Epigenetski mehanizmi, ki sodelujejo v diferencialni MDR1mRNA izražanja med želodca in raka debelega črevesa celičnih linij in načel za klinično chemotherapy

mehanizmov epigenetsko, vključenih v razlika MDR1
ekspresijo mRNA med želodca in raka debelega črevesa celičnih linij in načel za klinično kemoterapijo
Abstract
Ozadje
membranski prevozniki, kot so P-glikoprotein (Pgp), prva MDR1
genskega proizvoda, so eden od vzrokov neuspeha zdravljenja pri bolnikih z rakom. V tej študiji so bili epigenetski mehanizmi, ki sodelujejo pri diferencialnih MDR1
mRNA izražanja v primerjavi med 10 želodca in 9 debelega črevesa celičnih linijah.
Metode
MDR1
ravni mRNA smo določili z uporabo PCR v realnem času PCR testi po reverzno transkripcijo. Citotoksičnost smo izvedli z MTT testom. Stanje metilacija je raziskoval določljivosti PCR na osnovi metilacija in bisulfit zaporedja DNK analize.
Rezultati
MDR1
mRNA, pridobljenih s 35 ciklov RT-PCR v želodcu rakavih celic so le primerljive s tistimi, ki jih 22 ciklov RT-PCR v rakavih celicah debelega črevesa. Analiza v realnem času RT-PCR je pokazala, da MDR1
mRNA ni bila odkrita v 10 želodčnega raka celičnih linijah, ampak spremenljive MDR1
mRNA v 7 9 debelega raka celičnih linijah, razen na snu-C5 in HT-29 celic . MTT test je pokazal, da zaviralci P-gp, kot so ciklosporin A, verapamila in PSC833 občutljivi Colo320HSR (kolona, ​​najvišja MDR1
izraz), vendar ne snu-668 (želodca, najvišji) in snu-C5 (želodca, ni izraz) paklitaksel. Analiza metilacija na osnovi PCR količinsko je pokazala, da je bilo 90% želodčnih rakavih celic in 33% rakavih celic debelega metilalkohol, ki so bili popolnoma ujema z rezultati, ki jih bisulfita analizo DNA zaporedja. 5-aza-2'-deoxcytidine (5AC, inhibitor DNA metiltransferaza) povečal MDR1
nivoje mRNA v 60% želodčnih celic, in pri 11% celic raka kolona. Trichostatin A (TSA inhibitor histon deacetilaze) povečal MDR1
nivoje mRNA v 70% želodčne rakavih celic in 55% celic raka kolona. Kombinirano zdravljenje 5AC s TSA povečala na MDR1
ravni mRNA aditivno pri 20% želodca rakavih celic, vendar sinergistično v 40% želodca in 11% celic raka kolona.
Zaključek
Ti rezultati kažejo, da v MDR1
nivoji mRNA v želodcu rakavih celicah, so bistveno nižji od tistih v rakave celice na debelem črevesu, ki je vsaj delno posledica različnih epigenetske predpisi, kot metilacijo DNA in /ali histon deacetiliranja. Ti rezultati lahko zagotovi boljše razumevanje učinkovitosti kombinirane kemoterapije, kot tudi njihovo peroralno biološko.
Ozadje
so želodca in debelem raka vzrok obolevnosti in umrljivosti v svetu danes. Če je kurativna kirurško resekcijo nemogoče, ti raka odzivajo zelo slabo na kemoterapijo in ima za posledico slabo prognozo. Pri bolnikih z rakom želodca, so 5-fluorouracil (5-FU) kombinacijska kemoterapija temelji poskušal z namenom izboljšanja rezultatov zdravljenja [1]. S kolorektalnim rakom, je 5-FU je najbolj razširjen drog za več kot 40 let. Vendar druga sredstva, kot irinotekan ali oksaliplatin so bili uporabljeni za izboljšanje učinkovitosti protitumorsko v kombinaciji s 5-FU [2]. 5-FU zavira sintezo DNA tako, da zavira nastajanje pirimidina nukleotidov dTMP iz smetišče v de novo
sinteze DNA z zaviranjem timidilatne sintaze, kot tudi z vključitvijo fluoro-nukleotidov v DNA in RNA [3].
P-glikoprotein (Pgp), kodiran z 1 (MDR1
) gen odpornosti proti več zdravilom je predstavnik membranski iztočni črpalka ATP veže na kasetah (ABC) prevoznikov [4-6]. PGP deluje kot energijsko odvisni izlivnimi črpalk različnih strukturno različnih kemoterapevtskih sredstev, kot doksorubicina, vinkristina, vinblastina, paklitakselom, colhicine, aktinomicin D in mitomicina C [7], ki lahko zmanjšajo znotrajcelično raven kopičenja zdravil. Kot rezultat, čezmernim teh proteinov daje MDR do rakavih celic tako izognil citotoksičnih učinkov zdravil. V človeškem črevesju, ki se Pgp močno izražena na koničnem površini površinskih kolumnarnin epitelnih celic ileumu in debelega črevesa, in njegov izraz stopnja zmanjšuje postopno proksimalno v jejunumu, dvanajstniku in želodcu [8]. Ureditev transkripcijske aktivnosti MDR1
gena je odvisna od številnih trans delujočih proteinov, ki vežejo o soglasju cis-elemente [9]. Dostopnost promotorja elementov njihovih vezavnih faktorjev je urejeno na ravni kromatina sklopa. Ravni tako metilacije DNA in histon deacetiliranja urediti MDR1
izražanje genov [10-12]. Doslej je bila uredba o transkripcijski od MDR1
genske ekspresije z epigenetskih mehanizmov poročali pri izražanju v rakavih celicah debelega črevesa [13-16], vendar nihče v raka celic želodca. Poleg tega niso bili v primerjavi razmerja med transkripcijske izraz MDR1
izražanju genov in epigenetskih mehanizmov v želodcu in debelem črevesu rakavih celic. Zato ni jasno, zakaj so bili kemoterapijami drugače uporablja za zdravljenje želodca in debelem raka in zakaj MDR1
mRNA je izražena različno v želodcu in debelega rakavih celic. Zato je ta študija je preučila, ali je stopnja metilacije na promotorja strani generalnega MDR1
gena tesno povezana z MDR1
genske ekspresije v obeh rakavih celic.
Metod
celične kulture
10 človeških želodca rakave celične linije (snu-1, -5, -16, -216, -484, -601, -620, -638, -668 in -719) in 9 debelega rakave celične linije (snu-C1, C4, C5, Colo320HSR, Lovo, DLD-1, HT-29, HCT-8 in HCT-116) so bili pridobljeni iz raziskovalnega centra za boj proti raku na Seoul National University (Južna Koreja). Vse celice smo gojili pri 37 ° C v 5% CO 2 atmosfera uporabi RPMI 1640 medija (GibcoBRL, žleza Island, NY, ZDA) z 10% toplotno inaktiviranega fetalnega bovinega seruma (Sigma, St. Louis, MO, ZDA). Celice so se ohranili, bodisi v obliki suspenzije ali enoplastni kulturi in kultivirajo, dokler niso dosegli sotočje.
Povratne prepis-verižna reakcija s polimerazo (RT-PCR) testa
Na skupno RNA, pridobljeni z uporabo MagExtractor ® za the MFX-2100 (Toyobo, Osaka, Japonska) auto-nukleinske čiščenje kislina sistem, v skladu z navodili proizvajalca. The MDR1
in beta-aktin
mRNA transkriptov so odkrili s pomočjo testa RT-PCR. MDR1
izraz je bila odkrita s 5 'in 3' primerje, ki ustrezajo nukleotidom 907-930 (5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 ') in 1179-1201 (5'-TGCCAAG-ACCTCTTCAGCTACTG-3'), v tem zaporedju, objavljeno cDNA sekvenca [17], pri čemer dobimo 296-bp PCR produkt. β-aktina
mRNA izraz je bil uporabljen kot kontrola za količino RNA in je bila odkrita s 5 'in 3' primerje, ki ustrezajo nukleotidom 1912-1932 (5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 ') in 2392-2412 ( 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3 '), oziroma, objavljenega cDNA sekvence [18], pri čemer dobimo 501-bp PCR produkt. RNK iz vsakega vzorca je bila reverzno prepisana prek 200 enot virusa Moloneyu mišje levkemije reverzne transkriptaze (Research Laboratory Gibco-Bethesta, Grand Island, NY, ZDA) in 0,18 mg /ml oligo (dT 20) primerska 1 uro pri 37 ° C. Dobljeno cDNA želodca rakavih celic (2-krat razredčen cDNA pri raku debelega črevesa celic) smo pomnožili z 1,25 enote Taq polimeraze (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, ZDA), 1 mM MgCl 2 in 10 pmole vsakega temeljni premaz v toplotno ciklerja (GeneAmp 2400, PE Applied Biosystems, Boston, MA, ZDA) 22 ciklov z rakom debelega črevesa celic pa 35 ciklov z želodčno rakavih celic za MDR1
in 17 ciklov za P-aktina
s sekvenčno denaturacije (94 ° C za 30 sekund), žarjenje (65 ° C MDR1
, 53 ° C za p-aktin
) in podaljšek (72 ° C za 30 sekund). Po zadnjem ciklu so bili vsi izdelki PCR podvržemo končni razširitvi 5 min pri 72 ° C. Za kvantifikacije, 3 μCi iz [α- 32P] dCTP dodamo vsakemu reakcijski zmesi. Po PCR so bili PCR produkti združimo in nato elektroforezo na 7,5% nondenaturing poliakrilamidnem gelu. Pasovih so bili skenirani s merilnik gostote (PDI, Huntington Station, NY, ZDA). Znesek vsakega mRNA prepisa je normirano, da vsakega beta-aktina
mRNA.
Ekstrakciji beljakovin in Western analiza blot
Skupaj lizatov celic smo pripravili z lizo pridelane celice v ekstrakcijskega pufra (1% NP-40 , 0,5% natrijev deoksiholat, 0,1% SDS in-fosfatnim pufrom), dopolnjenem z 2 mM fenilmetilsulfonil fluorid (Sigma) in 10 ug /ml leupeptin (Sigma). DNA smo strižejo s sonifikacijo in Western blot analizo smo izvedli s pomočjo rahlo modifikacijo metode, ki jo Towbin et al prvič opisan. [19]. Proteine ​​smo prenesli na nitrocelulozno membrano s pomočjo electroblotting tok 60 V. preko noči. Membrana smo inkubirali v blokirno raztopino (5% posnetega mleka) 1 uro pri sobni temperaturi, izperemo in nato inkubirali s primarno kozjim poliklonskega protitelesa (1: 1000, Santa Cruz, biotehnologije, CA, USA) za Pgp. Membrana speremo in inkubiramo s hrenovo peroksidazo konjugiranih sekundarnih protiteles (razredčenega 1: 1000) proti vsakemu IgG za gostitelje primarnih protiteles za 1 uro. Membrana je nato obarvajo z uporabo reagenta odkrivanja kompleta za odkrivanje ECL (Amersham, Piscataway, NJ, ZDA).
PCR v realnem času
Pridobivanje mRNA je bila izvedena v skladu z RNeasy proctocol (Qiagen, Hilden, Nemčija ). Eden mikrogram celotne RNA smo obratno prevedejo v cDNA v volumnu 20 ul z 200 enot virusa Moloneyu mišje levkemije reverzne transkriptaze (Gibco-Bethesta Research Laboratory, Grand Island, NY, ZDA) in 0,18 pg /ml oligo (dT 20) primerja (Promega, Madison, ZDA) po navodilih za proizvodnjo je. PCR v realnem času smo izvedli z ciklerja 2,0 instrumenta Light (Roche, Mannheim, Nemčija) z uporabo hitrega začetka DNA Master SYBR Green I Kit (Roche). Za preverjanje pravilnega ojačanje izdelka, PCRs analizirani na 2% agaroznem gelu, obarvanem z etidijevim bromidom. Sekvence primerji so: za P-aktina
, 5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 'in 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3'; za MDR1
, 5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 'in 5' TGCCAAGACCTCTTCAGCTACTG-3 ". Vsaka reakcija (20 ul) vsebuje 4 cDNA ul (10-kratno redčenje), 4 mM MgCl 2, 10 pmole vsakega temeljni premaz in 2 ul Fast Začni DNA Master SYGR zeleni I Mix vsebuje pufer, dNTP-jev, SYBR Green dye in Tag polimeraza. Postopek pomnoževanja tarčnih genov je bila naslednja: pre-denaturacija pri 95 ° C za 10 minut, 40 ciklov po denaturaciji pri 95 ° C 15 sekund, žarjenje za MDR1
pri 67 ° C (P-aktina
pri 55 ° C) za 5 sekund, in podaljšanje pri 72 ° C za 7 sekund (β-aktina
21 sek). Taljenje analiza krivulja je bila izvedena za potrditev proizvodnjo enega samega izdelka. Negativne kontrole brez predlogi so bili izdelani za vsako vožnjo. Gene izraz vrednosti (relativni nivoji mRNA) so izražene kot razmerje (razlika med vrednostmi Ct = Točka na krivulji, v katerem je količina fluorescence začne hitro naraščati, običajno nekaj standardnih odklonov nad izhodiščem, se imenuje cikel praga ( ct vrednost).) med gena (MDR1
mRNA) in notranjim referenčnim genom (β-aktina
mRNA), ki zagotavljajo faktorja normalizacije za količino RNA izolirane iz vzorca. Analiza podatkov je bila opravljena s pomočjo svetlobe ciklerja različico programske opreme 4.0 (Roche). Test
Citotoksičnost uporabo MTT testom
je vitro
citotoksičnosti od drog, izmerjena z uporabo MTT testa, kot je opisano drugje [20]. Celice smo zasejali v 2 x 10 4cells /ml in inkubirana čez noč, da se omogoči za pritrditev in stabilizacijo. Celice inkubiramo pri 37 ° C 3 dni, in MTT [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolij bromid, Sigma] smo raztopino nato dodamo v vsako vdolbinico, ki vsebuje celice. Po stresanju 1 minuto, smo ploščo inkubirali 5 ur. Formazana kristali kulture suspenzijo smo raztopili v 150 ul dimetilsulfoksida (DMSO), po odstranitvi supernatanta. Optična gostota vrtin je bila izmerjena z bralnikom mikroploščnem (μQuant, Bio-tek Instruments Inc., WINOOSKI, VT, ZDA) pri 540 nm.
Analizo metilacije osnovi PCR Količinska
pet mikrogramov genomsko DNA digeriramo s 50 U PPN
I ali Hpa
II (Fermentas MBI, Vilna, Litva), pri 37 ° C 16 ur, dodamo k 1/15 volumna 0,6 M tris (pH 7,5) in 1.5 M NaCl in digeriramo s 50 U PST
I (New England BioLabs, MA, ZDA) pri 37 ° C 8 ur. Status metilacija MDR1
5'CpG promotorja regiji bile preverjene z analizo 100 ng-restriction prebavi DNA s PCR v 25 ul reakcijah, ki vsebujejo 1,25 enote polimeraza Taq DNA in 10 pmole vsakega primer. Analiza metilacije na osnovi PCR kvantifikacija bil izveden v skladu z metodo prej poročali [11]. Primerji PCR Uporabljali so 5'-TCTAGAGAGGTGCAACGGAAG-3 'in 5'-TCAGCCTCACCACAGATGAC-3 "za MS1 metilacijo občutljiv primerji (121 bt), 5'-TGAAGTCCTCTGGCAAGTCC-3' in 5'-ATTCTCCCTCCCGGTTCC-3" za MS2 metilacije občutljiv primerji (206 bp), 5'-ATTTCACGTCTTGGTGGCC-3 'in 5'-TCCAGTGCCACTACGGTTT-G-3'for pozitivni kontroli primerji MC (240 bp) in 5'-GGCGAAGGAGGT-TGTCTATTC-3' in 5 ' -AACGTTCTAGGAGAGTCGGG-3 "za MN negativne kontrolne primerji (240 bt), ki izhajajo iz triosefosfat izomerazo gen promotorja regiji. Pomnoževanje smo izvedli v DNK termalnega ciklerja 35 ciklov za primerji MN, MC, MS1 in MS2 vključujejo v sekvenci denaturacija (95 ° C za 30 sekund), žarjenje (60 ° C za 30 sekund) in podaljšek (72 ° C 30 s). Po zadnjem ciklu so bili vsi izdelki PCR podvržemo končni razširitvi 5 minut pri 72 ° C. Proizvodi PCR ločimo z elektroforezo na 7% PAGE gelih. Geli so bili nato obarvali z etidijevim bromidom in fotografirali z uporabo Image Station Kodak 4000 MM (Eastman Kodak, Rochester, NY, ZDA).
Bisulfit analizo DNA zaporedja
je ena ig genomske DNA kemično modificirano s natrij bisulfit z EZ DNA metilacije komplet (Zymo raziskave, Orange, CA, ZDA) za pretvorbo nemetilirane cytosines za uracili obenem pa metiliranih cytosines nespremenjen. DNA-bisulfit prirejena smo uporabili za pomnoževanje. Razširjena MS1 primer vsebuje 10 CpG mesta in 2 SP-1 mest, ki jih je treba upoštevati, da se funkcionalno MDR1
promotor aktiviran [21]. Temeljni premaz zaporedja za pomnoževanje of-bisulfitnih obdelamo pramenov (223 bt) so bili kot sledi: S: 5'-GGAAGTTAGAATATTTTTTTTGGAAAT-3 '; AS: 5'-ACCTCTACTTCTTTAAACTTAAAAAAACC-3 ". Pomnoževanje smo izvedli pod enakimi pogoji PCR razen 48 ° C temperature kaljenja in 45 PCR ciklov. Po zadnjem ciklu so bili vsi izdelki PCR podvržemo končni razširitvi pri 72 ° C 5 min. Zaporedje produktov PCR smo analizirali z uporabo avtomatskega sekvencer (Applied Biosystems, Foster City, CA, ZDA).
Statistična analiza
Rezultati so prikazani kot povprečje ± SE in podatke smo analizirali s pomočjo t-test
. P vrednosti < 0.05 so bistvenega pomena.
Rezultate
Primerjava izraznih profilov MDR1 mRNA v želodcu in rakave celice kolona
MDR1
ekspresijo mRNA smo analizirali s pomočjo testa RT-PCR z ravnijo izražanja pa normalizirana z beta-aktin
ravni mRNA pridobljeno po 17 ciklih PCR. The MDR1
mRNK ni bila odkrita po 22 ciklih PCR v 10 želodčnega raka celičnih linij, vendar se lahko odkrijejo na različnih stopnjah po 35 ciklih PCR z izjemo snu-16, kar kaže na močno nizko raven MDR1
mRNA izražanja v želodčnih rakavih celic testiranih (slika 1). Kot je prikazano na sliki 1, bi čin glede na razmerje med
MDR1-P-aktina v želodčnega raka celičnih linij je kot sledi: snu-668 (1,51) > Snu-484 (1.37) > Snu-5 (0,63) > Snu-601 (0,33) > Snu-719 (0,32) > Snu-216 (0,29) > Snu-638 (0,07) > Snu-1 (0,04) > Snu-16 (0). Rakavih celičnih linij 9 debelo črevo, lahko variabilna MDR1
nivoji mRNA mogoče odkriti v 7 debelega črevesa celičnih linij po 22 ciklih PCR, vendar ne v snu-C5 in HT-29 celice. The MDR1
mRNA v zadnjih dveh celicah ni bilo zaznati tudi po 35 ciklov PCR. Ti rezultati kažejo na relativno visoko stopnjo MDR1
ekspresijo mRNA kljub nekaterim izjemam pri raku debelega črevesa celic. Kot je prikazano na sliki 2, vrstni red čin po MDR1
razmerje
/P-aktina v celičnih linijah raka debelega črevesa, je, kot sledi: Colo320HSR (0,90) > Snu-C4 (0,45) > HCT-8 (0,26) > Snu-C1 (0,12) > HCT-116 (0,11) > Lovo (0,10) > DLD-1 (0.07) > Snu-C5 (0) = HT-29 (0). Slika 1 MDR1 mRNA ekspresije v želodcu raka celičnih linij. Stopnja MDR1
mRNA ekspresije določimo z RT-PCR in normalizirajo tako, da iz mRNA p-aktin
, ki je bila uporabljena kot kontrola za RNA. CDNA reverse-prepisati iz je mRNA pomnožili ločeno z vsakim primerjem par za MDR1
in beta-aktina
genov. Alikvote vsakega PCR reakcijski zmesi ločimo od 7% poliakrilamidnem gelu. Gel posušimo in izpostavljena na rentgenskem filmu preko noči.
Slika 2 MDR1 mRNA ekspresije v celičnih linijah raka debelega črevesa. je bila uporabljena ista metodologija je prikazano na sliki 1.
smo ponovno izvedli v realnem času RT-PCR za kvantitativno potrjevanje MDR1
mRNA, pridobljenih iz RT-PCR testom. The MDR1
mRNA ni bila odkrita v 10 želodčnega raka celičnih linijah. Vendar rakavih celičnih linij 9 debelo črevo, spremenljiva MDR1
nivoji mRNA mogoče odkriti v 7 debelega linij rakavih celic z izjemo snu-C5 in HT-29 celice so podatki RT-PCR (slika 3). Slika 3 MDR1 mRNA izraz v želodcu in raka debelega črevesa celičnih linij. Stopnja MDR1
mRNA ekspresije določimo z realnem času RT-PCR in normalizirajo tako, da iz mRNA p-aktin
, ki je bila uporabljena kot kontrola za RNA. CDNA reverse-prepisane iz mRNA smo pomnožili ločeno z vsakim primerjem par za MDR1
in beta-aktina
genov.
V celoti gledano, so bile MDR1
ravni mRNA v želodčni rak celičnih linij bistveno nižje od tistih, ki na progah za rak debelega črevesa celic.
kemosenzibilni učinki zaviralcev Pgp v želodcu in debelem črevesu rakavih celic
Čeprav koncentracije proteina niso bile obravnavane v tej raziskavi, so funkcionalne študije, izvedene z uporabo zaviralci P-gp v želodca in rak debelega črevesa celične linije, ki izražajo najvišjo raven MDR1
mRNA izražanja. Kot je prikazano na sliki 4A, so Colo320HSR celice (debelo črevo, mutant p53, najvišji izraz MDR1
mRNA), 14-krat, in > 200-krat, odpornih proti paklitakselom kot snu-C5 in snu-668 celic (želodca, mutant p53, najvišji izraz MDR1
mRNA) v primerjavi na podlagi IC 50 vrednosti, oziroma, kar je pomembna razlika v ravni Pgp. Poleg tega je bila odpornost Colo320HSR celic paklitaksel obrnilo z inhibitorji Pgp tudi ciklosporin A, verapamilom, in PSC833 (slika 4B). Vendar pa ta preobrat ni bilo opaziti v snu-C5 (kolona, ​​no MDR1
mRNA) celice kot tudi snu-668. To kaže, da Pgp izražen v rakavih celicah debelega črevesa, vendar ne v želodcu rakave celice deluje funkcionalno in lahko zavirajo zaviralci P-gp. Slika 4 Primerjava Pgp izražanja in delovanja v želodcu in raka debelega črevesa celičnih linij. (A) Primerjalna občutljivost Colo320HSR (debelega črevesa, najvišjo), snu-668 (želodca, najvišji) in snu-C5 (debelega črevesa, ni izraz) paklitaksel; (B) Učinki zaviralcev Pgp na občutljivost Colo320HSR, snu-668 in snu-C5 do paklitakselom (koncentracijo IC10; 50 LM, 0,3 nM in 0,5 nM). Občutljivost paklitaksel je bila določena z MTT testom v prisotnosti ali odsotnosti inhibitorjev Pgp (ciklosporin A, verapamila in PSC833 0,8 uM vsakega). * P. ≪ 0,05 v primerjavi s kontrolo
primerjavo metilacijskega statusa MDR1 v želodčnih in črevesnih rakavih celic PODJETJA
je metilacijskega statusa določimo z analizo, ki temelji na PCR kvantifikacija metilacije za CpG bogato domeno za približno 1 kb vsebuje eksonu 1 in intron 1. mestu med MDR1
promotorja. Za določitev stopnje metilacija MDR1
promotor gena regiji, dve temeljni premazi (MS1 in MS2), ki vsebujejo PPN
I /hPa
so mesta II, izdelane iz eksonu 1 in introna 1, oz. Primerski par MC uporabimo kot pozitivno kontrolo za določanje kakovosti izvorne genomske DNA. V nasprotju s tem pa je bil MN, ki prečka PPN
I /hPa
II mesto na triosefosfat izomeraza promotor gena regiji in se nikoli ne metiliramo uporablja kot negativno kontrolo. Slika 5B prikazuje na osnovi PCR tipičen količinsko analizo metilacije podobe snu-5 (želodca) in HT-29 celic (debelo črevo). Analiza je metilacija na osnovi PCR količinsko je pokazala, da vsi PCR izdelki za MS1 in MS2 niso bili proizvedeni iz PST
1-prebavi genomske DNK, obdelanega s PPN
I (metilacija-neobčutljiv encim). Po drugi strani pa so bili PCR produkti za tako MS1 in MS2 v celicah snu-5 temveč produkta PCR za MS1 zgolj v celicah HT-29 dobimo po hPa
II (metilacija občutljiva encima) zdravljenja, kar kaže metilacije od CPG na mestih MS1 in MS2 v celicah snu-5 in samo na mestu MS2 v celicah HT-29. Kot je povzeto v tabeli 1, je metilacija odkrita na mestih MS1 in MS2 od 9 želodca linij rakavih celic z izjemo snu-484 a 2 (snu-C5 in HCT-116) iz rakavih celic prog 9 debelega črevesa. Po drugi strani pa so bile celice HT-29 metiliramo le na mestu MS2. Snu-C5, HT-29 (debelega črevesa) in snu-16 celice (v želodcu) ne izraža MDR1
mRNA so metilira. Bisulfit analiza DNA zaporedja je bila izvedena za potrditev metilacije. temelji na PCR, kot kažejo v tabeli 1, metilacije stopnje (%) 10 CpG mest na porabila MS1 mestu se popolnoma ujema z rezultati, pridobljenimi s določljivosti metilacija analysis.Table 1 Stanje metilacije in učinki 5AC in /ali TSA na MDR1
mRNA izražanja in v različnih želodca in debelega črevesa celičnih linij




DNA metilacije testu




tkiva
Cell linija
5AC
Omejitev encimov
Sodium Bisulfite
TSA

5AC + TSA


Zložite
učinek
Site
Stopnja (%)1

Fold

Effect

Fold

Effect

Gastric
SNU-1
32.6
O
MS1
MS2
100
20.7
O
+23.6
D
Snu-5
5.8
O
MS1
MS2
100
1.03
X
6.8

snu-16
nd
X
MS1
MS2
60
8.4
O
28,9
S
snu-216
-1,0
X
MS1
MS2
50
8.4
O
8.2
N
snu-484
-1,3
X -
-
0
-5,1
X
-0,17 -
snu-601
3.2
O
MS1
MS2
100
3.3
O
13,7
S
snu-620
67,6
O
MS1
MS2
100
*
X
*
*
snu-638
68,9
O
MS1
MS2
100
5.7
O
72,9

SNU- 668
-1,0
X
MS1
MS2
80
1,8
O
4.4
S
SNU-719
5.8
O
MS1
MS2
100
4.2
O
12.4
S
Colon
SNU-C1
-1.96
X
n.d.
n.d.
0
1.7
O
+1.0
D
Snu-C4
1.0
X
nd
nd
0
-1
X
-1,6
N
snu-C5
nd
X
MS1
MS2
100
nd
X
8
S
Colo320HSR
1.4
X
nd
nd
0
1.6
O
1,3
D
Lovo
-1,9
X
nd
nd
0
1.1
X
-2
N
DLD-1
1.1
X
nd
nd
0
3.5
O
1,1
D
HT-29
*
X
nd
MS2
0
∞
O
*
*
HCT-8
1.0
X
nd
nd
0
1.0
X
1.1
N
HCT-116
1.7
o
MS1
MS2
100
1.6
o
1.6
N
1Sequence smo analizirali z uporabo PCR izdelkov, ki vsebujejo razširjeno MS1 stran, dokazano je, da imajo pomembno vlogo pri MDR1
mRNA izražanja. n.d., ne zazna; * Zelo citotoksična; ∞, kar je v primerjavi z no MDR1 mRNA
izražanja; D, zmanjšal; A, dodatek; S sinergistično; N, ni spremenilo
sliki 5 količinsko na osnovi PCR analizo metilacija želodca in raka debelega črevesa celičnih linij. (A) CpG strani in Hpa II
/MSP sem
mesta v človeškem MDR1
promotorja regiji. Top: Mesta CpG so predstavljeni s kratkimi navpičnimi palicami. Pozicije eksonov 1 in 2 so označeni kot zaprte škatle. Položaj ustreza teh fragmentov, so označeni. Srednja: Hpa II
/MSP sem
strani prepoznavanje so predstavljeni s kratkimi navpičnimi palicami. Dno, PCR primerji, ki se uporabljajo pri analizi metilacijskega. (B) Predstavnik stanje metilacija zaradi tega MDR1
promotorski regiji z analizo, ki temelji na PCR kvantifikacija metilacije v snu-5 (želodca) in HT-29 (debelo črevo). 1: MN, Never-metilirani Hpa II
/MSP sem
mesto na triosefosfat izomeraza promotor gena regiji (negativna kontrola) (240 bp); 2: MC, pozitivna kontrola primerski par (240 bp); 3: MS1, Hpa II
/MSP sem
mesto 1 (121 bp); 4: MS2, Hpa II
/MSP sem
mesto 2 (206 bp)
Učinki 5-aza-2'-deoxcytidine (5AC) in /ali trichostatin A (TSA) na izražanje. MDR1 mRNA v želodcu in raka debelega črevesa celičnih linij
inhibitor 5AC DNA metiltransferaza in histon deacetilaze (HDAC) inhibitor TSA je bilo dobro znano, za lajšanje epigenetsko genov represijo [22]. Ta študija je preučevala učinek 5AC in /ali TSA na MDR1
mRNA izražanja v želodcu in debelem črevesu raka linij. V 10 želodca in 9 debelega rakavih celic, je MDR1
mRNA izražanja določen z RT-PCR, ko jih obdelamo z 2,5 uM 5AC 96 ur in /ali 100 ng /ml TSA za 48 ur. Povečanje je bilo opredeljeno v primerih, ki prikazujejo več kot povečanje za 1,5-krat. Kot je prikazano v tabeli 1, zdravljenje 5AC zvišalo MDR1
ravni mRNA v želodčni rak celičnih linij snu-1, -5, -601, -620, -638 in -719, in da je v HCT-116 debelega črevesa rak celična linija (sliki 6 in 7). Vendar 5AC ni povzročil MDR1
mRNA izraz tudi v snu-16 in snu-C5 in HT-29 celice, katerih MDR1
gen metiliramo. Zdravljenje TSA je povečala MDR1
ravni mRNA v snu-1, -16, -216, -601, -638, -668 in -719 želodčnega raka celičnih linijah in snu-C1, Colo320HSR, DLD-1, H29 in HCT-116 rak debelega črevesa celičnih linij (slika 6 in 7). 5AC pokazala visoko citotoksičnost samostojno ali v kombinaciji z TSA, zlasti v celicah HT-29. Prav tako TSA pokazala visoko citotoksično aktivnost samostojno ali v kombinaciji z 5AC, zlasti v celicah snu-620. Ta študija je preučila tudi posledice kombinirano zdravljenje 5AC s TSA, kar je povečalo MDR1
ravni mRNA aditivno v celicah snu-5 in -638 vendar sinergistično v snu-16, -601, -668, -719 in snu-C5 celice (tabela 1). Slika 6 Aktivacija MDR1 mRNA izražanja 5AC in /ali TSA v želodčnih rakavih celic. Nivo izražanja se izkaže kot razmerje MDR1
/P-aktina. Skupno RNA smo izolirali po zdravljenju z 2,5 uM 5AC za 96 h in /ali 100 ng /ml TSA za 48 ur. RT-PCR smo izvedli z uporabo enake metodologije je prikazano na sliki 1.
Slika 7 Aktivacija MDR1 mRNA izražanja, ki ga 5AC in /ali TSA v različnih celičnih linijah raka debelega črevesa. RT-PCR po zdravljenju celice z 5AC in /ali TSA z uporabo iste metode, opisane na sliki 6. MDR1 /β-aktin
razmerje med pridobljeno po 35 ciklov PCR po TSA v kombinaciji z 5AC, in samo v snu C5 in HT-29 izražanje no MDR1
mRNA, oziroma je izpuščena v histogram.
Ti rezultati kažejo, da je MDR1
mRNA izraz različno urejeno v želodcu in celic raka kolona glede na utišanje MDR1
izražanje skozi epigenetskih mehanizmov, kot so metilacije DNA in /ali histonov Deacetilacijo.
Razprava
v tej raziskavi smo ugotovili, da so bile MDR1
ravni mRNA v želodčni rak celičnih linij bistveno nižje od tistih, ki v celičnih linij raka debelega črevesa, čeprav je bilo nekaj razlike. Ti rezultati so skladni s poročilom, ki kaže, da je Pgp močno izražen na ileum in debelega črevesa, na ravni, ki se postopoma zmanjšuje proksimalno v jejunum, dvanajstniku in želodcu [8]. Since z želodcem in debelega črevesa imela pomembno vlogo pri prebavi in ​​absorpciji, oziroma, da je ni presenetljivo, da were prevozniki such as Pgp različno izražena v dveh normalnih tkivih. Naša ugotovitev, da je razlika izraz MDR1
mRNA v celičnih linijah raka, ki izhajajo iz želodca in debelega črevesa tudi v skladu z objavljenimi poročili [23-26]. Immunopatološke študije so pokazale, da je bila Pgp izraz na človeških tumorjev najpogosteje zazna debelega črevesa, ledvic in nadledvične karcinomov, vendar redko v pljučih in želodcu karcinomov in nekaterimi tumorji zarodnih celic [27].
Tri dvosmerno povezavo med metilacije DNA, kromatin struktura in izražanje genov je bila pred kratkim pregledana [28-30]. Pomembna posledica CpG metiliranja je lokalna utišanje izražanja genov, ki jih lahko posreduje neposrednega vmešavanja metilaciji z vezavo različnih transkripcijskih faktorjev. Zdi glavna sestavina dušenje zvoka genske ekspresije za vezavo metil-CpG-vezivnega proteina 2 (MeCP2), ki ima afiniteto za metil-CPG [31, 32]. DNA demetilacija s 5AC povzroči sproščanje MeCP2 s promotorjem, ki aktivira transkripcijsko izražanje genov [10]. Znano je, da je MeCP2 obogatena tudi v MDR1
promotorja in je povezana z njegovo utišanje [33]. 5AC spreminja metiliranje Vzorec MDR
1 promotor v Pgp negativnih celic, da spominja, da je za PGP-pozitivnih celic in aktivira promotor tako, da je MDR1
mRNA zaznati [34].
V tej študiji, status metiliranje smo analizirali tudi z namenom ugotoviti, ali je MDR1
dušenje zvoka zaradi hypermethylation v promotorski regiji.

• Slikanje pri ocenjevanju jeter in peritonealno metastaze raka želodca: sistematični pregled
• Vstavitev želodca cev z neposrednim prikazom s pomočjo King Vision ™ video Laringoskop: randomizirano, bodoči, klinično preskušanje