Epigenetiniai mechanizmus, diferencinę MDR1mRNA išraiškos tarp skrandžio ir storosios žarnos vėžio ląstelių linijų ir logines klinikiniams chemotherapy

epigenetinius mechanizmus, skirtumas MDR1
iRNR išraiškos tarp skrandžio ir storosios žarnos vėžinių ląstelių linijų ir pagrindžiamos klinikinės chemoterapijos
tezės
Background Bendrovės membraniniai vežėjai tokių kaip P-glikoproteino (Pgp), The MDR1
genų produktas, yra viena iš priežasčių, dėl nesėkmingo gydymo vėžiu sergantiems pacientams. Šiame tyrime, kad Epigenetiniai mechanizmus, skirtumas MDR1
iRNR išraiškos buvo lyginami tarp 10 skrandžio ir 9 gaubtinės žarnos vėžio ląstelių linijų.
Metodai Viesbutis The MDR1
iRNR kiekis buvo nustatomas naudojant PGR ir realiu laiku PGR po atvirkštinės transkripcijos. Citotoksiškumo atlikta naudojant MTT. Metilinimas statusas buvo ištirta kiekybinio PGR pagrįsti metilinimas ir bisulfito DNR sekos analizę.
Rezultatai Viesbutis The MDR1
mRNR lygių, gautų 35 ciklų RT-PCR skrandžio vėžio ląstelių buvo tik panašios į gautas 22 ciklai RT-PCR gaubtinės žarnos vėžio ląstelėse. Realaus laiko PGR analizė parodė, kad MDR1
iRNR nebuvo aptikta 10 skrandžio vėžio ląstelių linijų, bet kintamas MDR1
mRNR lygių 7 9 gaubtinės žarnos vėžio ląstelių linijų, išskyrus SNU-C5 ir HT-29 ląstelių , MTT parodė, kad PGP inhibitoriai, pavyzdžiui, ciklosporinas A, verapamilis ir PSC833 įjautrintos Colo320HSR (storosios žarnos, aukščiausios MDR1
išraiška), bet ne SNU-668 (skrandžio, aukščiausia) ir SNU-C5 (skrandžio, ne išraiška) paklitakseliui. Kiekybinis įvertinimas PGR pagrįstas metilinimas analizė parodė, kad 90% skrandžio vėžio ląstelių, ir 33%, nuo gaubtinės žarnos vėžio ląstelių buvo metilintas, kuris buvo visiškai suderinta su gautų rezultatų bisulfito DNR sekos analizės. 5-aza-2'-deoxcytidine (5AC, DNR metiltransferazės inhibitorius) padidino MDR1
iRNR lygiui 60% skrandžio ląstelių, ir 11% visų gaubtinės žarnos vėžio ląstelėse. Trichostatin A (TSA, histono deacetilazės inhibitorius) padidino MDR1
iRNR kiekį 70% skrandžio vėžio ląstelių ir 55% storosios žarnos vėžinių ląstelių. Kombinuotas gydymas 5AC su TSA padidino MDR1
iRNR lygiui additively 20% skrandžio vėžio ląsteles, bet sąveikauja 40% skrandžio ir 11% storosios žarnos vėžinių ląstelių.
Išvada
Šie rezultatai rodo, kad į MDR1
iRNR lygiui skrandžio vėžio ląstelių yra žymiai mažesnis nei gaubtinės žarnos vėžio ląstelėse, kuris yra bent iš dalies dėl skirtingų epigenetinių reglamentus, pavyzdžiui, DNR metilinimo ir /arba Histonas deacetilinimo. Šie rezultatai gali suteikti geresnį supratimą apie kombinuoto chemoterapija, taip pat jų išgerto vaisto biologinis prieinamumas veiksmingumą.
Background
Skrandžio ir storosios žarnos vėžio yra sergamumo ir mirtingumo priežastis pasaulyje. Jeigu gydomasis chirurginės rezekcija yra neįmanoma, šie vėžio reaguoti labai prastai chemoterapijos ir dėl prastos prognozės. Skrandžio vėžiu sergantiems pacientams, 5-fluorouracilo (5-FU), remiantis derinys chemoterapija buvo bandoma siekiant pagerinti gydymo rezultatus [1]. Su gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio, 5-FU buvo plačiausiai naudojamas vaistas daugiau nei 40 metų. Tačiau, kitų agentų, tokių kaip irinotekano arba oksaliplatina buvo panaudota siekiant pagerinti priešvėžiniai derinio veiksmingumas su [2] 5-FU. 5-FU trukdo su DNR sintezę blokuoja pirimidino nukleotidų dTMP gamybą iš DUMP metu de novo
DNR sintezės per timidilato sintazės slopinimui, taip pat per fluor-nukleotidų įtraukimo į DNR ir RNR [3].
P-glikoproteino (Pgp) koduoja atsparumo daugeliui vaistų 1 (MDR1 pervežimas) geno yra atstovas membrana išsiurbimo siurblį ATP-privalomas kasečių (ABC) transporterių [4-6]. PGP veikia kaip energijos priklauso nuo ištekėjimo siurbliai iš struktūriškai skirtingų chemoterapiniais preparatais, pavyzdžiui, doksorubicino, vinkristino, vinblastino, paklitakseliu, colhicine, aktinomicinas D ir mitomicino C [7], kuris gali sumažinti ląstelėje lygį narkotikų kaupimo įvairovė. Kaip rezultatas, Didelis šių baltymų suteikia MDR į vėžio ląsteles išvengiant citotoksinio narkotikų poveikį. Žmogaus žarnyne, Pgp yra stipriai išreikštos pagal viršūninio paviršiaus paviršinių kolonų epitelio ląstelių klubinės žarnos ir storosios žarnos, ir jos raiškos lygis mažėja palaipsniui proksimaliniu būdu į tuščiosios žarnos, dvylikapirštės žarnos ir skrandžio [8]. Reguliavimas transkripcijos veiklos MDR1
geno priklauso nuo kelių trans veikiantis baltymų, kurie jungiasi su konsensuso cis-elementais [9]. Promotorių elementų į jų jungimosi veiksnių prieinamumą yra reguliuojamas nuožiūra chromatino surinkimo lygiu. Abiejų DNR metilinimo ir Histonas deacetilinant lygiai reguliuoti MDR1
genų ekspresiją [10-12]. Iki šiol, transkripcijos reguliacija MDR1
genų ekspresiją per epigenetinių mechanizmų buvo pranešta raiškos gaubtinės žarnos vėžio ląstelėse [13-16], tačiau nė vienas iš skrandžio vėžio ląsteles. Be to, nebuvo nei tarp transkripcijos išraiška MDR1
genų ekspresiją ir epigenetinių mechanizmų skrandžio ir storosios žarnos vėžinių ląstelių santykiai. Todėl neaišku, kodėl chemoterapijos režimai buvo skirtingai gydomos skrandžio ir storosios žarnos vėžio ir kodėl MDR1
iRNR yra išreiškiamas skirtingai skrandžio ir storosios žarnos vėžinių ląstelių. Todėl šis tyrimas nagrinėjo, ar ne metilinimo lygis tuo promotoriaus svetainėje MDR1
geno yra glaudžiai susijęs su MDR1
genų ekspresijos abiejų vėžinių ląstelių.
Metodų
Mobilusis kultūra
į 10 žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas (SNU-1, -5, -16, -216, -484, -601, -620, -638, -668 ir -719) ir 9 gaubtinės žarnos vėžio ląstelių linijas (SNU-C1, C4, C5, Colo320HSR, Lovo, DLD-1 HT-29, HCT 8 HCT 116) buvo gauti iš vėžio tyrimų centro Seulo nacionalinio universiteto (Pietų Korėja). Visi ląstelės buvo auginamos 37 ° C temperatūroje, 5% CO 2 atmosfera naudojant RPMI 1640 terpę (GibcoBRL Gland Island, NY, JAV) su 10% karščio padarytas neveiklus vaisiaus galvijų serumo (Sigma, ST. Louis, MO, JAV). Ląstelės buvo išlaikytas arba kaip pakaba arba vienasluoksnę kultūros ir persėti, kol jie pasiekė santakoje.
Atvirkštinės transkripcijos-polimerazės grandininė reakcija (PGR) Analizės Viesbutis The viso RNR išskirta naudojant MagExtractor ® už MFX-2100 (Toyobo Osaka, Japonija) Auto-nukleorūgščių gryninimo sistema, pagal gamintojo instrukcijas. MDR1 parsisiųsti ir beta-aktino
iRNR nuorašai buvo aptikta naudojant AT-PGR. MDR1
išraiška buvo aptikta su 5 'ir 3' pradmenys, atitinkantis nukleotidų 907-930 (5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 ') ir 1179-1201 (5'-TGCCAAG-ACCTCTTCAGCTACTG-3'), atitinkamai, iš paskelbta kDNR seka [17], taip gaunant 296-bp PGR produktą. β-aktino
mRNR išraiška buvo naudojamas kaip RNR suma kontrolės, ir buvo aptikta su 5 'ir 3' pradmenys, atitinkantis nukleotidų 1912-1932 (5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 ') ir 2392-2412 ( 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3 "), atitinkamai, paskelbto kDNR seka [18], duoda 501-bP PGR produktą. RNR iš kiekvieno mėginio buvo atvirkštinio aranžuotus, pavyzdžiui, naudojant 200 vienetų Moloney pelių leukemijos viruso atvirkštinės transkriptazės (Gibco-Bethesta tyrimų laboratorijos, Grand Island, NY, JAV) ir 0,18 g /ml oligo (dT 20) gruntas 1 val ne 37 ° C temperatūroje. Gautas kDNR iš skrandžio vėžio ląstelių (2-kartus atskiesti cDNR į gaubtinės žarnos vėžio ląstelėse) buvo papildyta su 1,25 vienetų Taq polimerazės (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 1 mM MgCl 2 ir 10 pmol kiekvieno pradmens į termocikleriu (GeneAmp 2400, PE Applied Biosystems, Bostonas, MA, JAV) 22 ciklų su storosios žarnos vėžinių ląstelių, bet 35 ciklų su skrandžio vėžio ląstelių MDR1 parsisiųsti ir 17 ciklų beta-aktino
iš eilės denatūruojant (94 ° C temperatūroje 30 s), atkaitinimo (65 ° C MDR1
, 53 ° C temperatūroje beta-aktino
), ir išplėtimas (72 ° C temperatūroje 30 s). Po to, kai Galutinio ciklo, visi PGR produktai buvo atliktas paskutinį kartą pratęsti 5 min 72 ° C temperatūroje. Dėl kiekybinio, 3 μCi iš [α- 32P] dCTP buvo įtraukta į kiekvienos reakcijos mišinio. Po to, kai PGR, PGR produktai buvo sujungti ir tada elektroforeze ant 7,5% nondenaturing poliakrilamido gelyje. Juostos buvo nuskaitomi densitometru (PDI, Huntington Station, NY, JAV). Kiekvieno iRNR stenograma suma buvo normalizuotas su tuo kiekvienos beta-aktino pervežimas mRNR.
Baltymai gavybos ir Vakarų dėmė analizė
Total ląstelių fragmentai buvo parengta lizuoja paruoštos ląstelių išgavimo buferiniu tirpalu (1% NP-40 , 0,5% natrio deoksicholatas, 0,1% SDS tirpalo fosfato buferio fiziologiniu tirpalu), papildytoje su 2 mM fenilmetilsulfonilfluoridą fluoridą (Sigma), ir 10 mikrogramų /ml leupeptiną (Sigma),. DNR buvo šlyties jėgos, ultragarsu ir Western blotingo analizė buvo atlikta naudojant šiek tiek pakeisti metodo pirmasis aprašytą Towbin et al. [19]. Baltymai buvo perkelti ant nitroceliuliozės membranos electroblotting naudojant 60 V per naktį srovę. Membrana buvo inkubuojami blokuojančiu tirpalu (5% lieso pieno) už 1 val kambario temperatūroje, plauti, ir tada inkubuojami su pirminės ožkų polikloninio antikūno (1: 1000, Santa Cruz, biotechnologijos, CA, USA) Pgp. Membrana buvo išplauti ir inkubuojami su krienų peroksidazės-konjuguoto antrinio antikūno (praskiestas santykiu 1: 1000) su kiekvieno lgG šeimininkų pirminių antikūnų 1 val. tada membrana buvo dažomi aptikimo reagentu ECL nustatymo rinkinys (Amersham, Piskatavėjus NJ, JAV).
Realaus laiko PGR
gavyba mRNR buvo atlikta pagal RNeasy proctocol (Qiagen, Hilden, Vokietija ). Vienas mikrogramų visos RNR buvo transkribuoti į kDNR pagal 20 įxL tūrio 200 vienetų Moloney pelių leukemijos viruso atvirkštinės transkriptazės (Lanksčiai-Bethesta tyrimų laboratorija, Grand Island, NY, JAV) ir 0,18 g /ml, oligo (dT 20) gruntai (Promega, Madison, JAV) pagal gamybos vadove. Realaus laiko PGR buvo atliekama su šviesa Jutiklis ciklų 2.0 priemonę (Roche, Manheimas, Vokietija), naudojant skubios pradžios DNR Master SYBR Green I rinkinį (Roche). Tikrinimo metu, teisingai amplifikacijos produkto, PGR reakcijų buvo analizuojama 2% agarozės gelyje tamsintas su etidžio bromido. Pradmenų sekos yra taip: už beta-aktino
, 5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 'ir 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3'; už MDR1
, 5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 "ir 5'-TGCCAAGACCTCTTCAGCTACTG-3". Kiekvienas reakcija (20 pl) pateikta 4 iL kDNR (10 kartų praskiedimas), 4 mm MgCl 2, 10 pmol kiekvieno pradmens ir 2 mikrol Fast Pradėti DNR Master SYGR Žaliosios I Mix, kurių sudėtyje yra buferis, dNTP, SYBR Žalioji dažai ir Gairė polimerazė. Amplifikacijos procedūra tikslinių genų buvo taip: iš anksto-denatūravimo 95 ° C temperatūroje 10 min, 40 ciklų denatūravimo 95 ° C temperatūroje 15 sek, atkaitinimo dėl MDR1
čia C (beta-aktino
67 ° 55 ° C) 5 sek, ir pratęsti 72 ° C 7 sek (β-aktino pervežimas už 21 sek). Lydymosi kreivė analizė buvo atliekama siekiant patvirtinti gamybą vienu produktu. Neigiami kontroliniai mėginiai be šablono buvo gaminami kiekvienam matavimui. Genų ekspresijos, vertės (santykiniai iRNR lygiui) yra išreikšti kaip santykį (skirtumas tarp Ct reikšmių = taškas kreivės, kurioje fluorescencijos suma pradeda greitai padidinti, paprastai keli standartiniai nuokrypiai virš bazinės linijos, yra vadinami slenkstinis ciklas ( Ct reikšmė).) tarp interesų geno (MDR1
iRNR) ir vidaus atskaitos geno (β-aktino pervežimas mRNR), kad suteikti normalizavimo faktorius RNR kiekio izoliuotas nuo pavyzdžio. Duomenų analizė atlikta naudojant šviesos Jutiklis ciklų programinės įrangos versija 4.0 (Roche).
Citotoksiškumas tyrimas naudojant MTT
in vitro
citotoksiškumo iš narkotikų buvo matuojamas naudojant MTT, kaip aprašyta kitur [20]. Ląstelės buvo pasėjamos esant 2 × 10 4cells /ml ir inkubuojami per naktį, kad būtų galima pritvirtinti ir stabilizavimui. Ląstelės buvo inkubuojamos 37 ° C temperatūroje 3 dienas, ir MTT [3- (4,5-dimethylthiazole-2-il) -2,5-difenil tetrazolio bromidas, Sigma] tirpalas buvo po to pridedama į kiekvieną šulinėlį, kurių sudėtyje yra ląsteles. Po to, kai purtant 1 min, plokštelė buvo inkubuojamos 5 val. Formazano kristalai suspensijos kultūroje buvo ištirpinta 150 pL dimetilsulfoksido (DMSO), nuėmus supernatantą. Optinis tankis šulinių buvo matuojamas mikroplokštelių skaitytojui (μQuant, "Bio-Tek Instruments Inc, WINOOSKI, VT, JAV) 540 nm.
Kiekybinis PCR-paremtą metilinimo analizės
Penkių mikrogramų genomo DNR skaldoma su 50 U iš MSP
i arba Hpa
II ( "Fermentas RP, Vilnius, Lietuva) 37 ° C temperatūroje 16 valandų, pridėta prie 1/15 tūrio 0,6 M Tris (pH 7,5) ir 1,5 M NaCl ir suardomas 50 U PST
i (New England Biolabs, MA, JAV) 37 ° C temperatūroje 8 valandas. Metilinimo statusas MDR1
5'CpG promotoriaus regione buvo nagrinėjama analizuojant 100 ng restrikcijos-suardomas DNR PGR 25 iL reakcijų, kurių sudėtyje yra 1,25 vieneto Taq DNR polimerazės ir 10 pmol kiekvieno gruntu. Quantification PGR pagrįstas metilinimas analizė buvo atlikta pagal metodą, apie kurį pranešama anksčiau [11]. PCR pradmenys naudojami buvo 5'-TCTAGAGAGGTGCAACGGAAG-3 'ir 5'-TCAGCCTCACCACAGATGAC-3' už MS1 metilinimo-jautrus pradmenų (121 bp), 5'-TGAAGTCCTCTGGCAAGTCC-3 'ir 5'-ATTCTCCCTCCCGGTTCC-3' už MS2 metilinimo jautrus gruntai (206 bp), 5'-ATTTCACGTCTTGGTGGCC-3 "ir 5'-TCCAGTGCCACTACGGTTT-G-3'for MC teigiamus kontrolinius gruntai (240 bp) ir 5'-GGCGAAGGAGGT-TGTCTATTC-3" ir 5 " -AACGTTCTAGGAGAGTCGGG-3 "už MN neigiamus kontrolinius pradmenis (240 bp), gautų iš triosephosphate izomerazė geno promotoriaus regione. Amplifikacija buvo atliktas DNR termocikleriu 35 ciklų per MN, MC, MS1 ir MS2 gruntų dalyvauja seka denatūravimo (95 ° C 30 S), atkaitinimo (60 ° C 30 S), ir pratęsiamas (72 ° C 30 s). Po to, kai Galutinio ciklo, visi PGR produktai buvo atliktas paskutinį kartą pratęsti 5 min 72 ° C temperatūroje. PGR produktai buvo atskirti elektroforezės 7% PUSLAPIS geliai. Tuomet geliai buvo tamsintas etidžio bromido, ir fotografuojami naudojant Kodak vaizdo station 4000 mm (Eastman Kodak, Rochester, NY, JAV).
bisulfite DNR sekvenavimo analizę
Vienas mikrogramų genomo DNR buvo chemiškai modifikuotas natrio bisulfite naudojant EZ DNR metilinimas rinkinį (Zymo tyrimai, oranžinė, CA, JAV) konvertuoti nedenatūruotą cytosines į uracilai paliekant denatūruoti cytosines nepakitusį. Bisulfito modifikuotas DNR buvo naudojamas PGR. Extended MS1 gruntas yra 10 CpG svetaines, ir 2 SP-1 svetaines, kurios yra privalomos funkcinė MDR1
rengėjas būti įjungta [21]. Pradmenys sekų amplifikacija bisulfito gydytų gijų (223 bp) buvo taip: S: 5'-GGAAGTTAGAATATTTTTTTTGGAAAT-3 '; AS: yra 5'-ACCTCTACTTCTTTAAACTTAAAAAAACC-3 '. Amplifikacija buvo atliekama toje pačioje PGR sąlygomis, išskyrus 48 ° C atkaitinimo temperatūros ir 45 PGR ciklų. Po to, kai Galutinio ciklo, visi PGR produktai buvo atliktas paskutinį kartą pratęsti 72 ° C temperatūroje 5 min. Seka PGR produktų buvo analizuojami naudojant automatizuotą sekwencer (taikoma BIOSYSTEMS, Foster City, CA, JAV).
Statistinė analizė Viesbutis The rezultatai yra pateikiami kaip vidurkis ± SE ir duomenys buvo analizuojami naudojant Stjudento t-testas
. P vertes < 0,05 buvo laikomas reikšmingu.
Rezultatai
palyginimas ekspresijos profilius MDR1 mRNR skrandžio ir storosios žarnos vėžinių ląstelių
MDR1
iRNR išraiškos buvo analizuojami naudojant RT-PGR ekspresijos lygis yra normalizuotas su beta-Aktinis
iRNR lygiai gauti po 17 ciklų PGR. Į MDR1
iRNR nebuvo aptikta po 22 ciklų PGR 10 skrandžio vėžio ląstelių linijų, bet gali būti aptikta skirtingų lygių po 35 ciklų PGR su SNU-16, išskyrus tai rodo labai mažą MDR1
iRNR raiška išbandytų skrandžio vėžio ląsteles (1 paveikslas). Kaip parodyta 1 paveiksle, eilės tvarka pagal MDR1-beta-aktino pervežimas santykis skrandžio vėžio ląstelių linijų taip: SNU-668 (1.51) > SNU-484 (1.37) > SNU-5 (0,63) > SNU-601 (0.33) > SNU-719 (0.32) > SNU-216 (0.29) > SNU-638 (0.07) > SNU-1 (0,04) > SNU-16 (0). Iš 9 gaubtinės žarnos vėžio ląstelių linijų, kintamo MDR1
iRNR lygis gali būti nustatytas 7 gaubtinės žarnos vėžio ląstelių linijas po 22 ciklų PGR, bet ne SNU-C5 ir HT-29 ląstelių. Į MDR1
mRNR paskutinių dviejų ląstelių gali būti neaptinkamas net po 35 ciklų PGR. Šie rezultatai rodo gana aukštą lygį MDR1
iRNR išraiškos nepaisant kai kurių į gaubtinės žarnos vėžio ląstelėse išimtis. Kaip parodyta 2 paveiksle, eilės tvarka pagal MDR1 pervežimas /beta-aktino pervežimas santykis gaubtinės žarnos vėžio ląstelių linijų yra taip: Colo320HSR (0,90) > SNU-C4 (0,45) > HCT-8 (0,26) > SNU-C1-(0,12) > HTC-116 (0,11) > Lovo (0,10) > DLD-1 (0,07) > SNU-C5-(0) = HT-29 (0). 1 pav MDR1 iRNR raiška skrandžio vėžio ląstelių linijas. Iš MDR1
mRNR ekspresijos lygis buvo nustatomas pagal RT-PCR, ir normalizuoti, kad mRNR dalimi, beta-Aktinis
, kuris buvo naudojamas kaip RNR kontrolės. KDNR realizuosis-transkripcija nuo iRNR buvo papildyta atskirai su kiekvienu pradmenų pora, MDR1
ir beta-aktino
genuose. Mėginiai, kiekvieną PGR reakcijos mišinio buvo atskirtos nuo 7% poliakrilamido gelyje. Gelis džiovinti ir veikiami rentgeno juostą nakties.
2 paveikslas MDR1 iRNR išraiška gaubtinės žarnos vėžio ląstelių linijos. buvo naudojama ta pati metodika, pranešė 1 paveiksle.
Mes vėl atlikti realaus laiko PGR tyrimas kiekybiniam įteisinimo MDR1
mRNR lygių, gautų iš AT-PGR metodu. Į MDR1
iRNR nebuvo aptikta 10 skrandžio vėžio ląstelių linijas. Tačiau iš 9 gaubtinės žarnos vėžio ląstelių linijų, kintamo MDR1
iRNR lygis gali būti nustatytas 7 gaubtinės žarnos vėžio ląstelių linijų, išskyrus SNU-C5 ir HT-29 ląstelių, kaip ir AT-PGR duomenis (3 pav.) 3 pav MDR1 iRNR raiška skrandžio ir storosios žarnos vėžio ląstelių linijas. Iš MDR1
mRNR ekspresijos lygis buvo nustatomas pagal realaus laiko RT-PCR, ir normalizuoti, kad mRNR dalimi, beta-Aktinis
, kuris buvo naudojamas kaip RNR kontrolės. KDNR realizuosis-transkripcija nuo mRNR buvo papildyta atskirai su kiekvienu pradmenų pora, MDR1
ir beta-aktino
genuose.
Paimta kartu, MDR1
iRNR lygiai skrandžio vėžio ląstelių linijų buvo žymiai mažesnės nei dvitaškis vėžio ląstelių linijas.
Chemosensitizing poveikis PGP inhibitorių skrandžio ir storosios žarnos vėžinių ląstelių
Nors baltymų koncentracijos nebuvo nagrinėti šiame tyrime, funkciniai tyrimai buvo atlikti naudojant PGP inhibitorių skrandžio ir storosios žarnos vėžio ląstelių linijas aukščiausio lygio MDR1
iRNR raiška. Kaip parodyta 4A paveiksle, Colo320HSR ląstelių (storosios žarnos, mutantas p53, aukščiausia išraiška MDR1
mRNR) buvo 14 kartų ir > 200 kartų atsparios paklitakseliu nei SNU-C5, ir SNU-668 ląstelių (skrandžio, mutantas p53, aukščiausia išraiška MDR1
mRNR), lyginant remiantis IC 50 vertės, atitinkamai, atstovaujantys didelę skirtumu į PGP lygiais. Be to, iš Colo320HSR ląstelių paklitakseliui pasipriešinimas buvo atstatomi PGP inhibitoriais, įskaitant ciklosporiną A, verapamilis ir PSC833 (4B pav.) Tačiau šis atstatymas nebuvo pastebėta SNU-C5 (storosios žarnos, jokių MDR1
iRNR) ląstelės taip pat SNU-668. Tai rodo, kad Pgp išreikštas gaubtinės žarnos vėžio ląstelėse, bet ne skrandžio vėžio ląstelės darbai funkciškai ir gali būti slopinamas P-gp inhibitoriais. 4 pav Palyginimas PGP saviraiškos ir funkcijos skrandžio ir storosios žarnos vėžio ląstelių linijas. (A), Lyginamoji jautrumas Colo320HSR (gaubtinės žarnos, didžiausia), SNU-668 (skrandžio, aukščiausios) ir SNU-C5 (gaubtinės žarnos, ne išraiška) paklitakseliui; (B) Poveikis gp inhibitoriais dėl Colo320HSR, SNU-668 ir SNU-C5 jautrumas paklitakseliui (IC10 koncentraciją; 50 mkm, 0,3 nM iki 0,5 nM, atitinkamai). Jautrumas paklitakseliu buvo nustatoma naudojant MTT į buvimą ar nebuvimą PGP inhibitoriais (ciklosporino A, verapamilis ir PSC833 0,8 mikromolių kiekvienam). . *, P < 0,05, palyginti su kontrolės
Palyginimas metilinimo būklės MDR1 skrandžio ir storosios žarnos vėžio ląstelių
metilinimas statusas buvo nustatomas pagal kiekybinis įvertinimas PGR pagrįstas metilinimo analizės CpG-turtingą domeno būti maždaug 1 kb, kurių sudėtyje yra Exon 1 ir introną 1 tarp šio MDR1
rengėjas. Norėdami nustatyti metilinimo vykdomos MDR1
geno promotoriaus regione laipsnį, du pradmenis (MS1 ir MS2) Kurių sudėtyje MSP
Aš /hPa
II vietos buvo skirtos iš egzono 1 intronas 1, atitinkamai. Pradmenų pora, MC buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė, siekiant nustatyti šaltinio genominės DNR kokybę. Priešingai, MN, kad kerta MSP
i /hPa
II puslapį į triosephosphate izomerazę geno promotoriaus regione ir niekada denatūruotas buvo naudojamas kaip neigiama kontrolė. 5B pav rodo tipiškas kiekybinis PCR-pagrįstus metilinimas analizės vaizdus SNU-5 (skrandžio) ir HT-29 (storosios žarnos) ląsteles. Kiekybinio PGR pagrįstas metilinimas analizė atskleidė, kad bet kokie PGR produktai MS1 ir MS2 nebuvo pagaminti iš Pst pervežimas 1-suardomas genomo DNR gydomi MSP
i (metilinimas-nejautrus fermentų). Kita vertus, PGR produktų, skirtų MS1 ir MS2 į SNU-5 ląstelių, tačiau PGR produktu MS1 vieni HT-29 ląstelių buvo gauti po to, kai hPa
II (metilinimas-jautrus fermento) gydymas, nurodant metilinimas iš CPG tuo MS1 ir MS2 tinklapiø SNU-5 ląstelių ir tik MS2 svetainės HT-29 ląstelių. Kaip apibendrinti 1 lentelėje, metilinimas buvo aptiktas prie MS1 ir MS2 svetainėse 9 skrandžio vėžio ląstelių linijų su SNU-484, bet 2 (SNU-C5, ir HCT-116), išskyrus iš 9 gaubtinės žarnos vėžio ląstelių linijų. Kita vertus, HT-29 ląstelės buvo metilintas tik tuo MS2 vietoje. SNU-C5-HT-29 (storosios žarnos) ir SNU-16 (skrandžio) ląstelės negali išreikšti MDR1
iRNR buvo denatūruotas. Bisulfito DNR sekos analizė buvo atliekama siekiant patvirtinti metilinimas. Kaip rodo 1 lentelėje, 10 CpG svetainių išeikvojo MS1 svetainėje yra visiškai suderintų su gautais rezultatais kiekybinio metilinimo lygio (%) PGR pagrįstas metilinimas analysis.Table 1 Metilinimas statusas ir iš 5AC ir /ar TSA poveikis MDR1
iRNR raiška ir įvairių skrandžio ir storosios žarnos vėžio ląstelių linijų
<-asis>



DNR metilinimo tyrimo




audinių
ląstelių linija
5AC
restrikcijos fermento
Natrio bisulfite
TSA

5AC + TSA


Sulenkite
poveikis
Svetainės
laipsnį (%)1

Fold

Effect

Fold

Effect

Gastric
SNU-1
32.6
O
MS1
MS2
100
20.7
O
+23.6
D
SNU-5
5,8
O
MS1
MS2
100
1.03
X
6,8

SNU-16
asis
X
MS1
MS2
60
8,4
O
28,9
S
SNU-216
-1,0
X
MS1
MS2
50 8.4
O
8,2
N.
SNU-484
-1,3
X
- -
0
-5,1
X
-0,17 -
SNU-601
3,2
O
MS1
MS2
100
3,3
O
13,7
S
SNU-620
67,6
O
MS1
MS2
100
*
X
*
*
SNU-638
68,9
O
MS1
MS2
100
5,7
O
72,9

SNU- 668
-1,0
X
MS1
MS2
80
O
4,4
S
1,8 SNU-719
5.8
O
MS1
MS2
100
4.2
O
12.4
S
Colon
SNU-C1
-1.96
X
n.d.
n.d.
0
1.7
O
+1.0
D
SNU-C4-
1,0
X
asis
asis
0
-1
X
-1,6
N.
SNU-C5-
-asis
X
MS1
MS2
100
asis
X
8
S
Colo320HSR
1,4
X
asis
-asis
0
1,6
O
1,3
D
Lovo
-1,9
X
asis
asis
0
1,1
X
-2
N
DLD-1
1,1
X
asis
asis
0
3,5
P
1,1
D
HT-29
*
X
asis
MS2
0
∞
O
*
*
HCT 8
1,0
X
asis
asis
0
1,0
X
1,1
N
HCT 116
1,7
O
MS1
MS2
100
1,6
O
1,6
N.
1Sequence buvo analizuojami naudojant PGR produktus, kurių sudėtyje išplėstą MS1 svetainę, kuri buvo įrodyta, kad svarbų vaidmenį MDR1
iRNR raiška. Be žymenys datos, neaptiko; * Labai citotoksinis; ∞, padidėjimas, palyginti su ne MDR1 mRNR
išraiška; D sumažėjo; A priedas; S sinergetinis; N nepasikeitė
5 paveiksle kiekybinio PGR pagrįstas metilinimas analizė skrandžio ir storosios žarnos vėžio ląstelių linijas. (A), CpG svetaines ir Hpa II
/Msp Aš
svetainių žmogaus MDR1
promotoriaus regione. Viršuje: CpG svetainės atstovauja trumpų vertikalių strypų. Į egzonų 1 ir 2 pozicijos yra nurodytos kaip uždaros dėžės. Padėtyje, atitinkančioje šių fragmentų yra nurodyta. Vidurio: Hpa II
/Msp Aš
pripažinimo svetainės atstovauja trumpų vertikalių strypų. Apačia, PGR pradmenis, naudojami metilinimo analizei. (B), atstovas metilinimas statusas MDR1
promotoriaus regione kiekybinis PCR-paremtą metilinimo analizės SNU-5 (skrandžio) ir HT-29 (dvitaškis). 1: MN, niekada denatūruotas Hpa II
/Msp Aš Svetainės tuo triosephosphate izomerazę geno promotoriaus regione (neigiamas kontrolė) (240 bp); 2: Ar MC, teigiama kontrolė pradmenų pora (240 bp); 3: MS1, Hpa II
/Msp Aš Svetainės 1 (121 bp); 4: MS2, Hpa II
/Msp Aš Svetainės 2 (206 bp)
effects 5-aza-2'-deoxcytidine (5AC) ir /arba trichostatin A (TSA) į laisvę. MDR1 iRNR skrandžio ir storosios žarnos vėžio ląstelių linijas
DNR metiltransferazės inhibitorius 5AC ir histono deacetilazės (HDAC) inhibitorius TSA buvo gerai žinoma, kad sumažinti epigenetinius genų represijas [22]. Šis tyrimas nagrinėjo 5AC ir /ar TSA poveikį MDR1
iRNR raiška skrandžio ir storosios žarnos vėžio linijas. 10, skrandžio ir 9 storosios žarnos vėžinių ląstelių, MDR1
iRNR raiška nulėmė RT-PCR po gydymo jas su 2,5 mikromolių 5AC 96 val ir /arba 100 ng /ml TSA 48 val. Padidėjimas buvo apibrėžta atvejais Rodoma daugiau nei 1,5 karto padidėjo. Kaip parodyta 1 lentelėje, 5AC gydymas padidino MDR1
iRNR lygiai su SNU-1, -5, -601, -620, -638 ir -719 skrandžio vėžio ląstelių linijas, ir kad HCT 116 storosios žarnos vėžio ląstelės linija (6 ir 7 paveikslai). Tačiau 5AC nesukėlė MDR1
iRNR raiška net SNU 16 ir SNU-C5 ir HT-29 ląstelių, kurių MDR1
genas buvo denatūruotas. TSA gydymas padidino MDR1
iRNR lygius SNU-1, -16, -216, -601, -638, -668 ir -719 skrandžio vėžio ląstelių linijų ir SNU-C1, Colo320HSR, DLD-1, H29 ir HCT 116 storosios žarnos vėžio ląstelių linijas (6 ir 7 pav). 5AC parodė aukštą citotoksinį poveikį atskirai arba kartu su TSA, ypač HT-29 ląstelių. Be to, TSA parodė labai citotoksinis aktyvumas atskirai arba kartu su 5AC, ypač SNU-620 ląstelių. Šis tyrimas taip pat išnagrinėjo Kombinuotosios gydymo 5AC su TSA, kuri padidino MDR1
iRNR lygiui additively į SNU-5 ir -638 ląstelių, tačiau poveikis sinergiškai į SNU-16, -601, -668, -719 ir SNU-C5 ląstelės (1 lentelė). 6 pav aktyvavimas MDR1 iRNR išraiškos 5AC ir /ar TSA skrandžio vėžio ląsteles. Sąvoka lygis pranešė kaip MDR1 pervežimas /beta-aktino santykis. Bendras RNR buvo išskirta po gydymo 2,5 mkm 5AC 96 val ir /arba 100 ng /ml TSA 48 val. AT-PGR buvo atliekama naudojant tą pačią metodiką pranešė 1 pav 7
pav aktyvavimo MDR1 iRNR išraiškos pagal 5AC ir /ar TSA įvairiose gaubtinės žarnos vėžio ląstelių linijų. AT-PGR po gydant ląstelių 5AC ir /ar TSA naudojant tą patį metodą, aprašytą 6 pav MDR1 /β-aktino
santykis gaunamas per 35 ciklo PGR po TSA kartu su 5AC ir vienas SNU C5 ir HT-29 išreikšdami nė MDR1
iRNR, atitinkamai, buvo praleista histogramos.
Šie rezultatai rodo, kad MDR1
iRNR raiška diferencijuotai reguliuojama skrandžio ir storosios žarnos vėžinių ląstelių dėl su triukšmo slopinimo MDR1
išraiška per epigenetinių mechanizmų, tokių kaip DNR metilinimo ir /arba iuose deacetilinant.
diskusijų
šiame tyrime, mes nustatėme, kad MDR1
iRNR lygiai skrandžio vėžio ląstelių linijų buvo žymiai mažesnis nei į gaubtinės žarnos vėžio ląstelių linijų, nors buvo kai kurie variantai. Šie rezultatai atitinka ataskaitą, įrodančią, kad Pgp stipriai išreikštos klubinės žarnos ir storosios žarnos, iki tokio lygio, kad palaipsniui mažėja proximally į tuščiosios žarnos, žarnos ir skrandžio [8]. Nuo skrandžio ir storosios žarnos žaisti pagrindinius vaidmenis virškinimo ir įsisavinimo, atitinkamai, tai nenuostabu, kad vežėjai, pvz Pgp buvo skirtingai išreiškiama dviejų normalių audinių. Mūsų išvada, kad skirtumas išraiška MDR1
mRNR vėžio ląstelių linijas, gautų iš skrandžio ir storosios žarnos taip pat dera su paskelbtais pranešimais [23-26]. Imunopatologinių tyrimai parodė, kad Pgp išraiška žmogaus navikų buvo dažniausiai aptinkami storosios žarnos, inkstų ir antinksčių karcinoma, bet retai plaučių ir skrandžio karcinoma ir tam tikrų lytinių ląstelių navikų [27].
Trijų pakopų ryšį tarp DNR metilinimo, chromatino struktūra ir genų ekspresijos neseniai buvo peržiūrimos [28-30]. Svarbus pasekmė CpG metilinimo yra vietos triukšmo slopinimo iš genų ekspresiją, kuris gali būti tarpininkaujant tiesioginio įsikišimo metilinimo su įvairių transkripcijos faktorius privalomas. Pasirodo pagrindinis komponentas slopinimo genų išraiškos turi būti privalomas ir metil-CpG sujungiančio baltymo 2 (MeCP2), kuri turi metilo-CPG [31, 32] pažiūras. DNR demetilinimu 5AC sukelia MeCP2 išsiskyrimą iš promotoriaus, kuris aktyvuoja transkripcijos genų ekspresiją [10]. Ji yra žinoma, kad MeCP2 yra taip pat praturtintas dėl MDR1
promotoriaus ir yra susijusi su jo nuslopinami [33]. 5AC keičia metilinimo modelis iš MDR
1 promotoriaus ir PGP neigiamas ląstelių panašūs, kad PGP teigiamas ląsteles ir aktyvuoja rengėjas toks, kad MDR1
iRNR yra aptinkamas [34].
Šiame tyrime metilinimo statusas taip pat buvo analizuojami siekiant nustatyti, ar MDR1
triukšmo slopinimo yra dėl to, hypermethylation Promotorių regione.

• Vaizdo vertinant kepenų ir pilvaplėvės metastazės: sisteminė apžvalga
• Skrandžio vamzdis įterpimas pagal tiesioginio matomumo naudojant karalius Vizija ™ vaizdo laryngoscope: atsitiktinių imčių, būsimasis klinikiniame tyrime