um ensaio de MTT, tal como descrito noutro local [20]. As células foram semeadas a uma 2 × 10 4cells /ml e incubou-se durante a noite para permitir a fixação e estabilização. As células foram incubadas a 37 ° C durante 3 dias, e [brometo de tetrazólio 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil, Sigma] MTT solução foi então adicionada a cada poço contendo as células. Depois de se agitar durante 1 minuto, a placa foi incubada durante 5 h. cristais de formazano da cultura em suspensão foram dissolvidos em 150 ul de dimetilsulfóxido (DMSO) após remoção do sobrenadante. A densidade óptica dos poços foi medida com um leitor de microplacas (μQuant, Bio-Tek Instruments Inc., Winooski, VT, EUA) a 540 nm.
Análise de metilação com base em PCR Quantificação
Cinco microgramas de ADN genómico foi digerido com 50 U de
Msp I ou Hpa II
(MBI Fermentas, Vilnius) a 37 ° C durante 16 horas, adicionada a um volume de 0,6 M Tris (pH 7,5) e 1,5 1/15 M de NaCl, e digerido com 50 U de PstI
I (New England Biolabs, MA, EUA) a 37 ° C durante 8 horas. O estado de metilação da região promotora MDR1
5'CpG foi examinada por meio da análise de ADN digerido por restrição de 100 ng por PCR em reacções de 25 ul contendo 1,25 unidades de polimerase de ADN de Taq e 10 pmol de cada iniciador. A análise de metilação com base em PCR de quantificação foi realizado de acordo com o método descrito anteriormente [11]. Os iniciadores de PCR utilizados foram 5'-TCTAGAGAGGTGCAACGGAAG-3 'e 5'-TCAGCCTCACCACAGATGAC-3' para os iniciadores MS1 sensíveis à metilação (121 pb), 5'-TGAAGTCCTCTGGCAAGTCC-3 'e 5'-ATTCTCCCTCCCGGTTCC-3' para a MS2 iniciadores sensíveis à metilação (206 pb), '5'-TCCAGTGCCACTACGGTTT-G-3'for os iniciadores de controlo positivo MC (240 pb) e, e 5'-GGCGAAGGAGGT-TGTCTATTC-3' 5'-ATTTCACGTCTTGGTGGCC-3 e 5 ' -AACGTTCTAGGAGAGTCGGG-3 'para MN iniciadores de controlo negativo (240 pb) derivados da região promotora do gene da triosefosfato isomerase. A amplificação foi realizada em um termociclador de ADN durante 35 ciclos para os iniciadores de MN, MC, MS1 e MS2 envolvendo em desnaturação sequência (95 ° C durante 30 s), emparelhamento (60 ° C durante 30 s) e extensão (72 ° C durante 30 s). Após o ciclo final, todos os produtos de PCR foram sujeitos a uma extensão final durante 5 min a 72 ° C. Os produtos de PCR foram separados por electroforese em géis de PAGE a 7%. Os geles foram em seguida corados com brometo de etídio, e fotografados utilizando um Kodak Image Station 4000 mM (Eastman Kodak, Rochester, NY, EUA).
Análise de sequenciação de ADN Bissulfito
Um ug de ADN genómico foi quimicamente modificado por sódio bissulfito utilizando o kit EZ Metilação de DNA (Zymo Research, Orange, CA, EUA) para converter citosinas não metiladas em uracilos, enquanto as citosinas metiladas deixando inalterada. O ADN modificado com bissulfito foi utilizado para amplificação por PCR. Extensão de primer MS1 contém 10 locais de CpG, e 2 SP-1 sites, que são obrigatórios para o MDR1 funcional
promotor para ser ativado [21]. As sequências iniciadoras para amplificação dos fios tratados com bissulfito (223 pb) foram os seguintes: S: 5'-GGAAGTTAGAATATTTTTTTTGGAAAT-3 '; AS: 5'-ACCTCTACTTCTTTAAACTTAAAAAAACC-3 '. A amplificação foi realizada nas mesmas condições de PCR, excepto a 48 ° C de temperatura de recozimento e 45 ciclos de PCR. Após o ciclo final, todos os produtos de PCR foram sujeitos a uma extensão final a 72 ° C durante 5 min. Sequência de produtos de PCR foram analisados ​​utilizando um sequenciador automatizado (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Análise Estatística

Os resultados são apresentados como uma média ± SE e os dados foram analisados ​​utilizando o teste t de Student
. valores < P 0,05 foram considerados significativos.
Resultados
Comparação de perfis de expressão de mRNA MDR1 em células gástricas e câncer de cólon
MDR1
expressão de mRNA foi analisada utilizando o ensaio de RT-PCR com o nível de expressão de ser normalizada com o p-actina níveis de mRNA
obtido após 17 ciclos de PCR. O MDR1
ARNm não foi detectada após 22 ciclos de PCR nas 10 linhas celulares de cancro gástrico, mas poderiam ser detectados em níveis variáveis ​​após 35 ciclos de PCR com a excepção de SNU-16, sugerindo um nível significativamente baixo de MDR1
expressão de ARNm em células do cancro gástrico testados (Figura 1). Como mostrado na Figura 1, a ordem de classificação de acordo com a relação
-MDR1-β actina nas linhas celulares de cancro gástrico é como se segue: SNU-668 (1,51) > SNU-484 (1,37) > SNU-5 (0,63) > SNU-601 (0,33) > SNU-719 (0,32) > SNU-216 (0,29) > SNU-638 (0,07) > SNU-1 (0,04) > SNU-16 (0). Das nove linhas celulares de cancro do cólon, variável MDR1
níveis de ARNm pode ser detectado em linhas celulares de cancro do cólon 7 após 22 ciclos de PCR, mas não no SNU-C5 e células HT-29. O MDR1
ARNm das duas últimas células pode não ser detectada mesmo depois de 35 ciclos de PCR. Estes resultados sugerem um nível relativamente elevado de expressão de ARNm de MDR1
apesar de algumas excepções em que as células de cancro do cólon. Como mostrado na Figura 2, a ordem de classificação de acordo com o MDR1
/rácio
β-actina nas linhas celulares do cancro do cólon é como se segue: Colo320HSR (0,90) > SNU-C4 (0,45) > HCT-8 (0,26) > SNU-C1 (0,12) > HCT-116 (0,11) > LoVo (0,10) > DLD-1 (0,07) > SNU-C5 (0) = HT-29 (0). Figura 1 a expressão de ARNm de MDR1 em linhas celulares de cancro gástrico. O nível de expressão de ARNm de MDR1
foi determinada por RT-PCR, e normalizada pelo que de β-actina
ARNm, o qual foi utilizado como um controlo para o RNA. O ADNc reversamente transcrito a partir do ARNm foi amplificado separadamente com cada par de iniciadores para MDR1
e os genes de p-actina. Alíquotas de cada mistura reaccional de PCR foram separados em gel de poliacrilamida a 7%. O gel foi seco e exposto a filme de raios-X durante a noite. Figura 2
expressão de ARNm de MDR1 em linhas celulares de cancro do cólon. Foi utilizado o mesmo método apresentado na Figura 1.
Foi realizada mais uma vez o tempo real de ensaio de RT-PCR quantitativa para a validação de MDR1
níveis de mRNA obtidos a partir do ensaio de RT-PCR. O MDR1
ARNm não foi detectada nas 10 linhas celulares de cancro gástrico. No entanto, uma das linhas celulares de cancro do cólon 9, variável MDR1
níveis de ARNm pode ser detectado em linhas celulares de cancro do cólon 7, excepto a SNU-C5 e células HT-29 como os dados de RT-PCR (Figura 3). Figura 3 MDR1 expressão de ARNm em linhas de células gástricas e cancro do cólon. O nível de expressão de ARNm de MDR1
foi determinada pelo tempo real de RT-PCR, e normalizada pelo que de β-actina
ARNm, o qual foi utilizado como um controlo para o RNA. O ADNc reversamente transcrito a partir do ARNm foi amplificado separadamente com cada par de iniciadores para genes MDR1 e

p-actina.
Tomados em conjunto, o MDR1
níveis de ARNm em linhas celulares de cancro gástrico foram significativamente mais baixas do que as linhas de células de cancro do cólon.
efeitos inibidores de quimio-sensibilização de Pgp em células de cancro gástrico e cancro do cólon
Embora os níveis de proteína não foram examinados neste estudo, estudos funcionais foram realizados utilizando os inibidores de Pgp no gástrica e cancro do cólon linhas celulares que expressam o mais elevado nível de expressão de ARNm de MDR1
. Como mostrado na Figura 4A, as células Colo320HSR (cólon, p53 mutante, maior expressão de MDR1
mRNA) foram de 14 vezes e > 200 vezes resistentes ao paclitaxel do que a SNU-C5 e células SNU-668 (gástrico, a p53 mutante, maior expressão do ARNm
MDR1) em comparação com a base do IC 50 valores, respectivamente, representando uma diferença significativa nos níveis de Pgp. Além disso, a resistência das células Colo320HSR ao paclitaxel foi invertida pelos bloqueadores de Pgp, incluindo a ciclosporina A, verapamil, e PSC833 (Figura 4B). No entanto, esta inversão não foi observada na SNU-C5 (cólon, sem MDR1
ARNm), bem como células SNU-668. Isto sugere que a Pgp expressa em células do cancro do cólon, mas não as células de cancro gástrico funciona funcionalmente e pode ser inibida pelos inibidores de Pgp. Figura 4 Comparação de expressão e função de Pgp em linhas celulares de estômago e câncer de cólon. (A) a sensibilidade comparativa de Colo320HSR (cólon, mais alto), SNU-668 (gástrica, mais alto) e SNU-C5 (cólon, sem expressão) ao paclitaxel; (B) Efeitos de inibidores de Pgp sobre a sensibilidade de Colo320HSR, SNU-668 e SNU-C5 ao paclitaxel (concentração IC10; 50 uM, 0,3 nM e 0,5 nM, respectivamente). Sensibilidade ao paclitaxel foi determinada utilizando o ensaio de MTT na presença ou na ausência dos inibidores de Pgp (ciclosporina A, o verapamil e PSC833 de 0,8 uM cada). *, P <. 0,05 em relação ao controlo Comparação de
estado de metilação de MDR1 em células de cancro gástrico e cancro do cólon in the estado de metilação foi determinada por análise de metilação com base em PCR de quantificação para um domínio rico em CpG seja de aproximadamente 1 Kb contendo o exão 1 e o intrão 1 entre o MDR1
promotor. Para determinar o grau de metilação do MDR1 e região promotora do gene, dois iniciadores (MS1 e MS2) contendo a Msp I
/Hpa II
locais foram concebidos a partir de um exão e do intrão 1, respectivamente. O par de iniciadores MC foi usada como um controlo positivo para determinar a qualidade da fonte de ADN genómico. Em contraste, o MN que atravessa I /local Hpal a Msp
II na região promotora do gene de isomerase de triosefosfato e nunca é metilado foi utilizado como controlo negativo. A Figura 5B mostra a análise de metilação imagens baseadas em PCR típica quantificação das células HT-29 (cólon) SNU-5 (gástrica) e. A análise de metilação com base em PCR quantificação revelou que todos os produtos de PCR para a MS1 e MS2 não foram produzidos a partir Pst
1-ADN genómico digerido tratado com Msp
I (enzima metilação-insensitive). Por outro lado, os produtos de PCR para ambos MS1 e MS2 nas células SNU-5, mas um produto de PCR para a MS1 sozinho nas células HT-29 foram obtidos após o tratamento
Hpa II (enzima sensível à metilação), indicando metilação de CpG nos locais MS1 e MS2 nas células SNU-5 e somente no local do MS2 nas células HT-29. Conforme resumido na Tabela 1, a metilação foi detectada nos locais MS1 e MS2 das 9 linhas de células de cancro gástrico, com a excepção de SNU-484 mas 2 (SNU-C5 e HCT-116) das linhas de células de cancro do cólon 9. Por outro lado, as células HT-29 foram metilados somente no local do MS2. O SNU-C5, HT-29 (cólon) e SNU-16 (gástricos) células não expressando MDR1
mRNA foram metilado. A análise de sequenciação de ADN de bissulfito foi realizada para confirmar a metilação. analysis.Table metilação como mostrado na Tabela 1, o grau de metilação (%) de 10 locais de CpG no local MS1 gasto é completamente emparelhados com resultados obtidos por quantificação por PCR à base de um estado de metilação e os efeitos de 5AC e /ou TSA sobre MDR1
expressão de mRNA e em várias linhas celulares de estômago e câncer de cólon




ensaio de metilação do DNA




Tissue
linha celular
5AC
enzima de Restrição
bissulfito de sódio
TSA

5AC + TSA


Dobre
Efeito
site
Degree (%)1

Fold

Effect

Fold

Effect

Gastric
SNU-1
32.6
O
MS1
MS2
100
20.7
O
+23.6
D
SNU-5
5,8
O
MS1 MS2

100
1,03
X
6,8
A
SNU-16
nd
X
MS1 MS2

60
8,4
O
28,9
S
SNU-216
-1.0
X
MS1
MS2
50
8,4
O
8,2
N
SNU-484
-1,3
X Restaurant -
- 0
-5.1
X
-0,17
- SNU-601
3.2
O
MS1 MS2

100
3.3
O
13,7
S
SNU-620
67,6
O
MS1 MS2

100
*
X
*
*
SNU-638
68,9
O
MS1 MS2

100
5,7
O
72,9
A
SNU- 668
-1.0
X
MS1 MS2

80
1,8
O
4,4
S
SNU-719
5.8
O
MS1
MS2
100
4.2
O
12.4
S
Colon
SNU-C1
-1.96
X
n.d.
n.d.
0
1.7
O
+1.0
D
SNU-C4
1.0
X
nd nd

0
-1
X
-1,6
N
SNU-C5
nd
X
MS1 MS2

100
nd
X
8
S
Colo320HSR
1,4
X
nd
nd
0
1,6
O
1,3
D
LoVo
-1.9
X
nd nd

0
1.1
X
-2
N
DLD-1 | 1.1
X
nd nd

0
3,5
O
1,1
D
HT-29
*
X
nd
MS2
0
∞
O
*
*
HCT-8
1.0
X
nd nd

0
1.0
X
1.1
N
HCT-116
1,7
o
MS1 MS2

100
1,6
o
1,6
N
1Sequence foi analisada utilizando produtos de PCR contendo o local de MS1 estendida que foi demonstrado que desempenham um papel importante na expressão do mRNA
MDR1. n.d. não detectado; *, Altamente citotóxica; ∞, um aumento em comparação com nenhum mRNA MDR1
expressão; D, diminuiu; A, aditivo; S, sinérgico; N, não mudou
Figura 5 A análise e quantificação de metilação com base em PCR de linhas de células gástricas e cancro do cólon. (A) locais CPG e Hpa II
/Msp I
sites na MDR1 humano e região promotora. Topo: Os locais de CpG estão representados pelas barras verticais curtas. As posições dos exões 1 e 2 estão indicados como caixas fechadas. A posição correspondente a estes fragmentos são indicados. Médio: Hpa II
/Msp I
sítios de reconhecimento são representados por barras verticais curtas. Resumindo, os iniciadores de PCR utilizados na análise de metilação. (B) estado de metilação Representante da MDR1 e região promotor por análise de metilação com base em PCR quantificação em SNU-5 (gástrico) e HT-29 (cólon). 1: MN, Never-metilado Hpa II
/Msp I
local na região promotora do gene triosefosfato isomerase (controle negativo) (240 pb); 2: MC, o par de primers de controlo positivo (240 pb); 3: MS1, Hpa II
/Msp I
local 1 (121 pb); 4: MS2, Hpa II
/Msp I
local 2 (206 pb)
Efeitos de 5-aza-2'-deoxcytidine (5AC) e /ou tricostatina A (TSA) sobre a expressão de. MDR1 ARNm em linhas de células gástricas e cancro do cólon
5AC o inibidor da metiltransferase de ADN e a histona-desacetilase (HDAC) TSA têm sido bem conhecido para aliviar a repressão do gene epigenético [22]. Este estudo examinou o efeito de 5AC e /ou TSA em MDR1
expressão de ARNm nas linhas de cancro gástrico e cancro do cólon. Em 10 gástrica e 9 células cancerígenas do cólon, MDR1
expressão de ARNm foi determinada por RT-PCR após o tratamento com 2,5 uM 5AC durante 96 horas e /ou 100 ng /mL de TSA durante 48 h. Um aumento foi definido em casos que apresentam mais do que um aumento de 1,5 vezes. Como mostrado na Tabela 1, o tratamento 5AC aumentou a MDR1
níveis de ARNm em linhas celulares de cancro gástrico SNU-1, -5, -601, -620, -638 e -719, e que no cólon HCT-116 linha de células de cancro (figuras 6 e 7). No entanto, 5AC não induziu a expressão do mRNA MDR1
mesmo na SNU-16 e SNU-C5 e células HT-29, cujo gene MDR1
foi metilada. O tratamento TSA aumentou a MDR1
níveis de mRNA na SNU-1, -16, -216, -601, -638, -668 e -719 linhas celulares de cancro gástrico eo SNU-C1, Colo320HSR, DLD-1, H29 e HCT-116 linhas de células de cancro do cólon (Figura 6 e 7). 5AC mostraram alta citotoxicidade sozinho ou em combinação com TSA, particularmente nas células HT-29. Além disso, a TSA mostrou actividade altamente citotóxico sozinho ou em combinação com 5AC, particularmente nas células SNU-620. Este estudo também examinou os efeitos do tratamento combinado de 5AC com TSA, o que aumentou a MDR1
aditivamente os níveis de ARNm em células SNU-5 e -638 mas sinergicamente no SNU-16, -601, -668, -719 e células SNU-C5 (Tabela 1). Figura 6 A activação da expressão de mRNA por MDR1 5AC e /ou TSA em células de cancro gástrico. O nível de expressão é relatada como a relação de MDR1
/β-actina. O ARN total foi isolado após tratamento com 2,5 uM 5AC durante 96 horas e /ou 100 ng /mL de TSA durante 48 h. RT-PCR foi realizada utilizando a mesma metodologia reportada na Figura 1. A Figura 7
activação da expressão de mRNA por MDR1 5AC e /ou TSA em várias linhas celulares de cancro do cólon. ensaio de RT-PCR após o tratamento das células com 5AC e /ou TSA utilizando o mesmo método descrito na Figura 6. A /rácio
β-actina MDR1 obtido através de PCR de 35-ciclo após TSA em combinação com 5AC, e só em SNU -C5 e HT-29 expressando nenhuma MDR1
ARNm, respectivamente, foi omitido no histograma.
Estes resultados sugerem que a expressão de ARNm de MDR1
é regulados diferencialmente em células gástricas e cancro do cólon com respeito ao silenciamento de expressão MDR1
através de mecanismos epigenéticos como a metilação do DNA e /ou histona desacetilação.
Discussão
neste estudo, descobrimos que a MDR1
níveis de mRNA nas linhas celulares de cancro gástrico foram significativamente menores do que aqueles nas linhas de células de cancro do cólon, apesar de haver algumas variações. Estes resultados são consistentes com um relatório mostrando que Pgp está fortemente expresso no íleo e o cólon, a um nível que diminui gradualmente para o jejuno proximal, duodeno e do estômago [8]. Uma vez que o estômago e cólon desempenham um papel importante na digestão e absorção, respectivamente, não é surpreendente que os transportadores, como Pgp foram diferencialmente expressos nos dois tecidos normais. A nossa descoberta de que a expressão diferencial de mRNA de MDR1
em linhas celulares de cancro derivadas a partir do estômago e cólon também é consistente com relatórios publicados [23-26]. Estudos imunopatológicos revelou que a expressão Pgp em tumores humanos foi mais comumente detectada no cólon, renal e carcinomas adrenais, mas raramente no pulmão e carcinomas gástricos e de certos tumores de células germinativas [27].
A ligação de três vias entre a metilação do DNA, cromatina estrutura e expressão do gene foi recentemente revisto [28-30]. Uma consequência importante da metilação de CpG é o silenciamento do local da expressão de genes, que pode ser mediada pela interferência da metilação directa com a ligação de vários factores de transcrição. O componente principal de silenciamento de expressão de genes parece ser a ligação da proteína de metil-CpG de ligação 2 (MECP2), que tem uma afinidade para a metil-CpG [31, 32]. desmetilação de ADN por 5AC provoca a libertação da MECP2 a partir do promotor, o qual activa a expressão do gene da transcrição [10]. Sabe-se que MeCP2 é também enriquecida na MDR1
promotor e está relacionada com o seu silenciamento [33]. 5AC altera o padrão de metilação do MDR
um promotor em células PGP-negativo que se assemelham a células de PGP-positiva e activa o promotor de tal forma que MDR1
ARNm é detectável [34].
Neste estudo, o estado de metilação também foi analisada a fim de determinar se o MDR1
silenciamento é devido à hipermetilação da região promotora.

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