Epigenetiske mekanismer involveret i differentiel MDR1mRNA udtryk mellem gastriske og tyktarmskræft cellelinjer og rationaler for klinisk kemoterapi

Epigenetiske mekanismer involveret i differential MDR1
mRNA-ekspression mellem gastriske og tyktarmskræft cellelinjer og rationaler for klinisk kemoterapi
Abstract
Baggrund
Den membrantransportører såsom P-glycoprotein (Pgp), MDR1
gen-produkt, er en af ​​årsagerne til behandlingssvigt hos kræftpatienter. I denne undersøgelse blev de epigenetiske mekanismer involveret i differential MDR1
mRNA-ekspression sammenlignet mellem 10 gastriske og 9 colon cancercellelinjer. Salg Fremgangsmåder
MDR1
mRNA niveauer blev bestemt under anvendelse af PCR og realtid PCR-assays efter revers transkription. Cytotoksicitet blev udført ved anvendelse af MTT-assayet.
Methylering status blev udforsket af kvantificering PCR-baserede methylering og bisulfit DNA-sekventering analyser. Resultater
MDR1
mRNA-niveauer opnået ved 35 cyklusser af RT-PCR i gastriske kræftceller var bare sammenlignelige med dem, der opnås med 22 cykler af RT-PCR i colon cancerceller. Real-time RT-PCR-analyse afslørede, at MDR1
mRNA ikke blev påvist i 10 gastriske cancercellelinier, men variable MDR1
mRNA-niveauer i 7 af 9 kolon cancercellelinier undtagen SNU-C5 og HT-29-celler . MTT-analysen viste, at Pgp hæmmere såsom cyclosporin A, verapamil og PSC833 sensibiliseret Colo320HSR (colon, højeste MDR1
udtryk), men ikke SNU-668 (gastrisk, højest) og SNU-C5 (gastrisk, ingen udtryk) til paclitaxel. Kvantificering PCR-baseret methylering analyse viste, at 90% af gastriske cancerceller, og 33% af colon- cancerceller var methyleret, der fuldstændig blev matchet med resultaterne opnået ved bisulfit af DNA-sekventering analyse. 5-aza-2'-deoxcytidine (5AC, et DNA methyltransferase inhibitor) øgede MDR1
mRNA-niveauer i 60% af gastriske celler, og i 11% af colon cancerceller. Trichostatin A (TSA, histondeacetylaseinhibitoren) øgede MDR1
mRNA-niveauer i 70% af gastriske cancerceller og 55% af colon cancerceller. Den kombinerede behandling af 5AC med TSA øget MDR1
mRNA-niveauer additivt i 20% af gastriske cancerceller, men synergistisk i 40% af gastrisk og 11% af colon cancerceller.
Konklusion
Disse resultater indikerer, at MDR1
mRNA-niveauer i gastriske cancerceller er betydeligt lavere end i colon cancerceller, som er i det mindste delvist skyldes forskellige epigenetiske forordninger, såsom DNA-methylering og /eller histondeacetylering. Disse resultater kan give en bedre forståelse af effekten af ​​kombineret kemoterapi samt deres orale biotilgængelighed.
Baggrund
Mavesår og tarmkræft er en årsag til sygelighed og dødelighed i verden i dag. Hvis en helbredende kirurgisk resektion er umuligt, disse cancere reagerer meget dårligt på kemoterapi og resulterer i en dårlig prognose. I mavecancerpatienter, har 5-fluorouracil (5-FU) baseret kombinationskemoterapi blevet forsøgt for at forbedre behandlingsresultaterne [1]. Med kolorektal cancer, har 5-FU været den mest anvendte lægemiddel i mere end 40 år. Imidlertid har andre midler, såsom irinotecan eller oxaliplatin blevet anvendt til at forbedre antitumorvirkningen i kombination med [2] 5-FU. 5-FU interfererer med DNA-syntese ved at blokere produktionen af ​​pyrimidin nukleotid dTMP fra dUMP under de novo
DNA-syntese gennem inhibering af thymidylatsyntase samt gennem inkorporering af fluor-nukleotider i DNA og RNA [3].
P-glycoprotein (Pgp) kodes af multilægemiddelresistens 1 (MDR1
) genet er en repræsentativ membran efflukspumpen af ​​ATP-bindende kassette (ABC) transportere [4-6]. PGP fungerer som energi-afhængig efflukspumper af en række strukturelt forskellige kemoterapeutiske midler såsom doxorubicin, vincristin, vinblastin, paclitaxel, colhicine, actinomycin D og mitomycin C [7], der kan nedsætte den intracellulære niveau af akkumulering af lægemidlet. Som et resultat, overekspression af disse proteiner giver MDR for cancerceller ved at unddrage sig de cytotoksiske virkninger af lægemidler. I den menneskelige tarm, er Pgp kraftigt udtrykt på den apikale overflade af de overfladiske søjleformede epitelceller i ileum og colon, og dets ekspression aftager gradvist proximalt ind i jejunum, duodenum og mave [8]. Regulering af den transkriptionelle aktivitet af MDR1
gen er afhængig af flere trans-agerende proteiner, der binder konsensus cis-elementer [9]. Tilgængeligheden af ​​promotorelementerne til deres bindende faktorer reguleres på niveau med kromatin samling. Niveauerne af både DNA methylering og histondeacetylering regulere MDR1
genekspression [10-12]. Hidtil har den transkriptionelle regulering af MDR1
genekspression gennem epigenetiske mekanismer blevet rapporteret i udtryk i colon cancerceller [13-16] men ingen i mavens kræft celler. Endvidere har forholdet mellem den transkriptionelle udtryk for MDR1
genekspression og epigenetiske mekanismer i mavens og tyktarmskræft celler ikke sammenlignes. Derfor er det uklart, hvorfor kemoterapi er blevet anderledes anvendt til behandling af mave- og tarmkræft og hvorfor MDR1
mRNA udtrykkes forskelligt i mave- og kolorektale cancerceller. Derfor er denne undersøgelse undersøgte, hvorvidt graden af ​​methylering ved promotor-stedet i MDR1
gen er tæt forbundet med MDR1
genekspression i både cancerceller. Salg Metoder
Cellekultur
de 10 humane gastrisk cancer cellelinier (SNU-1, -5, -16, -216, -484, -601, -620, -638, -668 og -719) og 9 tyktarmskræft cellelinier (SNU-C1, C4, C5, Colo320HSR, LoVo, DLD-1, HT-29, HCT-8 og HCT-116) blev opnået fra Cancer Research center ved Seoul National University (Sydkorea). Alle celler blev dyrket ved 37 ° C i en CO 5% 2 atmosfære anvendelse af RPMI 1640-medium (GibcoBRL, Gland Island, NY, USA) med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (Sigma, ST. Louis, MO, USA). Cellerne blev holdt enten som en suspension eller en monolagskultur, og subdyrket indtil de nåede konfluens.
Revers transkription-polymerasekædereaktion (RT-PCR) assay
totale RNA blev ekstraheret under anvendelse MagExtractor ® til den MFX-2100 (Toyobo, Osaka, Japan) auto-nukleinsyre rensning system, ifølge producentens instruktioner. MDR1
og p-actin Salg mRNA-transkripter blev påvist under anvendelse af RT-PCR-assayet. MDR1
ekspression blev påvist med 5'- og 3'-primere svarende til nukleotiderne 907-930 (5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 ') og 1179-1201 (5'-TGCCAAG-ACCTCTTCAGCTACTG-3'), henholdsvis af den offentliggjorte cDNA-sekvens [17], hvilket gav et 296 bp PCR-produkt. β-actin
mRNA ekspression blev anvendt som en kontrol for mængden af ​​RNA, og blev påvist med 5'- og 3'-primere svarende til nucleotiderne 1912-1932 (5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 ') og 2392-2412 ( 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3 '), henholdsvis af den offentliggjorte cDNA-sekvens [18], hvilket gav et 501 bp PCR-produkt. RNA fra hver prøve blev revers transkriberet under anvendelse af 200 enheder Moloney murin leukæmivirus-revers transkriptase (Gibco-Bethesta Research Laboratory, Grand Island, NY, USA) og 0,18 ug /ml oligo (dT 20) primer i 1 time ved 37 ° C. Det resulterende cDNA i mavens cancerceller (2 gange fortyndet cDNA i colon cancerceller) blev amplificeret med 1,25 enheder Taq-polymerase (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 1 mM MgCl 2 og 10 pmol af hver primer i en thermal cycler (GeneAmp 2400, PE Applied Biosystems, Boston, MA, USA) i 22 cykler med tyktarmskræft celler, men 35 cykler med de gastriske cancerceller for MDR1
og 17 cykler for β-actin
af den sekventielle denaturering (94 ° C i 30 s), annealing (65 ° C i MDR1
, 53 ° C i β-actin
), og ekstension (72 ° C i 30 s). Efter den sidste cyklus blev alle PCR-produkter underkastes den afsluttende forlængelse på 5 min ved 72 ° C. Til kvantificering, 3 pCi af [α- 32P] dCTP blev tilsat til hver reaktionsblanding. Efter PCR blev PCR produkter kombineret og derefter elektroforeret på en 7,5% denaturerende polyacrylamidgel. Båndene blev scannet med et densitometer (Pdi, Huntington Station, NY, USA). Mængden af ​​hver mRNA-transkript blev normaliseret med den for hver β-actin
mRNA.
Protein ekstraktion og Western blot-analyse
Totale cellelysater fremstilledes ved lysering høstede celler i ekstraktionsbuffer (1% NP-40 , 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS i phosphatpufret saltvand) suppleret med 2 mM phenylmethylsulfonylfluorid (Sigma) og 10 ug /ml leupeptin (Sigma). DNA blev klippet ved lydbehandling og Western blotting-analyse blev udført under anvendelse af en mindre ændring af fremgangsmåden først beskrevet af Towbin et al. [19]. Proteiner blev overført til en nitrocellulosemembran ved elektroblotting ved anvendelse af en strøm på 60 V natten over. Membranen blev inkuberet i blokeringsopløsning (5% skummetmælk) i 1 time ved stuetemperatur, vasket og derefter inkuberet med primære gede-polyklonalt antistof (1: 1000, Santa Cruz, Biotechnology, CA, USA) i Pgp. Membranen blev vasket og inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (fortyndet 1: 1000) ud for hver IgG for værter af primære antistoffer i 1 time. Membranen blev derefter farvet under anvendelse af påvisningsreagens af ECL påvisning (Amersham, Piscataway, NJ, USA).
Real-time PCR
Ekstraktion af mRNA blev udført ifølge RNeasy proctocol (Qiagen, Hilden, Tyskland ). Et mikrogram totalt RNA blev omvendt transkriberet til cDNA i et volumen på 20 pi med 200 enheder Moloney murin leukæmivirus-revers transkriptase (Gibco-Bethesta Research Laboratory, Grand Island, NY, USA) og 0,18 ug /ml oligo (dT 20) primere (Promega, Madison, USA) ifølge producentens manual. Real-time PCR blev udført med Lyset Cycler 2,0 Instrument (Roche, Mannheim, Tyskland) under anvendelse af Fast Start DNA Master SYBR Green I Kit (Roche). Til verifikation af den korrekte forstærkning produkt blev PCR analyseret på en 2% agarosegel farvet med ethidiumbromid. Sekvenserne for primerne er som følger: for β-actin
, 5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 'og 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3'; for MDR1
, 5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 'og 5'-TGCCAAGACCTCTTCAGCTACTG-3'. Hver reaktion (20 pi) indeholdt 4 pi cDNA (10 gange fortynding), 4 mM MgCl 2, 10 pmol af hver primer og 2 pi af Fast Start DNA Master SYGR Green I Mix indeholdende buffer, dNTP'er, SYBR Green farvestof og Tag-polymerase. Proceduren amplifikation af målgener var som følger: pre-denaturering ved 95 ° C i 10 min, 40 cyklusser af denaturering ved 95 ° C i 15 sek, annealing i MDR1
ved 67 ° C (β-actin
ved 55 ° C) i 5 sekunder og forlængelse ved 72 ° C i 7 sek (β-actin
for 21 sek). Smeltekurveanalyse blev udført for at bekræfte produktionen af ​​et enkelt produkt. Negative kontroller uden skabelon blev fremstillet for hver kørsel. Genekspression værdier (relative mRNA niveauer) er udtrykt som forholdet (forskellen mellem Ct-værdier = Det punkt på kurven, hvor mængden af ​​fluorescens begynder at stige hurtigt, som regel et par standardafvigelser over baseline, betegnes tærsklen cyklus ( Ct-værdi).) mellem genet af interesse (MDR1
mRNA) og en intern reference gen (β-actin
mRNA), der giver en normaliseringsfaktor for mængden af ​​RNA isoleret fra en prøve. Analyse af data blev udført ved anvendelse Light Cycler software version 4.0 (Roche).
Cytotoksicitetstesten hjælp MTT-assay
in vitro
cytotoksicitet af lægemidlerne blev målt under anvendelse af et MTT-assay, som beskrevet andetsteds [20]. Cellerne blev podet ved en 2 × 10 4cells /ml og inkuberet natten over for at tillade fastgørelse og stabilisering. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i 3 dage, og MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromid, Sigma] opløsning blev derefter tilsat til hver brønd indeholdende cellerne. Efter omrystning i 1 min, blev pladen inkuberet i 5 timer. Formazankrystaller af suspensionen kultur blev opløst i 150 pi dimethylsulfoxid (DMSO) efter fjernelse af supernatanten. Den optiske densitet af brøndene blev målt med en mikropladelæser (μQuant, Bio-tek Instruments Inc., Winooski, VT, USA) ved 540 nm.
Kvantificering PCR-baseret methyleringsanalyse
Fem mikrogram af det genomiske DNA blev fordøjet med 50 U af MFP
i eller Hpa
II (Fermentas MBI, Vilnius) ved 37 ° C i 16 timer, sat til en 1/15 volumen 0,6 M Tris (pH 7,5) og 1,5 M NaCl og fordøjet med 50 U af Pst
i (New England Biolabs, MA, USA) ved 37 ° C i 8 timer. status for methylering af MDR1
5'CpG promotorregion blev undersøgt ved at analysere 100 ng restriktion-spaltet DNA ved PCR i 25 pi reaktioner indeholdende 1,25 enheder Taq-DNA-polymerase og 10 pmol af hver primer. Kvantificeringen PCR-baseret methyleringsanalyse blev udført ifølge fremgangsmåden tidligere rapporteret [11]. PCR anvendte primere var 5'-TCTAGAGAGGTGCAACGGAAG-3 'og 5'-TCAGCCTCACCACAGATGAC-3' for MS1 følsomme for methylering primere (121 bp), 5'-TGAAGTCCTCTGGCAAGTCC-3 'og 5'-ATTCTCCCTCCCGGTTCC-3' for MS2 følsomme for methylering primere (206 bp), 5'-ATTTCACGTCTTGGTGGCC-3 'og 5'-TCCAGTGCCACTACGGTTT-G-3'for MC positive kontrol primere (240 bp), og 5'-GGCGAAGGAGGT-TGTCTATTC-3' og 5 ' -AACGTTCTAGGAGAGTCGGG-3 'for MN negative kontrol primere (240 bp) afledt af triosephosphatisomerase genpromotorregion. Amplifikation blev udført i et DNA-termisk cykliseringsapparat i 35 cykler for MN, MC, MS1 og MS2 primere involverer i rækkefølge denaturering (95 ° C i 30 s), annealing (60 ° C i 30 s), og ekstension (72 ° C i 30 s). Efter den sidste cyklus blev alle PCR-produkter underkastes den afsluttende forlængelse i 5 minutter ved 72 ° C. PCR-produkterne blev separeret ved elektroforese på 7% PAGE-geler. Gelerne blev derefter farvet med ethidiumbromid, og fotograferet ved anvendelse af en Kodak Image Station 4000 MM (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA).
Bisulfit DNA sekvensanalyse Salg One ug genomisk DNA blev kemisk modificeret ved natrium bisulfit under anvendelse af EZ methylering af DNA kit (Zymo Research, Orange, CA, USA) til at konvertere ikke-methylerede cytosiner til uraciler mens methylerede cytosiner uforandret. Det bisulfit-modificerede DNA blev anvendt til PCR-amplifikation. Udvidet MS1 primer indeholder 10 CpG sites, og 2 SP-1 steder, der er obligatoriske for den funktionelle MDR1
promotor, der skal aktiveres [21]. Primersekvenserne til amplifikation af bisulfit-behandlet strenge (223 bp) var som følger: S: 5'-GGAAGTTAGAATATTTTTTTTGGAAAT-3 '; AS: 5'-ACCTCTACTTCTTTAAACTTAAAAAAACC-3 '. Amplifikation blev udført under de samme PCR-betingelser undtagen 48 ° C annealingstemperatur og 45 PCR-cykler. Efter den sidste cyklus blev alle PCR-produkter udsat for en endelig ekstension ved 72 ° C i 5 min. Sekvens af PCR-produkter blev analyseret ved anvendelse af et automatisk sekventeringsapparat (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
Statistiske analyser
Resultaterne præsenteres som en middelværdi ± SE og data blev analyseret ved anvendelse af t-test
. P-værdier < 0,05 blev betragtet som signifikante.
Resultater
Sammenligning af udtryk profiler af MDR1 mRNA i mavens og tyktarmskræft celler
MDR1
mRNA-ekspression blev analyseret ved hjælp af RT-PCR assay med udtrykket niveau er normaliseret med p-actin Salg mRNA-niveauer opnået efter 17 cykler af PCR. MDR1
mRNA blev ikke detekteret efter 22 cykler af PCR i 10 gastriske cancercellelinier men kunne detekteres på forskelligt niveau efter 35 cykler af PCR med undtagelse af SNU-16, hvilket antyder en signifikant lavt niveau af MDR1
mRNA-ekspression i mavens cancerceller afprøvet (figur 1). Som vist i figur 1, rangordenen ifølge MDR1-β-actin
-forhold i de gastriske cancercellelinier er som følger: SNU-668 (1,51) > SNU-484 (1,37) > SNU-5 (0,63) > SNU-601 (0,33) > SNU-719 (0,32) > SNU-216 (0,29) > SNU-638 (0,07) > SNU-1 (0,04) > SNU-16 (0). Af de 9 Tyktarmskræft cellelinjer, kunne påvises variabel MDR1
mRNA-niveauer i 7 tyktarmskræft cellelinjer efter 22 cyklusser af PCR, men ikke i SNU-C5 og HT-29 celler. MDR1
mRNA'er af de to sidstnævnte celler kunne ikke påvises selv efter 35 cykler af PCR. Disse resultater antyder en forholdsvis høj grad af MDR1
mRNA-ekspression på trods af visse undtagelser i colon cancerceller. Som vist i figur 2, rangordenen ifølge MDR1-service /β-actin
forholdet i tyktarmskræft cellelinjer er som følger: Colo320HSR (0,90) > SNU-C4 (0,45) > HCT-8 (0,26) > SNU-C1 (0,12) > HCT-116 (0,11) > LoVo (0,10) > DLD-1 (0,07) > SNU-C5 (0) = HT-29 (0). Figur 1 MDR1-mRNA-ekspression i gastriske cancercellelinier. Niveauet af MDR1
mRNA-ekspression blev bestemt ved RT-PCR, og normaliseret ved den for mRNA β-actin
, som blev anvendt som en kontrol for RNA. CDNA revers-transkriberet fra mRNA blev amplificeret separat med hvert primerpar for MDR1
og p-actin Salg gener. Portioner af hver PCR-reaktionsblanding blev separeret på 7% polyacrylamidgel. Gelen blev tørret og eksponeret på røntgenfilm natten over.
Figur 2 MDR1-mRNA-ekspression i colon cancercellelinier. Den samme metode rapporteret i figur 1 blev anvendt.
Vi udføres igen realtids-RT-PCR-analyse til kvantitativ validering af MDR1
mRNA-niveauer opnået fra RT-PCR-assay. MDR1
mRNA blev ikke påvist i 10 gastriske cancercellelinjer. Men af ​​de ni Tyktarmskræft cellelinjer, kunne påvises i 7 tyktarmskræft cellelinjer undtagen SNU-C5 og HT-29 celler som RT-PCR-data (figur 3), variabel MDR1
mRNA-niveauer. Figur 3 MDR1-mRNA-ekspression i gastriske og colon cancercellelinier. Niveauet af MDR1
mRNA-ekspression blev bestemt ved real-time RT-PCR, og normaliseret ved den for mRNA β-actin
, som blev anvendt som en kontrol for RNA. CDNA revers-transkriberet fra mRNA blev amplificeret separat med hvert primerpar for MDR1
og p-actin
gener.
Tilsammen MDR1
mRNA-niveauer i det gastriske cancercellelinier var signifikant lavere end i tyktarmskræft cellelinjer.
kemosensibiliserende virkninger af PGP-hæmmere i mavens og tyktarmskræft celler
Selvom protein niveauer ikke blev undersøgt i denne undersøgelse blev funktionelle studier udført med PGP inhibitorer i den gastriske og tyktarmskræft cellelinjer, der udtrykker det højeste niveau af MDR1
mRNA-ekspression. Som vist i figur 4A, de Colo320HSR celler (colon, mutant p53, højeste udtryk for MDR1
mRNA) var 14-fold og > 200 gange resistente over for paclitaxel end SNU-C5 og SNU-668 celler (gastrisk, mutant p53, højeste udtryk for MDR1
mRNA) sammenlignet på grundlag af IC 50 værdier, altså en væsentlig forskel i PGP-niveauer. Desuden blev modstanden i Colo320HSR celler til paclitaxel vendt ved PGP inhibitorer, herunder cyclosporin A, verapamil, og PSC833 (figur 4B). Men denne vending ikke observeret i SNU-C5 (colon, ingen MDR1
mRNA) celler samt SNU-668. Dette antyder, at Pgp udtrykkes i colon cancerceller men ikke gastriske cancerceller virker funktionelt og kan hæmmes af PGP inhibitorer. Figur 4 Sammenligning af Pgp-ekspression og funktion i gastriske og colon cancercellelinier. (A) Sammenlignende følsomhed Colo320HSR (colon, højest), SNU-668 (gastrisk, højest) og SNU-C5 (colon, ingen udtryk) til paclitaxel; (B) Virkninger af PGP inhibitorer på følsomheden af ​​Colo320HSR, SNU-668 og SNU-C5 til paclitaxel (IC10-koncentration, 50 uM, 0,3 nM og 0,5 nM). Følsomhed over for paclitaxel blev bestemt under anvendelse MTT-assay i nærvær eller fravær af PGP-inhibitorer (cyclosporin A, verapamil og PSC833 på 0,8 uM hver). *, P. ≪ 0,05 versus kontrol
Sammenligning af status for methylering af MDR1 i gastriske og colon cancerceller
status Methyleringen blev bestemt ved kvantificering af PCR-baserede methylering analyse for et CpG-rige domæne til at være ca. 1 kb indeholdende exon 1 og intron 1 blandt MDR1
promotoren. For at bestemme graden af ​​methylering af MDR1
genpromotorregion, to primere (MS1 og MS2) indeholdende MSP
I /Hpa
II steder blev konstrueret fra exon 1 og intron 1 hhv. Primerparret MC blev anvendt som en positiv kontrol til at bestemme kvaliteten af ​​kilden genomisk DNA. I modsætning hertil blev det MN, der krydser Msp
I /Hpa
II-site i triosephosphatisomerase genpromotorregion og aldrig methyleres anvendt som den negative kontrol. Figur 5B viser typisk kvantificering PCR-baserede methyleringsanalyse billeder af SNU-5 (gastrisk) og HT-29 (colon) celler. Kvantificeringen PCR-baseret methylering analyse afslørede, at eventuelle PCR-produkter for MS1 og MS2 ikke blev produceret fra Pst
1-fordøjet genomisk DNA behandlet med Msp
I (methylering-ufølsomme enzym). På den anden side blev PCR produkter til både MS1 og MS2 i SNU-5-celler, men et PCR-produkt for MS1 alene i HT-29-celler opnået efter Hpa
II (methylering-sensitive enzym) behandling, hvilket indikerer methylering af CpG på MS1 og MS2 steder i SNU-5 celler og kun på MS2 websted i HT-29 celler. Som opsummeret i tabel 1, blev methylering opdaget på MS1 og MS2 steder i 9 gastrisk cancer cellelinjer med undtagelse af SNU-484, men 2 (SNU-C5 og HCT-116) af de ni tyktarmskræft cellelinjer. På den anden side blev de HT-29-celler methyleret kun på MS2 site. Den SNU-C5, HT-29 (kolon) og SNU-16 (gastrisk) celler ikke udtrykker MDR1
mRNA blev methyleret. Bisulfit DNA-sekventering blev udført for at bekræfte methylering. Som vist i tabel 1, methylering grad (%) af 10 CpG sites på brugt MS1 site er fuldstændigt matchede med resultater opnået ved kvantificering PCR-baseret methylering analysis.Table 1 Methylering status og virkningerne af 5AC og /eller TSA på MDR1
mRNA-ekspression og i forskellige mave- og tyktarmskræft cellelinjer




DNA methylering assay




Tissue
Cell linje
5AC
Begrænsning Enzyme
Natriumbisulfit
TSA

5AC + TSA


Fold
Effect
site
Degree (%)1

Fold

Effect

Fold

Effect

Gastric
SNU-1
32.6
O
MS1
MS2
100
20.7
O
+23.6
D
SNU-5
5.8
O
MS1
MS2
100
1,03
X
6.8
A
SNU-16
nd
X
MS1
MS2
60
8.4
O
28,9
S
SNU-216
-1,0
X
MS1
MS2
50
8.4
O
8,2
N
SNU-484
-1,3
X -
-
0
-5,1
X
-0,17 -
SNU-601
3.2
O
MS1
MS2
100
3.3
O
13,7
S
SNU-620
67,6
O
MS1
MS2
100
*
X
*
*
SNU-638
68,9
O
MS1
MS2
100
5.7
O
72,9
A
SNU- 668
-1,0
X
MS1
MS2
80
1.8
O
4.4
S
SNU-719
5.8
O
MS1
MS2
100
4.2
O
12.4
S
Colon
SNU-C1
-1.96
X
n.d.
n.d.
0
1.7
O
+1.0
D
SNU-C4
1,0
X
nd
nd
0
-1
X
-1,6
N
SNU-C5
nd
X
MS1
MS2
100
nd
X
8
S
Colo320HSR
1.4
X
nd
nd
0
1.6
O
1,3
D
LoVo
-1,9
X
nd
nd
0
1.1
X
-2
N
DLD-1
1.1
X
nd
nd
0
3,5
O
1,1
D
HT-29
*
X
nd
MS2
0
∞
O
*
*
HCT-8
1,0
X
nd
nd
0
1,0
X
1,1
N
HCT-116
1.7
O
MS1
MS2
100
1.6
O
1,6
N
1Sequence blev analyseret ved hjælp af PCR-produkter, der indeholder den udvidede MS1 websted, har vist sig at spille en vigtig rolle i MDR1
mRNA-ekspression. n.d., ikke opdages; *, Meget cytotoksisk; ∞, en stigning i forhold til nogen MDR1 mRNA
udtryk; D, nedsat; A, tilsætningsstoffer; S, synergistiske; N, ikke ændret
Figur 5 Kvantificeringen PCR-baseret metyleringsanalyse af gastriske og colon cancercellelinier. (A) CpG sites og Hpa II
/Msp Jeg
steder i den menneskelige MDR1
promoter region. Top: CpG sites er repræsenteret ved de korte lodrette bjælker. Positionerne af exon 1 og 2 er angivet som lukkede kasser. Positionen svarende til disse fragmenter er indikeret. I midten: Hpa II
/Msp Jeg
sites anerkendelse er repræsenteret ved korte lodrette stænger. Bund, PCR-primere, der anvendes i methyleringsanalyse. (B) repræsentant methylering status MDR1
promotorregion ved kvantificering PCR-baseret methyleringsanalyse i SNU-5 (gastrisk) og HT-29 (colon). 1: MN, aldrig-methylerede HpaII
/Mspl
site ved triosephosphatisomerase genpromotorregion (negativ kontrol) (240 bp); 2: MC, den positive kontrol primerparret (240 bp); 3: MS1, HpaII
/Mspl
site 1 (121 bp); 4: MS2, HpaII
/Mspl
site 2 (206 bp)
Virkninger af 5-aza-2'-deoxcytidine (5AC) og /eller Trichostatin A (TSA) på ekspressionen af. MDR1-mRNA i gastriske og colon cancer cellelinjer
DNA methyltransferase inhibitor 5AC og histon deacetylase (HDAC) inhibitor TSA er blevet godt kendt for at lindre epigenetisk genrepression [22]. Denne undersøgelse undersøgte effekten af ​​5AC og /eller TSA på MDR1
mRNA ekspression i mavens og tyktarmskræft linjer. I 10 gastriske og 9 tyktarmscancerceller blev MDR1
mRNA-ekspression bestemt ved RT-PCR efter at behandle dem med 2,5 uM 5AC i 96 timer og /eller 100 ng /ml TSA i 48 timer. En stigning blev defineret i tilfælde, der viser en stigning på over 1,5 gange. Som vist i tabel 1 var 5AC behandling forøgede MDR1
mRNA-niveauer i SNU-1, -5, -601, -620, -638 og -719 gastriske cancercellelinjer, og at der i HCT-116 colon cancer cellelinje (figur 6 og 7). Desværre fik 5AC fremprovokere MDR1
mRNA-ekspression selv i SNU-16 og SNU-C5 og HT-29 celler, hvis MDR1
gen blev methyleret. TSA behandling øgede MDR1
mRNA-niveauer i SNU-1, -16, -216, -601, -638, -668 og -719 mavekræft cellelinjer og SNU-C1, Colo320HSR, DLD-1, H29 og HCT-116 colon cancer cellelinjer (figur 6 og 7). 5AC viste høj cytotoksicitet alene eller i kombination med TSA, især i HT-29-celler. Samtidig udviste TSA meget cytotoksisk aktivitet alene eller i kombination med 5AC, især i SNU-620 celler. Denne undersøgelse undersøgte også effekten af ​​den kombinerede behandling af 5AC med TSA, som steg MDR1
mRNA-niveauer additivt i SNU-5 og -638 celler, men synergistisk i SNU-16, -601, -668, -719 og SNU-C5-celler (tabel 1). Figur 6 Aktivering af MDR1-mRNA-ekspression ved 5AC og /eller TSA i gastriske cancerceller. Ekspressionsniveauet er rapporteret som forholdet mellem MDR1-service /β-actin. Den totale RNA blev isoleret efter behandling med 2,5 pM 5AC i 96 timer og /eller 100 ng /ml TSA i 48 timer. RT-PCR blev udført under anvendelse af samme metode rapporteret i figur 1.
Figur 7 Aktivering af MDR1-mRNA-ekspression ved 5AC og /eller TSA i forskellige coloncancer-cellelinjer. RT-PCR-assay efter behandling af cellerne med 5AC og /eller TSA anvendelse af den samme metode som beskrevet i figur 6. MDR1 /β-actin
forholdet opnået ved 35-cyklus PCR efter TSA i kombination med 5AC, og alene i SNU C5 og HT-29 udtrykkende ingen MDR1
mRNA henholdsvis blev udeladt i histogrammet.
Disse resultater antyder, MDR1
mRNA-ekspression differentielt reguleres i gastriske og colon cancerceller med hensyn til lyddæmpning af MDR1
udtryk gennem epigenetiske mekanismer såsom DNA methylering og /eller histondeacetylering.
diskussion
i denne undersøgelse fandt vi, at MDR1
mRNA-niveauer i mavens kræft cellelinjer var betydeligt lavere end de i tyktarmskræft cellelinjer, selv om der var nogle variationer. Disse resultater stemmer overens med en rapport, der viser, at Pgp stærkt udtrykkes på ileum og colon på et niveau, der gradvist aftager proksimalt ind i jejunum, duodenum og mave [8]. Da maven og tyktarmen spiller vigtige roller i fordøjelse og absorption, henholdsvis, er det ikke overraskende, at transportører såsom Pgp differentielt blev udtrykt i de to normale væv. Vores konklusion om, at den differentierede udtryk for MDR1
mRNA i cancer cellelinjer afledt fra maven og tyktarmen er også i overensstemmelse med offentliggjorte rapporter [23-26]. Immunpatologisk undersøgelser viste, at Pgp ekspression på humane tumorer blev hyppigst påvist i kolon, nyre- og adrenale carcinomer men sjældent i lunge og gastriske carcinomer og visse kimcelletumorer [27].
Tre-vejs forbindelse mellem DNA methylering, kromatin struktur og genekspression blev for nylig revideret [28-30]. En vigtig konsekvens af CpG-methylering er den lokale silencing af genekspression, der kan være medieret af direkte indblanding methylering med bindingen af ​​forskellige transkriptionsfaktorer. Hovedbestanddelen af ​​silencing af genekspression synes at være bindingen af ​​methyl-CpG-binding protein 2 (MeCP2), som har en affinitet for methyl-CpG [31, 32]. DNA demethylering af 5AC forårsager frigivelsen af ​​MeCP2 fra promotoren, som aktiverer transkriptionel genekspression [10]. Det vides, at MeCP2 også er beriget på MDR1
promotor og er relateret til dets lyddæmpning [33]. 5AC ændrer methyleringsmønsteret i MDR
1 promotor i Pgp-negative celler at ligne Pgp-positive celler og aktiverer promotor, således at MDR1
mRNA er påviselig [34].
I denne undersøgelse, status methyleringen blev også undersøgt for at bestemme, om MDR1
nedregulering skyldes hypermethylering af promotorregionen.

• Imaging vurdere hepatiske og peritoneale metastaser af mavekræft: en systematisk review
• Gastrisk rør indsættelse under direkte udsyn ved hjælp King Vision ™ video laryngoskop: et randomiseret, prospektivt, klinisk forsøg