Эпигенетические механизмы, участвующие в дифференциальной экспрессии MDR1mRNA между желудка и рака толстой кишки клеточных линий и обоснованиями для клинической химиотерапии

Эпигенетические механизмы, участвующие в дифференциальной MDr1
экспрессии мРНК между желудка и рака толстой кишки клеточных линий и обоснованиями для клинической химиотерапии
Аннотация
Справочная информация
Мембрана транспортеров, таких как P-гликопротеин (гликопротеина), то MDR1 <бр> генного продукта, являются одной из причин неэффективности лечения у онкологических больных. В данном исследовании было проведено сравнение эпигенетические механизмы, участвующие в дифференциальной MDr1
экспрессии мРНК от 10 до желудка и 9 линий клеток рака толстой кишки.
Методы
В MDr1
уровни мРНК определяли с помощью ПЦР в реальном времени анализы ПЦР после обратной транскрипции. Цитотоксичности проводили с использованием МТТ анализ. статуса метилирования исследовали с помощью количественного анализа на основе ПЦР метилирования и бисульфит секвенирование ДНК анализов.
Результаты
The MDr1
уровней мРНК, полученных 35 циклов RT-PCR в желудочном раковых клеток были только что сопоставимо с результатами, полученными с помощью 22 циклов оТ-ПЦР в клетках рака толстой кишки. Анализ в режиме реального времени RT-PCR показали, что MDR1
мРНК не была обнаружена в 10-желудочных линий раковых клеток, а вариабельный MDr1
уровней мРНК в 7 из клеточных линий рака толстой кишки 9, за исключением SNU-С5 и НТ-29 клеток , МТТ Анализ показал, что ингибиторы гликопротеина P, такие как циклоспорин A, верапамил и PSC833 сенсибилизированные Colo320HSR (двоеточие, самая высокая MDr1
выражение), но не СНУ-668 (желудка, самый высокий) и SNU-C5 (желудка, без выражения) паклитаксела. Анализ метилирования Количественная ПЦР на основе показал, что 90% клеток рака желудка, а также 33% раковых клеток толстой кишки были метилированный, которые были полностью согласованы с результатами, полученными с помощью бисульфита анализе ДНК последовательностей. 5-аза-2'-deoxcytidine (5AC, ингибитор ДНК метилтрансферазы) увеличил MDr1
уровни мРНК в 60% клеток желудка, а у 11% клеток рака толстой кишки. Трихостатин A (TSA, ингибитор гистондеацетилазы) увеличил MDr1
уровни мРНК в 70% клеток рака желудка и 55% клеток рака толстой кишки. Комбинированное лечение 5AC с TSA увеличила MDr1
уровни мРНК аддитивно в 20% клеток рака желудка, но синергически в 40% случаев язвы желудка и 11% клеток рака толстой кишки.
Вывод изображения Эти результаты указывают на то, что в MDr1
уровни мРНК в желудочном раковых клеток значительно ниже, чем в клетках рака толстой кишки, которая является, по меньшей мере, частично из-за различных эпигенетических правил, таких как метилирование ДНК и /или гистона деацетилирования. Эти результаты могут дать более глубокое понимание эффективности комбинированной химиотерапии, а также их биодоступности при пероральном введении.
Справочная информация
Язва желудка и колоректальный рак являются причиной заболеваемости и смертности в современном мире. Если лечебная хирургическая резекция невозможно, эти раковые реагируют очень плохо к химиотерапии и приводит к неблагоприятным прогнозом. В больных раком желудка, 5-фторурацил (5-ФУ) на основе комбинации химиотерапии были попытки с целью улучшения результатов лечения [1]. С колоректального рака, 5-ФУ был наиболее широко используемым препаратом в течение более чем 40 лет. Тем не менее, другие агенты, такие как иринотекан или оксалиплатин, были использованы для повышения противоопухолевой эффективности в сочетании с 5-ФУ [2]. 5-ФУ препятствует синтезу ДНК, блокируя производство пиримидиновых нуклеотидов DTMP из свалка во время де Novo
синтеза ДНК посредством ингибирования тимидилатсинтазы, а также за счет включения фторсодержащих нуклеотидов в ДНК и РНК [3].
P-гликопротеин (PGP), кодируемый множественной лекарственной устойчивости (MDR1 1
) гена является представителем мембранный насос отток АТФ-связывающего кассетного (ABC) транспортеров [4-6]. Р-гликопротеина функционирует как энергетически зависимый эффлюксных насосов разнообразных структурно различных химиотерапевтических агентов, таких как доксорубицин, винкристин, винбластин, паклитаксел, colhicine, актиномицин D и митомицином С [7], что может снизить уровень внутриклеточного накопления лекарственного средства. В результате, избыточная экспрессия этих белков дает MDR к раковым клеткам, уклоняясь цитотоксическое действие препаратов. В кишечнике человека,-гликопротеина сильно выражен на апикальной поверхности поверхностных столбчатых эпителиальных клетках подвздошной кишки и толстой кишки, а ее уровень экспрессии постепенно уменьшается в проксимальном направлении в тощую кишку, двенадцатиперстной кишки и желудка [8]. Регулирование транскрипционной активности в MDr1
гена зависит от нескольких транс действия белков, которые связывают консенсусные цис-элементов [9]. Доступность промоторных элементов к их связывания факторов регулируется на уровне хроматина сборки. Уровни как метилирование ДНК и гистонов дезацетилирования регулируют MDr1
экспрессию генов [10-12]. До сих пор регулирование транскрипции MDr1
экспрессии генов с помощью эпигенетических механизмов сообщается в экспрессии в клетках рака толстой кишки [13-16], но ни в раковых клетках желудка. Кроме того, отношения между транскрипционной экспрессии MDR1
генной экспрессии и эпигенетических механизмов в желудка и толстой кишки раковые клетки не сравнивались. Таким образом, остается неясным, почему химиотерапии схемы лечения были по-разному используют для лечения язвы желудка и колоректального рака и почему MDr1
мРНК экспрессируется дифференцированно в желудочном и колоректальных раковых клеток. Таким образом, в этом исследовании изучались ли или нет степень метилирования на промоторе сайте Бюро MDr1
ген тесно связан с MDr1
экспрессии генов в раковых клетках обоих.
Методы
Культура клеток
В 10 желудочные линии клеток человека рак (SNU-1, -5, -16, -216, -484, -601, -620, -638, -668 и -719) и клеточные линии рака толстой кишки 9 (СНУ-C1, С4, С5, Colo320HSR, LoVo, DLD-1, HT-29, НСТ-8 и НСТ-116) были получены из научно-исследовательского онкологического центра при Национальном университете Сеула (Южная Корея). Все клетки культивировали при 37 ° С в 5% СО в <югу> 2 атмосферы с использованием среды RPMI 1640 (GibcoBRL, остров железой, штат Нью-Йорк, США) с 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (Sigma, St. Louis, MO, США). Клетки поддерживали либо в виде суспензии или однослойной культуры, и пересевали, пока они не достигли слияния.
С обратной транскрипцией и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР)
Общую РНК экстрагировали с использованием MagExtractor ® для MFX-2100 (Toyobo, Осака, Япония) автоматическая система очистки нуклеиновой кислоты, в соответствии с инструкциями изготовителя. MDR1,
и бета-актина
мРНК транскрипты были обнаружены с помощью анализа RT-PCR. MDr1
выражение было обнаружено с 5 'и 3' праймеры, соответствующие нуклеотиды 907-930 (5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 ') и 1179-1201 (5'-TGCCAAG-ACCTCTTCAGCTACTG-3'), соответственно, опубликованной последовательности кДНК [17], что дает 296 п.н. продукта ПЦР. β-актина экспрессии мРНК
использовали в качестве контроля для количества РНК, и была обнаружена с 5 'и 3' праймеры, соответствующие нуклеотиды 1912-1932 (5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 ') и 2392-2412 ( 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3 '), соответственно, из опубликованной последовательности кДНК [18], выдающее 501 п.н. продукта ПЦР. РНК из каждого образца обратно транскрибируют с использованием 200 единиц вируса мышиного лейкоза Молони обратной транскриптазы (Научно-исследовательская лаборатория Гибко-Bethesta, Grand Island, NY, USA) и 0,18 мкг /мл олиго (дТ <суб> 20) праймера в течение 1 ч при 37 ° C. Полученную кДНК клеток рака желудка (2-кратно разбавленного кДНК в клетках рака толстой кишки), амплифицировали с 1,25 единиц Taq-полимеразы (РЕ Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 1 мМ MgCl <суб> 2 и 10 пмоль каждого праймера в термоциклеру (GeneAmp 2400, PE Applied Biosystems, Бостон, Массачусетс, США) в течение 22 циклов с раком толстой кишки, но 35 циклов с желудочным раковых клеток для MDR1
и 17 циклов для бета-актина
последовательного денатурации (94 ° с в течение 30 сек), отжига (65 ° с в течение MDR1
, 53 ° с для бета-актина
), и расширение (72 ° с в течение 30 с). После последнего цикла, все продукты ПЦР подвергали конечному расширению 5 мин при 72 ° С. Для количественной оценки, 3 мкКи [α- 32Р] дЦТФ добавляли к каждой реакционной смеси. После того, как ПЦР, ПЦР-продукты были объединены, а затем подвергали электрофорезу на 7,5% геле нативных полиакриламида. Полосы были отсканированы с помощью денситометра (PDI, Хантингтон-Стейшн, Нью-Йорк, США). Количество каждого транскрипта мРНК нормализовали с тем из каждого бета-актина мРНК
.
Экстракции белка и Вестерн-блот-анализ
лизате клеток получали путем лизиса клеток в заготовленные экстракционного буфера (1% NP-40 , 0,5% дезоксихолат натрия, 0,1% ДСН в фосфатно-солевом буферном растворе) с добавлением 2 мМ раствора фтористого фенилметилсульфонила (Sigma) и 10 мкг /мл лейпептина (Sigma). ДНК стриженый с помощью ультразвука и Вестерн-блоттинга анализ проводили с использованием слегка модифицированного метода, впервые описанным Towbin и др. [19]. Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану с помощью электроблотинга с использованием тока 60 В в течение ночи. Мембрану инкубировали в блокирующем растворе (5% обезжиренного молока) в течение 1 ч при комнатной температуре, промывают, а затем инкубируют с первичным козьи поликлональные антитела (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology,, CA, USA) для гликопротеина. Мембрану промывали и инкубировали с конъюгированными с пероксидазой хрена вторичного антитела (разведенного 1: 1000) в отношении каждого IgG для хостов первичных антител в течение 1 часа. Мембрану затем окрашивали с использованием реагента обнаружения устройство обнаружения ECL (Amersham, Piscataway, Нью-Джерси, США).
ПЦР в реальном времени
Экстракция мРНК проводили в соответствии с proctocol RNeasy (Qiagen, Hilden, Germany ). Один микрограмм тотальной РНК была обратно транскрибируется в кДНК в объеме 20 мкл с 200 единиц вируса мышиного лейкоза Молони обратной транскриптазы (научно-исследовательская лаборатория Гибко-Bethesta, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США) и 0,18 мкг /мл олиго (дТ <суб> 20) праймеры (Promega, Мэдисон, США) в соответствии с инструкцией завода-изготовителя. ПЦР в реальном времени проводили с Light Cycler 2.0 Instrument (Roche, Mannheim, Германия) с помощью Fast Start ДНК Master SYBR Green I Kit (Roche). Для проверки правильного продукта амплификации, ПЦР анализировали на агарозном геле 2% окрашивали бромистым этидием. Последовательности праймеров следующие: для бета-актина
, 5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 'и 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3'; для MDR1
, 5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 'и 5'-TGCCAAGACCTCTTCAGCTACTG-3'. Каждая реакция (20 мкл) содержала 4 мкл кДНК (10-кратное разведение), 4 мМ MgCl <суб> 2, 10 пмоль каждого праймера и 2 мкл Быстрый ДНК Старт Мастер SYGR Green I смеси, содержащей буфер, дНТФ, SYBR зеленый краситель и Tag-полимеразы. Процедура амплификации генов-мишеней следующим образом: предварительно денатурации при 95 ° С в течение 10 мин, 40 циклов денатурации при 95 ° С в течение 15 с, отжиг для MDR1
при 67 ° C (бета-актина
при 55 ° С) в течение 5 секунд и удлинение при 72 ° С в течение 7 с (β-актина
в течение 21 сек). Плавка анализ кривой проводили для подтверждения производства одного продукта. Отрицательные контроли без шаблона были произведены для каждого прогона. значения экспрессии генов (относительные уровни мРНК) выражаются в виде соотношений (разность между значениями Ct = точка на кривой, в которой количество флуоресценции начинает быстро возрастать, как правило, несколько стандартных отклонений выше базового уровня, называется порогового цикла ( значение Ct).) между представляющего интерес гена (MDr1
мРНК) и внутреннего контрольного гена (β-актина
мРНК), которые обеспечивают коэффициента нормализации для количества РНК, выделенной из образца. Анализ данных проводили с использованием Light Cycler программного обеспечения версии 4.0 (Roche). Испытание
цитотоксичности с помощью МТТ
В пробирке
цитотоксичности препаратов измеряли с использованием анализа МТТ, как описано в другом месте [20]. Клетки высевали при 2 × 10 4cells /мл и инкубировали в течение ночи, чтобы для крепления и стабилизации. Клетки инкубировали при 37 ° С в течение 3-х дней, и МТТ [3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенил бромида тетразолия, Sigma] раствор затем добавляли в каждую лунку, содержащую клетки. После встряхивания в течение 1 мин, планшет инкубировали в течение 5 часов. Формазан кристаллы суспензионной культуры растворяли в 150 мкл диметилсульфоксида (ДМСО), после удаления надосадочной жидкости. Оптическая плотность лунок измеряли с помощью микропланшет-ридера (μQuant, типа Bio-Tek Instruments Inc., Winooski, VT, USA) при 540 нм.
Анализ метилирования Количественная ПЦР-
Пять микрограммов геномной ДНК переваривают с помощью 50 ед МПВ
I или II Хпа
(Ферментас MBI, Вильнюс, Литва) при 37 ° с в течение 16 часов, добавляют к 1/15 объема 0,6 М Трис (рН 7,5) и 1,5 М NaCl, а затем гидролизовали 50 ед Pst
I (New England Biolabs, MA, USA) при температуре 37 ° с в течение 8 часов. Статус метилирования MDr1
области промотора 5'CpG исследовали путем анализа 100 нг рестрикции-расщепленной ДНК с помощью ПЦР в 25 мкл, содержащие реакций 1,25 единиц Taq-ДНК-полимеразы и 10 пмоль каждого праймера. Анализ метилирования Количественная ПЦР на основе проводили в соответствии с методом, описанным ранее [11]. ПЦР-праймеров были использованы 5'-TCTAGAGAGGTGCAACGGAAG-3 'и 5'-TCAGCCTCACCACAGATGAC-3' для MS1 метилирования чувствительных праймеров (121 п.н.), 5'-TGAAGTCCTCTGGCAAGTCC-3 'и 5'-ATTCTCCCTCCCGGTTCC-3' для MS2 метилирование чувствительных праймеров (206 п.н.), 5'-ATTTCACGTCTTGGTGGCC-3 'и 5'-TCCAGTGCCACTACGGTTT-G-3'for праймеры положительный контроль MC (240 п.н.), и 5'-GGCGAAGGAGGT-TGTCTATTC-3' и 5 ' -AACGTTCTAGGAGAGTCGGG-3 'для MN праймеров отрицательного контроля (240 п.о.), полученный из промотора гена области triosephosphate изомеразы. Амплификацию проводили в амплификатор ДНК в течение 35 циклов для праймеров MN, MC, MS1 и MS2 с участием в последовательности денатурации (95 ° С в течение 30 с), отжиг (60 ° C в течение 30 с), и расширение (72 ° C в течение 30 с). После последнего цикла, все продукты ПЦР подвергали конечным удлинением в течение 5 мин при 72 ° С. Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза на 7% ДСН. Затем гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали с помощью образа станции Kodak 4000 MM (Eastman Kodak, Рочестер, штат Нью-Йорк, США).
Бисульфита анализ ДНК секвенирования
Один мкг геномной ДНК химически модифицируют натрием Бисульфит с использованием набора EZ метилирование ДНК (Zymo Research, Orange, CA, USA), чтобы преобразовать неметилированные цитозина в урацила, оставляя метилированных цитозина в неизмененном виде. ДНК бисульфит-модифицированный использовали для ПЦР-амплификации. Extended MS1 грунтовка содержит 10 сайтов CpG и 2 SP-1 сайты, которые являются обязательными для функционального MDr1
промотор для активации [21]. Последовательности праймеров для амплификации бисульфита обработанных нитей (223 п.н.) были следующими: S: 5'-GGAAGTTAGAATATTTTTTTTGGAAAT-3 '; AS: 5'-ACCTCTACTTCTTTAAACTTAAAAAAACC-3 '. Амплификацию проводили в тех же условиях, за исключением того, ПЦР-48 ° C температуры отжига и 45 циклов ПЦР. После последнего цикла, все продукты ПЦР подвергали конечным удлинением при 72 ° С в течение 5 мин. Последовательность ПЦР-продуктов анализировали с использованием автоматизированного секвенатора (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
Статистический анализ
Результаты Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение, и данные анализировали с использованием Т-теста Стьюдента
. Значения P &л; 0,05 считались значимыми.

Результаты Сравнение профилей экспрессии мРНК MDR1 в желудочном и клетках рака толстой кишки
MDr1
экспрессии мРНК анализировали с помощью анализа RT-PCR с уровнем экспрессии нормализуется с -актина
уровни мРНК, полученные после 17 циклов ПЦР. В MDr1
мРНК не была обнаружена после 22 циклов ПЦР в 10 желудочных линий раковых клеток, но могут быть обнаружены при переменных уровнях после 35 циклов ПЦР, за исключением СНУ-16, что указывает на значительно низкий уровень MDR1 <бр> экспрессия мРНК в клетках рака желудка тестируемых (рисунок 1). Как показано на рисунке 1, порядок ранга в соответствии с MDR1-бета-актина отношение
в желудочном линиях раковых клеток выглядит следующим образом: SNU-668 (1.51) > СНУ-484 (1,37) > СНУ-5 (0,63) > СНУ-601 (0,33) > СНУ-719 (0,32) > СНУ-216 (0,29) > СНУ-638 (0,07) > СНУ-1 (0,04) > СНУ-16 (0). Из клеточных линий рака толстой кишки 9, переменная MDr1
уровни мРНК могут быть обнаружены в линиях клеток рака толстой кишки 7 после 22 циклов ПЦР, но не в SNU-C5 и НТ-29 клеток. В MDr1
мРНК двух последних клеток может быть не обнаружено даже после 35 циклов ПЦР. Эти результаты указывают на относительно высокий уровень MDr1
экспрессии мРНК, несмотря на некоторые исключения в клетках рака толстой кишки. Как показано на рисунке 2, порядок ранга в соответствии с /
-актина отношение
MDR1 в линиях клеток рака толстой кишки выглядит следующим образом: Colo320HSR (0,90) &GТ; СНУ-C4 (0,45) > НСТ-8 (0,26) > СНУ-C1 (0,12) > НСТ-116 (0,11) > LoVo (0,10) > DLD-1 (0,07) > СНУ-С5 (0) = ХТ-29 (0). Рисунок 1 экспрессию MDR1 мРНК в желудочном линиях раковых клеток. Уровень MDr1
экспрессии мРНК определяли с помощью ОТ-ПЦР, и нормированный, что мРНК бета-актина
, которую использовали в качестве контроля для РНК. КДНК обратной транскрипции с мРНК амплифицировали отдельно с каждой парой праймеров для MDR1
и бета-актина
генов. Аликвоты каждой реакционной смеси ПЦР разделяли на 7% полиакриламидном геле. Гель сушили и экспонировали на рентгеновской пленке в течение ночи.
Рисунок 2 экспрессии MDR1 мРНК в линиях клеток рака толстой кишки. Использовалась та же методика приведены на рисунке 1.
Мы снова выполняется в режиме реального времени ОТ-ПЦР-анализ для количественного подтверждения MDr1
уровней мРНК, полученных из ОТ-ПЦР. В MDr1
мРНК не была обнаружена в 10-желудочных линий раковых клеток. Тем не менее, из клеточных линий рака толстой кишки 9, переменная MDr1
уровни мРНК могут быть обнаружены в линиях 7 толстой кишки раковых клеток, за исключением SNU-C5 и НТ-29 клеток, как данные RT-PCR (рисунок 3). Рисунок 3 экспрессия MDR1 мРНК в желудочном и рака толстой кишки клеточных линий. Уровень MDr1
экспрессии мРНК определяли в режиме реального времени RT-PCR, и нормированный, что мРНК бета-актина
, которую использовали в качестве контроля для РНК. КДНК обратной транскрипции с мРНК амплифицировали отдельно с каждой парой праймеров для MDR1
и бета-актина генов
.
Взятые вместе, MDr1
уровни мРНК в желудочном линиях раковых клеток были значительно ниже, чем в раковых клетках толстой кишки линии.
хемосенсибилизирующими эффекты ингибиторов Pgp в желудочном и рак толстой кишки клетки
Хотя уровни белка не были рассмотрены в этом исследовании, функциональные исследования были проведены с использованием ингибиторов Р-гликопротеина в желудочном и рак толстой кишки клеточные линии, экспрессирующие высокий уровень MDr1
экспрессии мРНК. Как показано на рисунке 4А, Colo320HSR клетки (двоеточие, мутантный р53, высокая экспрессия MDR1
мРНК) были в 14 раз и > устойчивые к паклитаксела, чем SNU-C5 и клеток СНУ-668 (желудочная, мутантный р53, высокая экспрессия MDR1
мРНК) в 200 раз по сравнению на основе ИС <суб> 50 значений, соответственно, представляющие собой существенное различие в уровнях Pgp. Кроме того, устойчивость клеток Colo320HSR паклитаксела было отменено ингибиторов Pgp включая циклоспорина А, верапамил, и PSC833 (4В). Тем не менее, этот поворот не наблюдалось в SNU-C5 (толстой кишки, в настоящее время нет MDr1
мРНК) клетки, а также СНУ-668. Это говорит о том, что-гликопротеина выраженное в клетках рака толстой кишки, но не желудка раковые клетки работает функционально и может быть подавлено с помощью ингибиторов Pgp. Рисунок 4 Сравнение экспрессии и функции гликопротеина в язвы желудка и рака толстой кишки клеточных линий. (A) Сравнительная чувствительность Colo320HSR (толстой кишки, самой высокой), СНУ-668 (желудка, самый высокий) и SNU-C5 (толстой кишки, без выражения) паклитаксела; (Б) эффекты ингибиторов Pgp на чувствительность Colo320HSR, СНУ-668 и SNU-C5 с паклитакселом (концентрации IC10, 50 мкМ, 0,3 нМ и 0,5 нМ соответственно). Чувствительность к паклитаксела определяли с использованием МТТ-теста в присутствии или в отсутствие ингибиторов Pgp (циклоспорин А, верапамил и PSC833 0,8 мкМ каждый). *, P &л;. 0,05 по сравнению с контролем изображения Сравнение статуса метилирования MDR1 в желудка и толстой кишки раковых клеток
статус метилирования определяли путем количественного определения ПЦР на основе анализа метилирования для CpG-богатой области составляет приблизительно 1 Kb, содержащий экзон 1 и интрон 1 среди MDr1
промотора. Для того, чтобы определить степень метилирования гена MDR1
области промотора, два праймера (MS1 и MS2), содержащие МПВ
I /Хпа
сайты II были разработаны с экзона 1 и интрона 1, соответственно. Грунтовка пара МС использовали в качестве положительного контроля для определения качества источника геномной ДНК. В отличие от этого, MN, который пересекает МПВ

II сайт I /HPA в гене изомеразы области промотора triosephosphate и никогда не метилированный был использован в качестве отрицательного контроля. На фиг.5В показаны изображения анализа метилирования типичный Количественное основе ПЦР на SNU-5 (желудочный) и НТ-29 (двоеточие) клеток. Анализ метилирования Количественная ПЦР на основе показали, что любые продукты ПЦР для MS1 и MS2 не были произведены из Pst
1-переваренной геномной ДНК обрабатывают MSp
I (метилирование нечувствительные фермента). С другой стороны, продукты ПЦР для обоих MS1 и MS2 в клетках СНУ-5, но ПЦР-продукт для MS1 только в НТ-29 клеток были получены после того, как Хпа
II (метилирование чувствительный фермент) обработки, что указывает на метилирование ЦГ на сайтах MS1 и MS2 в клетках СНУ-5 и только на участке MS2 в клетках НТ-29. Как показано в таблице 1, метилирование был обнаружен на участках MS1 и MS2 из 9 желудочных линий раковых клеток, за исключением SNU-484, но 2 (SNU-C5 и HCT-116) линий клеток рака толстой кишки 9. С другой стороны, клетки НТ-29 были метилируется только на сайте MS2. СНУ-C5, HT-29 (двоеточие) и СНУ-16 (желудочные) клетки не высказываю MDr1
мРНК были метилируется. Бисульфит анализ последовательности ДНК проводили для подтверждения метилирование. Как показано в таблице 1, метилирования степени (%) 10 CpG сайтов на затраченной сайте MS1 полностью совпавших с результатами, полученными с помощью количественной ПЦР на основе метилирования analysis.Table 1 статус метилирования и эффекты 5AC и /или АСП на MDR1
экспрессия мРНК и в различных желудка и рак толстой кишки клеточных линий
<й>
<й>
<й>
<й>
метилирования ДНК анализа

<й>
<й>
<й>
<й>
ткани

линия клеток

5AC

Ограничение Фермент

Бисульфит натрия

TSA
<бр> 5AC + TSA

<й>
<й>
Fold

Effect

сайтов

степень (%)1

Fold

Effect

Fold

Effect

Gastric
SNU-1
32.6
O
MS1
MS2
100
20.7
O
+23.6
D
СНУ-5
5,8
O
MS1
MS2
100
1,03
X
6.8

СНУ-16
й
X
MS1
MS2
60
8.4
O
28,9
S
СНУ-216
-1,0
X
MS1
MS2
50
8.4
O
8.2
N
СНУ-484
-1,3
X
- Форум -
0
-5,1
X
-0,17
-
СНУ-601
3.2
O
MS1
MS2
100
3.3
O
13,7
S
СНУ-620
67,6
O
MS1
MS2
100
*
X
*
*
СНУ-638
68,9
O
MS1
MS2
100
5,7
O
72,9

SNU- 668
-1,0
X
MS1
MS2
80
1.8
O
4.4
S
SNU-719
5.8
O
MS1
MS2
100
4.2
O
12.4
S
Colon
SNU-C1
-1.96
X
n.d.
n.d.
0
1.7
O
+1.0
D
СНУ-C4
1.0
X
й
й
0
-1
X
-1,6
N
СНУ-C5
й
X
MS1
MS2
100
й
X
8
S
Colo320HSR
1.4
X
й <ш> й
0
1.6
O
+1,3 D

LoVo
-1,9
X
й
й
0
1,1
X
-2
N
DLD-1
1.1
X
й
й
0
3.5
O
+1,1 D

HT-29
*
X
й
MS2
0
∞
O
*
*
НСТ-8
1.0
X
й
й
0
1.0
X
1.1
N
НСТ-116
1,7
O
MS1
MS2
100
1.6
O
1.6
N
1Sequence анализировали с использованием ПЦР-продуктов, содержащих расширенный сайт MS1, что было показано, что играет важную роль в MDr1
экспрессии мРНК. n.d., не обнаружено; *, Высоко цитотоксические; ∞, увеличение по сравнению с отсутствием мРНК MDR1
выражения; D, снижение; А, добавка; S, синергетический; N, не изменилось
Рисунок 5 Количественное ПЦР на основе анализа метилирования желудка и рака толстой кишки клеточных линий. (A) CpG сайты и Хпа II
/Msp I
сайтов в человеческом MDr1
промоторной области. Топ: Сайты CpG представлены короткими вертикальными черточками. Позиции экзонов 1 и 2 обозначены как закрытые коробки. Положение, соответствующее этим фрагментам указаны. Средний: Хпа II
/Msp I
сайты узнавания представлены короткими вертикальными черточками. Дно, ПЦР-праймеры, используемые в анализе метилирования. (B) Представитель статус метилирования MDr1
промоторной области путем количественного определения ПЦР на основе анализа метилирования в SNU-5 (желудка) и HT-29 (толстой кишки). 1: MN, Never-метилируется Хпа II
/Msp I
сайт в области triosephosphate изомеразы промотора гена (отрицательный контроль) (240 пар оснований); 2: MC, пара положительный контроль праймера (240 пар оснований); 3: MS1, Хпа II
/Msp I
сайт 1 (121 п.о.); 4: MS2, Хпа II
/Msp I
сайт 2 (206 п.н.)
Эффекты 5-аза-2'-deoxcytidine (5AC) и /или трихостатин A (TSA) на экспрессию. MDR1 мРНК в язвы желудка и рака толстой кишки клеточных линий
ДНК метилтрансферазы ингибитор 5AC и гистондеацетилазы (HDAC) ингибитор TSA были хорошо известны, чтобы уменьшить эпигенетической репрессии генов [22]. В данном исследовании изучали влияние 5AC и /или АСП на MDr1
экспрессии мРНК в желудочном и толстой кишки линий рака. В 10 желудка и 9 клеток рака толстой кишки, MDr1
экспрессия мРНК определяли с помощью ОТ-ПЦР после обработки их с помощью 2,5 мкМ 5AC в течение 96 ч и /или 100 нг /мл TSA в течение 48 ч. Рост был определен в тех случаях, показывая больше, чем увеличение в 1,5 раза. Как показано в таблице 1, обработка 5AC увеличила MDr1
уровни мРНК в желудочном линиях раковых клеток SNU-1, -5, -601, -620, -638 и -719, и что в НСТ-116 ободочной кишки линии клеток рака (6 и 7). Однако 5AC не вызывает MDr1
экспрессию мРНК даже в СНУ-16 и SNU-C5 и клеток НТ-29, чьи MDr1
ген был метилируется. Лечение TSA увеличила MDr1
уровни мРНК в СНУ-1, -16, -216, -601, -638, -668 и -719 желудка линий раковых клеток и SNU-C1, Colo320HSR, DLD-1, Н29 и НСТ-116 раковых клеток толстой кишки линии (рис 6 и 7). 5AC показал высокую цитотоксичность сами по себе или в сочетании с АСП, в частности, в клетках НТ-29. Кроме того, АСП показали весьма цитотоксической активностью сами по себе или в комбинации с 5 ° С, в частности, в клетках СНУ-620. Это исследование также исследовали влияние комбинированного лечения 5AC с АСП, что позволило увеличить MDr1
уровни мРНК аддитивно в клетках СНУ-5 и -638, но синергически в СНУ-16, -601, -668, -719 и СНУ-С5 клетки (Таблица 1). Рисунок 6 активации экспрессии MDR1 мРНК 5AC и /или АСП в клеток рака желудка. Уровень экспрессии сообщается как отношение MDR1 /
бета-актина. Общую РНК выделяли после обработки с 2,5 мкМ 5 ° С в течение 96 ч и /или 100 нг /мл TSA в течение 48 ч. ОТ-ПЦР проводили с использованием той же методологии, сообщается на рисунке 1. Рисунок 7
активации экспрессии MDR1 мРНК 5AC и /или АСП в различных линиях клеток рака толстой кишки. ОТ-ПЦР-анализ после обработки клеток 5AC и /или TSA, используя тот же метод, описанный на фиг.6 /β-актин отношение
MDR1, полученные через 35 цикла ПЦР после TSA в комбинации с 5 ° С, и в одиночку в СНУ и C5-НТ-29 выражают в настоящее время нет MDr1
мРНК, соответственно, был опущен в гистограмме.
Эти результаты свидетельствуют о том, что MDR1
экспрессия мРНК регулируется различным образом в желудочном и клетках рака толстой кишки по отношению к молчанию MDr1
выражение через эпигенетические механизмы, такие как метилирование ДНК и /или гистонов деацетилирования
. Обсуждение
в этом исследовании мы обнаружили, что MDr1
уровни мРНК в желудочном линиях раковых клеток были значительно ниже, чем те, в линиях клеток рака толстой кишки, хотя имелись некоторые вариации. Эти результаты согласуются с отчетом, показывающим, что-гликопротеина сильно выражен на подвздошной кишке и ободочной кишке, на уровне, который постепенно уменьшается в проксимальном направлении в тощую кишку, двенадцатиперстной кишки и желудка [8]. Так как болезнь желудка и толстой кишки играют важную роль в пищеварении и поглощения, соответственно, не удивительно, что переносчики, такие как гликопротеина были дифференцированно выражены в двух нормальных тканей. Наше открытие, что дифференциальное выражение MDr1
мРНК в раковых клеточных линий, полученных из желудка и толстого кишечника также согласуется с опубликованными сообщениями [23-26]. Иммунопатологические исследования показали, что экспрессия Pgp на опухолях человека была наиболее часто обнаруживается в толстой кишке, почек и надпочечников карцином, но редко в легких и желудка карциномы и некоторых опухолей зародышевых клеток [27].
Трехходовой связь между метилирование ДНК, хроматин структура и экспрессия генов был недавно рассмотрен [28-30]. Важным следствием CpG метилирования является местным глушение экспрессии генов, которые могут быть опосредованы прямого вмешательства метилированием связывания различных факторов транскрипции. Основным компонентом глушителей экспрессии генов, как представляется, связывание метил-CpG-связывающего белка 2 (MeCP2), который имеет сродство к метил-CpG [31, 32]. деметилирования ДНК с помощью 5AC вызывает высвобождение MeCP2 от промотора, который активирует транскрипционный экспрессию генов [10]. Известно, что MeCP2 также обогащены по маршруту MDr1
промотора и связана с его молчанием [33]. 5AC изменяет метилирование МЛУ
1 промотор в ПФГ-негативных клетках напоминают, что гликопротеина-позитивных клеток и активирует промотор, такой, что MDr1
мРНК обнаруживается [34].
В этом исследовании, статус метилирования также анализировали с целью определить, является ли MDr1
глушителей из-за гиперметилированием области промотора.

• Визуализации в оценке печени и брюшины метастазов рака желудка: систематический review
• вставки желудочный зонд под прямым контролем зрения с использованием видео ларингоскоп King Vision ™: рандомизиро…