Los mecanismos epigenéticos implicados en la expresión MDR1mRNA diferencial entre las líneas de células gástricas y cáncer de colon y los fundamentos para los mecanismos epigenéticos implicados en chemotherapy

clínica diferencial MDR1
la expresión del ARNm entre las líneas celulares de cáncer de colon y gástricos y razones para la quimioterapia clínica
Resumen Antecedentes

los transportadores de membrana tales como P-glicoproteína (Pgp), el producto del gen MDR1
, son una de las causas del fracaso del tratamiento en pacientes con cáncer. En este estudio, los mecanismos epigenéticos implicados en diferencial MDR1
la expresión de ARNm se compararon entre 10 gástrico y 9 líneas celulares de cáncer de colon.
Métodos
El MDR1
los niveles de ARNm se determinaron usando PCR en tiempo real y ensayos de PCR después de la transcripción inversa. La citotoxicidad se realizó usando el ensayo de MTT. El estado de metilación fue explorada por la cuantificación basadas en la PCR metilación del ADN y la secuenciación de bisulfito de análisis.
Resultados Empresas El MDR1
niveles de mRNA obtenidos por 35 ciclos de RT-PCR en células de cáncer gástrico eran comparables a los obtenidos por los 22 ciclos de RT-PCR en las células de cáncer de colon. el análisis en tiempo real de RT-PCR reveló que MDR1
ARNm no se detectó en las 10 líneas celulares de cáncer gástrico pero MDR1
niveles de mRNA variables en 7 de las líneas celulares de cáncer de colon 9 excepto el SNU-C5 y células HT-29 . MTT ensayo mostró que los inhibidores de Pgp como la ciclosporina A, verapamilo y PSC833 sensibilizados Colo320HSR (colon, la más alta expresión de MDR1
) pero no SNU-668 (gástrico, el más alto) y SNU-C5 (gástrico, sin expresión) al paclitaxel. el análisis de metilación basado en PCR cuantificación reveló que 90% de las células de cáncer gástrico y 33% de las células de cáncer de colon se metilado, que se corresponde completamente con los resultados obtenidos por análisis de secuenciación de ADN con bisulfito. 5-aza-2 'deoxcytidine (5AC, un inhibidor de la ADN metiltransferasa) aumentó el MDR1
los niveles de ARNm en 60% de las células gástricas, y en 11% de las células de cáncer de colon. La tricostatina A (TSA, inhibidor de la histona desacetilasa) aumentó el MDR1
los niveles de mRNA en el 70% de células de cáncer gástrico y 55% de las células de cáncer de colon. El tratamiento combinado de 5AC con TSA aumentó la MDR1
los niveles de mRNA de forma aditiva en 20% de células de cáncer gástrico, pero sinérgicamente en 40% de gástrico y 11% de las células de cáncer de colon.
Conclusión
Estos resultados indican que la MDR1
niveles de mRNA en células de cáncer gástrico son significativamente inferiores a los de las células de cáncer de colon, que es al menos en parte debido a las diferentes regulaciones epigenéticos como la metilación del ADN y /o desacetilación de histonas. Estos resultados pueden proporcionar una mejor comprensión de la eficacia de la quimioterapia combinada, así como su biodisponibilidad oral.
Antecedentes
gástrico y colorrectal son una causa de morbilidad y mortalidad en el mundo de hoy. Si una resección quirúrgica curativa no es posible, estos tipos de cáncer responden muy mal a la quimioterapia y que resulta en un mal pronóstico. En pacientes con cáncer gástrico, 5-fluorouracilo (5-FU), basado quimioterapia de combinación se han intentado con el fin de mejorar los resultados del tratamiento [1]. Con el cáncer colorrectal, 5-FU ha sido el fármaco más utilizado durante más de 40 años. Sin embargo, otros agentes tales como irinotecan u oxaliplatino se han utilizado para mejorar la eficacia antitumoral en combinación con [2] 5-FU. 5-FU interfiere con la síntesis de ADN mediante el bloqueo de la producción de nucleótido de pirimidina dTMP de la descarga durante la síntesis de novo
ADN a través de la inhibición de la timidilato sintasa, así como a través de la incorporación de fluoro-nucleótidos en el ADN y el ARN [3].
P-glicoproteína (Pgp) codificada por el gen de resistencia a múltiples fármacos 1 (MDR1
) es una bomba de salida de membrana representante de casete de unión a ATP (ABC) los transportistas [4-6]. funciones de Pgp como bombas de eflujo dependiente de la energía de una variedad de estructuralmente diversos agentes quimioterapéuticos, tales como doxorrubicina, vincristina, vinblastina, paclitaxel, colhicine, actinomicina D y mitomicina C [7], que pueden disminuir el nivel intracelular de la acumulación del fármaco. Como resultado de ello, la sobreexpresión de estas proteínas confiere MDR para las células cancerosas por evadir los efectos citotóxicos de fármacos. En el intestino humano, Pgp se expresa fuertemente en la superficie apical de las células epiteliales columnares superficiales del íleon y colon, y su nivel de expresión disminuye gradualmente de manera proximal al yeyuno, duodeno y el estómago [8]. La regulación de la actividad transcripcional de la MDR1
gen depende de varias proteínas que actúan en trans que se unen los de consenso elementos cis [9]. La accesibilidad de los elementos promotores a sus factores de unión está regulada a nivel de ensamblaje de la cromatina. Los niveles tanto de la metilación del ADN y la desacetilación de histonas regulan MDR1
expresión de genes [10 a 12]. Hasta ahora, la regulación transcripcional de MDR1
la expresión génica a través de los mecanismos epigenéticos se ha informado en la expresión en células de cáncer de colon [13-16], pero ninguno en las células de los cánceres gástricos. Además, no se han comparado las relaciones entre la expresión transcripcional de MDR1
la expresión génica y mecanismos epigenéticos en células de cáncer gástrico y de colon. Por lo tanto, no está claro por qué los regímenes de quimioterapia se han utilizado de forma diferente para tratar gástrico y colorrectal y por qué MDR1
ARNm se expresa diferencialmente en células de cáncer gástrico y colorrectal. Por lo tanto, este estudio examinó si el grado de metilación en el sitio del promotor del gen MDR1
está estrechamente asociado con MDR1
la expresión génica en las células cancerosas.
Métodos Cultivo de células

las 10 líneas celulares de cáncer gástrico humano (SNU-1, -5, -16, -216, -484, -601, -620, -638, -668 y -719) y líneas celulares de cáncer de colon (9 SNU-C1, C4, -C5, Colo320HSR, LoVo, DLD-1, HT-29, HCT-8 y HCT-116) se obtuvieron del Centro de Investigación del cáncer de la Universidad Nacional de Seúl (Corea del Sur). Todas las células se cultivaron a 37 ° C en un CO 5% 2 atmósfera utilizando medio RPMI 1640 (GibcoBRL, Isla Gland, NY, EE.UU.) con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (Sigma, St. Louis, MO, ESTADOS UNIDOS). Las células se mantuvieron bien como una suspensión o un cultivo en monocapa, y se subcultivaron hasta que alcanzaron la confluencia.
Inversa de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), Francia El ARN total fue extraído por medio de MagExtractor ® para la MFX-2100 (Toyobo, Osaka, Japón) sistema de purificación de ácido nucleico auto-, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El MDR1 Opiniones y transcripciones de ARNm
beta-actina se detectaron utilizando el ensayo de RT-PCR. MDR1
expresión se detectó con el 5 'y cebadores 3' que corresponde a los nucleótidos 907 a 930 (5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 ') y 1279-01 (5'-TGCCAAG-ACCTCTTCAGCTACTG-3'), respectivamente, de la secuencia publicada de ADNc [17], dando un producto de PCR de 296 pb. β-actina expresión
mRNA se utilizó como un control para la cantidad de ARN, y se detectó con el 5 'y cebadores 3' correspondiente a los nucleótidos 1912-1932 (5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 ') y 2392 a 2412 ( 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3 '), respectivamente, de la secuencia publicada de ADNc [18], dando un producto de PCR 501 bp. El ARN de cada muestra se sometió a transcripción inversa utilizando 200 unidades de virus de la leucemia murina de Moloney la transcriptasa inversa (Laboratorio de Gibco-Bethesta Investigación, Grand Island, NY, EE.UU.) y 0,18 g /ml de oligo (dT 20) imprimación durante 1 hora a 37 ° C. El ADNc resultante de las células de cáncer gástrico (2 veces diluido ADNc en las células de cáncer de colon) se amplificó con 1,25 unidades de Taq polimerasa (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), mM MgCl 1 2 y 10 pmoles de cada cebador en un termociclador (GeneAmp 2400, PE Applied Biosystems, Boston, MA, EE.UU.) durante 22 ciclos con las células de cáncer de colon, pero 35 ciclos con las células de cáncer gástrico para MDR1
y 17 ciclos para β-actina
de la desnaturalización secuencial (94 ° C durante 30 s), recocido (65 ° C para MDR1
, 53 ° C para β-actina
), y extensión (72 ° C durante 30 s). Después del ciclo final, todos los productos de PCR se sometieron a una extensión final de 5 min a 72 ° C. Para la cuantificación, 3 Ci de [α- 32P] dCTP se añadieron a cada mezcla de reacción. Después de la PCR, los productos de la PCR se combinaron y luego a electroforesis en un gel desnaturalizante de poliacrilamida al 7,5%. Las bandas fueron escaneados con un densitómetro (PDI, Huntington Station, NY, EE.UU.). La cantidad de cada transcrito de ARNm se normalizó con la de cada
mRNA β-actina. La extracción de proteínas
y análisis de transferencia Western de lisados ​​de células totales
se prepararon por lisis de células cosechadas en tampón de extracción (1% NP-40 , desoxicolato de sodio 0,5%, 0,1% SDS en solución salina tamponada con fosfato) suplementado con fluoruro de fenilmetilsulfonilo 2 mM (Sigma) y 10 mg /ml de leupeptina (Sigma). ADN fue esquilada de ultrasonidos y análisis de transferencia de Western se realizó usando una ligera modificación del método descrito por primera vez por Towbin et al. [19]. Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa mediante electrotransferencia utilizando una corriente de 60 V durante la noche. La membrana se incubó en solución (5% de leche desnatada) de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron y después se incubaron con anticuerpo policlonal de cabra primario (1: 1000, Santa Cruz, Biotechnology, CA, EE.UU.) para Pgp. La membrana se lavó y se incubó con anticuerpo de rábano picante conjugada con peroxidasa secundario (diluido 1: 1000) contra cada IgG para anfitriones de anticuerpos primarios durante 1 hora. La membrana se tiñó usando el reactivo de detección del kit de detección ECL (Amersham, Piscataway, NJ, EE.UU.).
PCR en tiempo real
La extracción de ARNm se realizó de acuerdo a la proctocol RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania ). Un microgramo de ARN total fue transcrito inversamente en ADNc en un volumen de 20 l con 200 unidades de virus de la leucemia murina de Moloney la transcriptasa (Laboratorio de Investigación de Gibco-Bethesta, Grand Island, NY, EE.UU.) revertir y 0,18 mg /oligo ml (dT 20) primers (Promega, Madison, USA) de acuerdo con el manual del fabricante. PCR en tiempo real se realizó con la Luz Cycler 2.0 Instrumento (Roche, Mannheim, Alemania), utilizando el Fast Start principal DNA SYBR Green I Kit (Roche). Para la verificación del producto de amplificación correcto, PCRs se analizaron en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. Las secuencias de los cebadores son las siguientes: para la β-actina
, 5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 'y 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3'; para MDR1
, 5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 'y 5'-TGCCAAGACCTCTTCAGCTACTG-3'. Cada reacción (20 l) contenía 4 cDNA l (dilución 10 veces), MgCl 4 mM 2, 10 pmol de cada cebador y 2 l de ADN Fast Start Maestro SYGR I Mix verde que contiene tampón, dNTPs, tinte verde SYBR y la etiqueta de la polimerasa. El procedimiento de amplificación de genes diana fue el siguiente: pre-desnaturalización a 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 15 s, recocido de MDR1
a 67 ° C (β-actina
a 55 ° C) durante 5 segundos y extensión a 72 ° C durante 7 s (
β-actina durante 21 s). Se realizó análisis de la curva de fusión para confirmar la producción de un solo producto. Los controles negativos sin plantilla fueron producidos para cada ejecución. los valores de expresión génica (relativa niveles de mRNA) se expresan como proporciones (diferencia entre los valores de Ct = El punto de la curva en la que la cantidad de fluorescencia comienza a aumentar rápidamente, por lo general unas pocas desviaciones estándar por encima de la línea de base, se denomina el ciclo umbral ( valor Ct).) entre el gen de interés (MDR1
mRNA) y un gen de referencia interna (β-actina
mRNA) que proporcionan un factor de normalización para la cantidad de ARN aislado de un espécimen. Análisis de los datos se realizó usando software Light Cycler versión 4.0 (Roche).
Prueba de citotoxicidad utilizando el ensayo MTT Francia El vitro
citotoxicidad en de los fármacos se midió usando un ensayo MTT, tal como se describe en otra parte [20]. Las células se sembraron a una 2 × 10 4cells /ml y se incubaron durante la noche para permitir la fijación y estabilización. Las células se incubaron a 37 ° C durante 3 días, y [bromuro de tetrazolio 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil, Sigma] MTT solución se añadió entonces a cada pocillo que contiene las células. Después de agitar durante 1 min, la placa se incubó durante 5 hr. cristales de formazán del cultivo en suspensión se disolvieron en 150 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) después de retirar el sobrenadante. La densidad óptica de los pocillos se midió con un lector de microplacas (μQuant, Bio-Tek Instruments Inc., Winooski, VT, EE.UU.) a 540 nm
. Análisis de metilación basado en PCR cuantificación
Cinco microgramos de ADN genómico se digirió con 50 u de Msp
o Hpa II
(Fermentas MBI, Vilnius, Lituania) a 37 ° C durante 16 horas, se añadió a un volumen 1/15 de Tris 0,6 M (pH 7,5) y 1,5 M NaCl, y se digirió con 50 U de Pst
I (New England Biolabs, MA, EE.UU.) a 37 ° C durante 8 horas. El estado de metilación de la región promotora MDR1
5'CpG se examinó mediante el análisis de ADN digerido por restricción 100 ng por PCR en reacciones de 25 l que contenía 1,25 unidades de Taq ADN polimerasa y 10 pmoles de cada cebador. El análisis de metilación basado en PCR cuantificación se llevó a cabo de acuerdo con el método descrito anteriormente [11]. Los cebadores de PCR usados ​​fueron 5'-TCTAGAGAGGTGCAACGGAAG-3 'y 5'-TCAGCCTCACCACAGATGAC-3' para los cebadores MS1 sensibles a la metilación (121 pb), 5'-TGAAGTCCTCTGGCAAGTCC-3 'y 5'-ATTCTCCCTCCCGGTTCC-3' para la MS2 cebadores sensibles a la metilación (206 pb) '5' TCCAGTGCCACTACGGTTT-G-3'for-los cebadores MC control positivo (240 pb) y, y 5'-GGCGAAGGAGGT-TGTCTATTC-3 ', 5'-ATTTCACGTCTTGGTGGCC-3 y 5' -AACGTTCTAGGAGAGTCGGG-3 'para MN cebadores de control negativo (240 pb) derivados de la región promotora del gen triosafosfato isomerasa. La amplificación se realizó en un ciclador térmico de ADN durante 35 ciclos para los cebadores MN, MC, MS1 y MS2 que implican en la secuencia de desnaturalización (95 ° C durante 30 s), recocido (60 ° C durante 30 s), y extensión (72 ° C durante 30 s). Después del ciclo final, todos los productos de PCR se sometieron a una extensión final de 5 min a 72 ° C. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en geles de 7% PAGE. Los geles fueron teñidos con bromuro de etidio y se fotografiaron usando una estación de imágenes Kodak 4000 mm (Eastman Kodak, Rochester, NY, EE.UU.).
Análisis de secuenciación de ADN de bisulfito
Uno g de ADN genómico fue modificado químicamente por el sodio bisulfito utilizando el kit EZ metilación del ADN (Zymo Research, Orange, CA, EE.UU.) para convertir citosinas no metiladas a uracilos, dejando inalterada citosinas metiladas. Se utilizó el ADN bisulfite modificados para la amplificación PCR. MS1 imprimación extendida contiene 10 sitios CpG, y 2 SP-1 sitios que son obligatorios para el MDR1 funcional
promotor que se active [21]. Las secuencias de los cebadores para la amplificación de hilos tratado con bisulfito (223 pb) fueron las siguientes: S: 5'-GGAAGTTAGAATATTTTTTTTGGAAAT-3 '; AS: 5 'ACCTCTACTTCTTTAAACTTAAAAAAACC-3'. La amplificación se realizó en las mismas condiciones de la PCR excepto 48 ° C temperatura de hibridación y 45 ciclos de PCR. Después del ciclo final, todos los productos de PCR se sometieron a una extensión final a 72 ° C durante 5 min. Secuencia de los productos de PCR se analizaron mediante un secuenciador automático (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) Análisis estadístico.
Los resultados se presentan como media ± SE y se analizaron los datos utilizando la prueba t de Student
. los valores < P 0,05 se consideraron significativos.
Resultados
Comparación de los perfiles de expresión de MDR1 ARNm en células de cáncer gástrico y de colon
MDR1
expresión de ARNm se analizó mediante el ensayo de RT-PCR con el nivel de expresión se normaliza con el ß-actina niveles de mRNA
obtuvieron después de 17 ciclos de PCR. El MDR1
ARNm no se detectó después de 22 ciclos de PCR en las 10 líneas celulares de cáncer gástrico, pero se pudo detectar en niveles variables después de 35 ciclos de PCR con la excepción de SNU-16, lo que sugiere un nivel significativamente bajo de MDR1
expresión de ARNm en las células de cáncer gástrico prueba (Figura 1). Como se muestra en la Figura 1, el orden de rango de acuerdo a la relación
MDR1-β-actina en las líneas celulares de cáncer gástrico es el siguiente: SNU-668 (1,51) > SNU-484 (1,37) > SNU-5 (0,63) > SNU-601 (0.33) > SNU-719 (0,32) > SNU-216 (0,29) > SNU-638 (0,07) > SNU-1 (0,04) > SNU-16 (0). De las líneas celulares de cáncer de colon 9, variable de MDR1
niveles de mRNA puede ser detectada en líneas celulares de cáncer de colon 7 después de 22 ciclos de PCR, pero no en el SNU-C5 y las células HT-29. El MDR1
ARNm de las dos últimas células podrían no detectarse incluso después de 35 ciclos de PCR. Estos resultados sugieren un nivel relativamente alto de MDR1
la expresión de ARNm a pesar de algunas excepciones en las células de cáncer de colon. Como se muestra en la Figura 2, el orden de rango de acuerdo con la MDR1
/relación
β-actina en las líneas celulares de cáncer de colon es el siguiente: Colo320HSR (0,90) > SNU-C4 (0,45) > HCT-8 (0,26) > SNU-C1 (0,12) > HCT-116 (0,11) > LoVo (0,10) > DLD-1 (0,07) > SNU-C5 (0) = HT-29 (0). Figura 1 MDR1 expresión de ARNm en las líneas celulares de cáncer gástrico. El nivel de MDR1
la expresión de ARNm se determinó mediante RT-PCR, y normalizado por la de mRNA β-actina de
, que se utilizó como control para el ARN. El ADNc transcrito de forma inversa a partir del ARNm se amplificó por separado con cada par de cebadores para MDR1 Comprar y Vender genes beta-actina. Las alícuotas de cada mezcla de reacción de PCR se separaron en gel de poliacrilamida al 7%. El gel se secó y se expuso en una película de rayos X durante la noche.
Figura 2 MDR1 expresión de ARNm en las líneas celulares de cáncer de colon. Se utilizó la misma metodología reportada en la Figura 1.
Se realizó de nuevo el tiempo real de ensayo de RT-PCR para la validación cuantitativa de MDR1
niveles de mRNA obtenidas de ensayo de RT-PCR. El MDR1
ARNm no se detectó en las 10 líneas celulares de cáncer gástrico. Sin embargo, una de las líneas celulares de cáncer de colon 9, variable de MDR1
niveles de mRNA puede ser detectada en líneas celulares de cáncer de colon 7, excepto el SNU-C5 y células HT-29 como los datos de RT-PCR (Figura 3). Figura 3 la expresión MDR1 mRNA en líneas celulares de cáncer gástrico y de colon. El nivel de MDR1
la expresión de ARNm se determinó por tiempo real de RT-PCR, y normalizado por la de mRNA β-actina de
, que se utilizó como control para el ARN. El ADNc transcrito de forma inversa a partir del ARNm se amplificó por separado con cada par de cebadores para MDR1 Comprar y Vender genes beta-actina.
En su conjunto, el MDR1
niveles de mRNA en las líneas celulares de cáncer gástrico fueron significativamente más bajos que los de las líneas celulares de cáncer de colon.
efectos quimiosensibilizantes de inhibidores de Pgp en células de cáncer gástrico y de colon
Aunque los niveles de proteína no fueron examinados en este estudio, se realizaron estudios funcionales utilizando los inhibidores de Pgp en la gástrica y cáncer de colon líneas celulares que expresan el nivel más alto de MDR1
expresión mRNA. Como se muestra en la Figura 4A, las células Colo320HSR (colon, p53 mutante, el más alto de expresión de MDR1
ARNm) fueron 14 veces y > 200 veces resistentes a paclitaxel que el SNU-C5 y las células SNU-668 (gástrico, p53 mutante, el más alto de expresión de MDR1
ARNm) en comparación sobre la base de la IC 50 valores, respectivamente, representando una diferencia significativa en los niveles de Pgp. Además, la resistencia de las células Colo320HSR a paclitaxel fue revertida por los inhibidores de Pgp incluyendo la ciclosporina A, verapamil, y PSC833 (Figura 4B). Sin embargo, esta reversión no se observó en el SNU-C5 (colon, no MDR1
mRNA) células, así como SNU-668. Esto sugiere que la Pgp se expresa en células de cáncer de colon, pero no células de cáncer gástrico funciona funcional y puede ser inhibida por los inhibidores de Pgp. Figura 4 Comparación de la expresión y función de Pgp en líneas celulares de cáncer gástrico y de colon. (A) Sensibilidad comparativo de Colo320HSR (dos puntos, el más alto), SNU-668 (gástrico, el más alto) y SNU-C5 (colon, sin expresión) al paclitaxel; (B) Efectos de los inhibidores de la PGP en la sensibilidad de Colo320HSR, SNU-668 y SNU-C5 a paclitaxel (concentración IC10; 50 M, 0,3 nM y 0,5 nM, respectivamente). La sensibilidad a paclitaxel se determinó utilizando el ensayo de MTT en presencia o ausencia de los inhibidores de Pgp (ciclosporina A, verapamil y PSC833 de 0,8 mM cada uno). *, P <. 0,05 frente al control
Comparación de estado de metilación de MDR1 en células de cáncer gástrico y de colon Francia El estado de metilación fue determinada por el análisis de metilación basado en PCR cuantificación en un dominio rico en CpG sea de aproximadamente 1 Kb que contiene el exón 1 y el intrón 1 entre el MDR1
promotor. Para determinar el grado de metilación del MDR1
región promotora del gen, dos cebadores (MS1 y MS2) que contienen el Msp
I /Hpa II
sitios fueron diseñados desde el exón 1 y el intrón 1, respectivamente. El par de cebadores MC se utilizó como control positivo para determinar la calidad de la fuente de ADN genómico. En contraste, el MN que cruza el Msp
I /Hpa sitio
II en el gen de la isomerasa de triosafosfato región promotora y nunca se metilado se utilizó como control negativo. La Figura 5B muestra el análisis de metilación imágenes basados ​​en la PCR típica cuantificación del SNU-5 (gástrico) y las células HT-29 (colon). El análisis de metilación basado en PCR cuantificación reveló que cualquiera de los productos de PCR para la MS1 y MS2 no se produjeron a partir Pst
1-ADN genómico digerido tratado con Msp
(enzima insensible a metilación). Por otra parte, los productos de PCR tanto para la MS1 y MS2 en las células SNU-5, pero un producto de PCR para la MS1 solo en las células HT-29 se obtuvieron después de tratamiento II
Hpa (enzima sensible a la metilación), lo que indica la metilación de CpG en los sitios de MS1 y MS2 en las células SNU-5 y sólo en el sitio de MS2 en las células HT-29. Como se resume en la Tabla 1, se detectó metilación en los sitios de MS1 y MS2 de las 9 líneas celulares de cáncer gástrico con la excepción de SNU-484 pero 2 (SNU-C5 y HCT-116) de las líneas celulares de cáncer de colon 9. Por otro lado, las células HT-29 se metilado sólo en el sitio MS2. El SNU-C5, HT-29 (colon) y SNU-16 células (gástrico) que no expresan MDR1
mRNA se metilado. Se realizó un análisis de secuenciación de ADN de bisulfito para confirmar la metilación. analysis.Table metilación como se muestra en la Tabla 1, el grado de metilación (%) de los 10 sitios CpG en el sitio MS1 gastado está completamente coincidentes con los resultados obtenidos mediante la cuantificación de PCR basado en 1 El estado de metilación y los efectos de 5AC y /o TSA en MDR1
expresión de ARNm y en diversas líneas celulares gástrico y cáncer de colon




ensayo de metilación del ADN




Tejido
línea celular
5AC
enzimas de restricción
bisulfito de sodio
TSA

5AC + TSA


Fold
Efecto
sitio
Grado (%)1

Fold

Effect

Fold

Effect

Gastric
SNU-1
32.6
O
MS1
MS2
100
20.7
O
+23.6
D
SNU-5
5,8 sobre O
MS1 MS2

100
1,03
X
6,8
Un
SNU-16
nd
X
MS1 MS2

60
8.4 sobre O
28,9
S
SNU-216
-1,0
X
MS1
MS2
50
8.4 sobre O
8.2
N
SNU-484
-1.3
X -
-
0
-5.1
X
-0.17 -
SNU-601
3.2 sobre O
MS1 MS2

100
3.3
O
13,7
S
SNU-620
67.6 sobre O
MS1 MS2

100
*
X
*
*
SNU-638
68.9 sobre O
MS1 MS2

100
5,7 sobre O
72,9
Un
SNU- 668
-1,0
X
MS1 MS2

80
1,8 sobre O
4.4
S
SNU-719
5.8
O
MS1
MS2
100
4.2
O
12.4
S
Colon
SNU-C1
-1.96
X
n.d.
n.d.
0
1.7
O
+1.0
D
SNU-C4
1.0
X
ND | ND | 0 -1

X
-1.6
N
SNU-C5
ND | X
MS1 MS2

100
ND | X página 8
S
Colo320HSR
1.4
X
nd
ND | 0
1.6 sobre O
1,3
D
LoVo
-1,9
X
ND | ND | 0
1.1
X
-2
N
DLD-1 | X 1.1

ND | ND | 0
3.5 sobre O
1,1
D
HT-29
*
X
ND | MS2
0
∞ sobre O
*
*
HCT-8
1.0
X
ND | ND | 0
1.0
X
1.1
N
HCT-116
1.7 sobre O
MS1 MS2

100
1.6 sobre O
1.6
N
1Sequence se analizó usando productos de PCR que contienen el sitio MS1 extendida que se ha demostrado que desempeñan un papel importante en MDR1
la expresión de ARNm. n.d., no detectado; *, Altamente citotóxicos; ∞, un aumento en comparación con ningún mRNA MDR1
expresión; D, disminución; A, aditivo; S, sinérgico; N, no cambió
Figura 5 La cuantificación análisis de metilación basado en la PCR de líneas celulares de cáncer gástrico y de colon. (A) los sitios CpG y Hpa II
/Msp I
sitios en el MDR1 humana
región promotora. Top: Los sitios CpG están representados por las barras verticales cortas. Las posiciones de los exones 1 y 2 se indican como cajas cerradas. La posición correspondiente a estos fragmentos se indican. Medio: Hpa II
/Msp I
sitios de reconocimiento están representados por barras verticales cortas. En pocas palabras, los cebadores de PCR utilizados en el análisis de metilación. (B) el estado de metilación Representante de la MDR1
región promotora mediante el análisis de metilación basado en PCR cuantificación en SNU-5 (gástrico) y HT-29 (colon). 1: MN, metilado Nunca-Hpa II
/Msp I
sitio en la región de promotor del gen de la triosafosfato isomerasa (control negativo) (240 pb); 2: MC, el par de cebadores de control positivo (240 pb); 3: MS1, Hpa II
/Msp I
sitio 1 (121 pb); 4: MS2, Hpa II
/Msp I
sitio 2 (206 bp)
Efectos de 5-aza-2 'deoxcytidine (5AC) y /o tricostatina A (TSA) sobre la expresión de. MDR1 mRNA en líneas celulares de cáncer gástrico y de colon comentario el 5AC inhibidor de la ADN metiltransferasa y la histona desacetilasa (HDAC) inhibidor TSA han sido bien conocido para aliviar el gen epigenético represión [22]. Este estudio examinó el efecto de 5AC y /o TSA en MDR1
la expresión de ARNm en las líneas de cáncer gástrico y de colon. En 10 gástrico y 9 células de cáncer de colon, MDR1
la expresión de ARNm se determinó mediante RT-PCR tras el tratamiento con 2,5 M 5AC por 96 hr y /o 100 ng /ml de TSA durante 48 horas. Un aumento se definió en los casos que muestran un aumento de más de 1,5 veces. Como se muestra en la Tabla 1, el tratamiento 5AC aumentó el MDR1
los niveles de ARNm en las líneas celulares de cáncer gástrico SNU-1, -5, -601, -620, -638 y -719, y que en el colon HCT-116 línea celular de cáncer (Figuras 6 y 7). Sin embargo, 5AC no indujo la expresión de ARNm MDR1
incluso en la células HT-29 cuya MDR1
gen fue metilado SNU-16 y SNU-C5 y. La TSA tratamiento aumentó el MDR1
niveles de mRNA en el -719 líneas celulares de cáncer gástrico SNU-1, -16, -216, -601, -638, -668 y y el SNU-C1, Colo320HSR, DLD-1, H29 y HCT-116 líneas celulares de cáncer de colon (Figura 6 y 7). 5AC mostró una alta citotoxicidad solo o en combinación con TSA, particularmente en las células HT-29. Además, TSA mostró actividad altamente citotóxicos solos o en combinación con 5AC, en particular en las células SNU-620. Este estudio también examinó los efectos del tratamiento combinado de 5AC con TSA, lo que aumentó la MDR1
los niveles de mRNA de forma aditiva en las células SNU-5 y -638 pero de forma sinérgica en el SNU-16, -601, -668, -719 y células SNU-C5 (Tabla 1). Figura 6 La activación de la expresión de MDR1 mRNA por 5AC y /o TSA en células de cáncer gástrico. El nivel de expresión se expresa como la relación de MDR1
/β-actina. El RNA total se aisló después del tratamiento con 2,5 M 5AC por 96 hr y /o 100 ng /ml de TSA durante 48 horas. RT-PCR se realizó usando la misma metodología reportado en la Figura 1.
Figura 7 Activación de la expresión de MDR1 mRNA por 5AC y /o TSA en diversas líneas celulares de cáncer de colon. ensayo de RT-PCR después de tratar las células con 5AC y /o TSA utilizando el mismo método descrito en la Figura 6. La relación
MDR1 /β-actina obtenido a través de 35 ciclos de PCR después de TSA en combinación con 5AC, y solo en SNU -C5 y HT-29 que expresa no MDR1
ARNm, respectivamente, se omitió en el histograma.
Estos resultados sugieren que MDR1
la expresión del ARNm está regulada diferencialmente en células de cáncer gástrico y de colon con respecto al silenciamiento de MDR1
expresión a través de los mecanismos epigenéticos como la metilación del ADN y /o desacetilación de histonas.
Discusión
en este estudio, se encontró que el MDR1
niveles de mRNA en las líneas celulares de cáncer gástrico fueron significativamente inferiores a las en las líneas celulares de cáncer de colon, aunque hubo algunas variaciones. Estos resultados son consistentes con un informe que muestra que Pgp se expresa fuertemente en el íleon y el colon, a un nivel que disminuye gradualmente de manera proximal al yeyuno, duodeno y el estómago [8]. Puesto que el estómago y el colon juegan un papel importante en la digestión y absorción, respectivamente, no es sorprendente que los transportistas como Pgp se expresaron diferencialmente en los dos tejidos normales. Nuestro hallazgo de que la expresión diferencial de MDR1
mRNA en líneas celulares de cáncer derivadas de estómago y de colon también es consistente con informes publicados [23-26]. Los estudios revelaron que inmunopatológicas expresión de Pgp en tumores humanos se detectó con mayor frecuencia en el colon, renales y carcinomas suprarrenales, pero rara vez en el pulmón y carcinomas gástricos y ciertos tumores de células germinales [27]. México La conexión de tres vías entre la metilación del ADN, la cromatina la estructura y la expresión génica fue revisado recientemente [28-30]. Una consecuencia importante de metilación de CpG es el silenciamiento local de la expresión génica, que puede ser mediada por la interferencia directa de la metilación con la unión de diversos factores de transcripción. El componente principal de silenciamiento de la expresión del gen parece ser la unión de la proteína metil-CpG vinculante 2 (MECP2), que tiene una afinidad por metil-CpG [31, 32]. desmetilación del ADN por 5AC provoca la liberación de la MeCP2 a partir del promotor, que activa la expresión de genes transcripcional [10]. Se sabe que la MeCP2 también se enriquece en el MDR1
promotor y está relacionada con su silenciamiento [33]. 5AC altera el patrón de metilación de la MDR
1 promotor en células PGP-negativa para asemejarse a la de las células PGP-positiva y activa el promotor de tal manera que MDR1
ARNm es detectable [34].
En este estudio, el estado de metilación también se analizó con el fin de determinar si el MDR1
silenciamiento es debido a la hipermetilación de la región promotora.

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