Epigenetiske mekanismene som er involvert i differensial MDR1mRNA uttrykk mellom mage og tykktarm kreft cellelinjer og begrunnelser for klinisk chemotherapy

epigenetiske mekanismene som er involvert i differensial MDR1
mRNA uttrykk mellom mage og tykktarm kreft cellelinjer og begrunnelser for klinisk kjemoterapi
Abstract
Bakgrunn Bedrifter den membran transportører som P-glykoprotein (Pgp), MDR1
genproduktet, er en av årsakene til behandlingssvikt hos kreftpasienter. I denne studien ble epigenetiske mekanismene som er involvert i differensial MDR1
mRNA uttrykk sammenlignet mellom 10 mage og 9 tykktarmskreft cellelinjer.
Metoder
MDR1
mRNA nivåer ble bestemt ved hjelp av PCR og real-time PCR-analyser etter revers transkripsjon. Cytotoksisitet ble utført ved anvendelse av MTT-analysen. Metylering status ble utforsket av kvantifisering PCR-basert metylering og bisulfite DNA-sekvense analyser.
Resultater
MDR1
mRNA nivåer oppnådd ved 35 sykluser av RT-PCR i mage kreftcellene var bare sammenlignes med de som oppnås ved 22 sykluser av RT-PCR i tykktarm kreft celler. Real-time RT-PCR-analyse viste at MDR1
mRNA ikke ble påvist i 10 mage kreft cellelinjer, men variabel MDR1
mRNA nivåer i 7 av 9 tykktarm kreft cellelinjer, bortsett fra SNU-C5 og HT-29 celler . MTT analyse viste at Pgp-hemmere som cyklosporin A, verapamil og PSC833 sensitivisert Colo320HSR (colon, høyeste MDR1
uttrykk), men ikke SNU-668 (mage, høyest) og SNU-C5 (mage, ingen uttrykk) til paclitaxel. Kvantifisering PCR-baserte metylering analyse viste at 90% av magekreftceller, og 33% av kolon kreftceller ble metylert, som ble fullstendig matchet med resultatene oppnådd med bisulfitt DNA-sekvensanalyse. 5-aza-2'-deoxcytidine (5AC, en DNA metyltransferase hemmer) økte MDR1
mRNA nivåer i 60% av mage celler, og i 11% av tykktarmskreftceller. Trichostatin A (TSA, histondeacetylase hemmer) økte MDR1
mRNA nivåer i 70% av magekreftceller og 55% av tykktarmskreftceller. Den kombinerte behandlingen av 5AC med TSA økt MDR1
mRNA nivåer additivt i 20% av magekreftceller, men synergi i 40% av mage og 11% av tykktarmskreftceller.
Konklusjon
Disse resultatene indikerer at MDR1
mRNA-nivåer i magekreftcellene er betydelig lavere enn de i kolon kreftceller, som er i det minste delvis på grunn av ulike epigenetiske forskrifter som for eksempel DNA-metylering og /eller histon deacetylering. Disse resultatene kan gi en bedre forståelse av effekten av kombinert kjemoterapi samt deres oral biotilgjengelighet.
Bakgrunn
Gastric og kolorektal kreft er en årsak til sykelighet og dødelighet i verden i dag. Hvis en kurativ kirurgisk reseksjon er umulig, er disse kreftformer som reagerer meget dårlig på kjemoterapi og resulterer i en dårlig prognose. I mage kreftpasienter, har 5-fluorouracil (5-FU) basert kombinasjon kjemoterapi vært forsøkt for å bedre behandlingsresultatene [1]. Med tykktarmskreft, har 5-FU vært det mest brukte stoffet i mer enn 40 år. Imidlertid har andre midler, for eksempel irinotecan eller oksaliplatin blitt brukt til å forbedre antitumor effekt i kombinasjon med 5-FU [2]. 5-FU griper inn med DNA-syntese ved å blokkere produksjonen av pyrimidin-nukleotid-dTMP fra dump i løpet av de novo
DNA-syntese ved hemning av tymidylatsyntase, så vel som ved inkorporering av fluor nukleotider i DNA og RNA [3].
P-glykoprotein (Pgp) kodet for av multimedikamentresistens 1 (MDR1
) genet er et representativt membran efflukspumpen av ATP-bindende kassett (ABC) transportører [4-6]. Pgp fungerer som energiavhengige efflukspumper av en rekke strukturelt forskjellige kjemoterapeutiske midler, for eksempel doksorubicin, vinkristin, vinblastin, paclitaxel, colhicine, actinomycin D og mitomycin C [7], noe som kan redusere det intracellulære nivå av medikament akkumulering. Som et resultat av over-ekspresjon av disse proteinene confers MDR til kreftceller ved å gå utenom den cytotoksiske effekten av legemidler. I tarmen, er Pgp uttrykkes sterkt på den apikale overflate av den overfladiske søyle epitelceller i ileum og kolon, og dets ekspresjon nivået synker gradvis proksimalt inn i jejunum, tolvfingertarmen og mage [8]. Regulering av den transkripsjonelle aktivitet av MDR1
gen er avhengig av flere trans-virkende proteiner som binder konsensus cis-elementer [9]. Tilgjengeligheten av promotorelementene til deres bindings faktorer reguleres på nivået av kromatin sammenstillingen. Nivåene av både DNA metylering og histon deacetylering regulere MDR1
genekspresjon [10-12]. Så langt har transcriptional regulering av MDR1
genuttrykk gjennom epigenetiske mekanismer blitt rapportert i uttrykk i tykktarm kreft celler [13-16], men ingen i mage kreftceller. Videre er forholdet mellom transkripsjons uttrykk for MDR1
genekspresjon og epigenetiske mekanismer i mage og tykktarm kreft celler ikke blitt sammenlignet. Derfor er det uklart hvorfor kjemoterapiregimer har vært annerledes brukes til å behandle mage og kolorektal kreft og hvorfor MDR1
mRNA uttrykkes forskjellig i mage og kolorektal kreft celler. Derfor denne studien undersøkte hvorvidt graden av metylering ved arrangøren stedet av MDR1
genet er nært forbundet med MDR1
genuttrykk i begge kreftceller.
Metoder
Cell kultur
de 10 menneskelige mage kreft cellelinjer (SNU-1, -5, -16, -216, -484, -601, -620, -638, -668 og -719) og 9 tykktarm kreft cellelinjer (SNU-C1, C4, C5, Colo320HSR, LoVo, DLD-en, HT-29, HCT-8 og HCT-116) ble hentet fra Cancer Research Center ved Seoul National University (Sør-Korea). Alle celler ble dyrket ved 37 ° C i en 5% CO 2 atmosfære ved å bruke RPMI 1640 medium (GibcoBRL, Gland Island, NY, USA) med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum (Sigma, ST. Louis, MO, USA). Cellene ble opprettholdt enten som en suspensjon eller en monolagskultur, og dyrket inntil de nådde konfluens.
Revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) -analyse
total-RNA ble ekstrahert ved bruk av MagExtractor ® for MFX-2100 (Toyobo, Osaka, Japan) auto-nukleinsyrerensing system, i henhold til produsentens instruksjoner. MDR1 Hotell og p-aktin
mRNA transkripter ble oppdaget ved hjelp av RT-PCR-analyse. MDR1
ekspresjon ble påvist med de 5 'og 3' primere som tilsvarer nukleotidene 907-930 (5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 ') og 1179 til 1201 (5'-TGCCAAG-ACCTCTTCAGCTACTG-3'), respektivt, av den publiserte cDNA-sekvensen [17], hvilket ga et 296 bp PCR-produkt. β-actin
mRNA-ekspresjon ble anvendt som en kontroll for mengden av RNA, og ble påvist med de 5 'og 3' primere tilsvarende nukleotider 1912-1932 (5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 ') og 2392-2412 ( 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3 '), respektivt, av den publiserte cDNA-sekvensen [18], hvilket ga et 501 bp PCR-produkt. RNA fra hver prøve ble reverstranskribert ved bruk av 200 enheter Moloney murin leukemivirus revers transkriptase (Gibco-Bethesta Research Laboratory, Grand Island, NY, USA) og 0,18 ug /ml oligo (dT 20) primer i 1 time ved 37 ° C. Det resulterende cDNA av magecancerceller (2-ganger fortynnet cDNA i tykktarmskreftceller) ble amplifisert med 1,25 enheter Taq-polymerase (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 1 mM MgCb 2 og 10 pmol av hver primer i en termosykler (GeneAmp 2400, PE Applied Biosystems, Boston, MA, USA) i 22 sykluser med tykktarmskreftceller, men 35 sykluser med magekreftcellene for MDR1
og 17 sykluser for β-actin
av den sekvensielle denaturering (94 ° C i 30 s), annealing (65 ° C i MDR1
, 53 ° C i β-actin
), og forlengelsen (72 ° C i 30 s). Etter den siste syklus, ble alle PCR-produktene underkastes en endelig forlengelse på 5 min ved 72 ° C. For kvantifisering, 3 uCi av [α- 32P] dCTP ble tilsatt til hver reaksjonsblanding. Etter PCR, ble PCR-produktene forenes og deretter underkastet elektroforese på en 7,5% nondenaturing polyakrylamidgel. Båndene ble skannet med en densitometer (PDI, Huntington Station, NY, USA). Mengden av hver mRNA-transkript ble normalisert med den til hver β-aktin mRNA
.
Protein ekstraksjon og Western blot-analyse
Totale cellelysater ble fremstilt ved å lysere cellene høstet i ekstraksjonsbuffer (1% NP-40 , 0,5% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS i fosfat-bufret saltoppløsning) supplert med 2 mM fenylmetylsulfonylfluorid (Sigma) og 10 ug /ml leupeptin (Sigma). DNA ble skåret ved ultralydbehandling og Western blotting-analyse ble utført ved anvendelse av en liten modifikasjon av metoden først beskrevet av Towbin et al. [19]. Proteiner ble overført på en nitrocellulosemembran ved elektroblotting ved anvendelse av en strøm på 60 V over natten. Membranen ble inkubert i blokkeringsløsning (5% skummet melk) i 1 time ved romtemperatur, vasket, og deretter inkubert med primært geit polyklonalt antistoff (1: 1000, Santa Cruz Bioteknologi, California, USA) for Pgp. Membranen ble vasket og inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (fortynnet 1: 1000) mot hverandre IgG for vertene av primære antistoffer i 1 time. Membranen ble deretter farget ved hjelp av deteksjonsreagens av ECL-påvisning kit (Amersham, Piscataway, NJ, USA).
Real-time PCR
Ekstraksjon av mRNA ble utført i henhold til RNeasy proctocol (Qiagen, Hilden, Tyskland ). Ett mikrogram av total RNA ble reverstranskribert til cDNA i et volum på 20 ul med 200 enheter Moloney murin leukemivirus revers transkriptase (Gibco-Bethesta Research Laboratory, Grand Island, NY, USA) og 0,18 ug /ml oligo (dT 20) primere (Promega, Madison, USA) i henhold til produksjon håndboken. Real-time PCR ble utført med lys sykler 2,0 Instrument (Roche, Mannheim, Tyskland) ved hjelp av Fast Start DNA Master SYBR Grønn Jeg Kit (Roche). For verifisering av korrekt forsterkning produkt, ble PCR analysert på en 2% agarosegel farget med etidiumbromid. Sekvensene til primerne er som følger: for β-actin
, 5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 'og 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3'; for MDR1
, 5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 'og 5'-TGCCAAGACCTCTTCAGCTACTG-3'. Hver reaksjon (20 ul) inneholdt 4 pl cDNA (10 gangers fortynning), 4 mM MgCl 2, 10 pmol av hver primer og 2 ul av Fast Start DNA Master SYGR Grønn Jeg Mix inneholder buffer, dNTP, SYBR grønt fargestoff og Tag polymerase. Den amplifikasjonsprosedyre av målgener var som følger: pre-denaturerende ved 95 ° C i 10 minutter, 40 sykluser av denaturering ved 95 ° C i 15 sekunder, annealing for MDR1
ved 67 ° C (β-actin
ved 55 ° C) i 5 sekunder, og forlengelse ved 72 ° C i 7 sekunder (β-actin
for 21 sek). Smelting kurve analyse ble utført for å bekrefte produksjonen av et enkelt produkt. Negative kontroller uten templat ble fremstilt for hvert forsøk. Genekspresjon verdier (relative mRNA-nivåer) er uttrykt som prosenter (differansen mellom de Ct-verdier = Det punkt på kurven hvor mengden av fluorescens begynner å øke hurtig, som regel noen få standardavvik over grunnlinjen, er betegnet terskelsyklusen ( Ct-verdien).) mellom det aktuelle genet (MDR1
mRNA) og en intern referanse-genet (β-actin
mRNA) som gir en normaliseringsfaktor for mengden av RNA isolert fra en prøve. Analyse av dataene ble utført under anvendelse av lys Cycler software versjon 4.0 (Roche).
Cytotoksisitet test ved anvendelse av MTT-analysen
in vitro
cytotoksisitet av medikamentene ble målt ved anvendelse av et MTT-assay, som beskrevet andre steder [20]. Cellene ble sådd ut ved en 2 x 10 4cells /ml og inkubert over natten for å tillate festing og stabilisering. Cellene ble inkubert ved 37 ° C i 3 dager, og MTT [3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid, Sigma] oppløsningen ble deretter tilsatt til hver brønn inneholdende cellene. Etter risting i ett minutt, ble platen inkubert i 5 timer. Formazankrystaller av suspensjonskultur ble oppløst i 150 ul dimetylsulfoksid (DMSO) etter fjerning av supernatanten. Den optiske tetthet av brønnene ble målt med en mikroplateleser (μQuant, Bio-tek Instruments Inc., Winooski, VT, USA) ved 540 nm.
Kvantifisering PCR-basert analyse metylering
Fem mikrogram av det genomiske DNA ble kuttet med 50 U Msp
jeg eller Hpa
II (Fermentas MBI, Vilnius, Litauen) ved 37 ° C i 16 timer, lagt til en 1/15 volum på 0,6 M Tris (pH 7,5) og 1,5 M NaCl, og fordøyet med 50 U av PstI
i (New England Biolabs, MA, USA) ved 37 ° C i 8 timer. Metyleringen status av MDR1
5'CpG promoter-regionen ble undersøkt ved å analysere 100 ng restriksjons-spaltet DNA ved hjelp av PCR i 25 ul reaksjoner inneholdende 1,25 enheter Taq DNA-polymerase og 10 pmol av hver primer. Kvantifiseringen PCR-baserte metylering analyse ble utført i henhold til den metode som er rapportert tidligere [11]. PCR-primere som ble anvendt var 5'-TCTAGAGAGGTGCAACGGAAG-3 'og 5'-TCAGCCTCACCACAGATGAC-3' for MS1 metylering-sensitive primere (121 bp), 5'-TGAAGTCCTCTGGCAAGTCC-3 'og 5'-ATTCTCCCTCCCGGTTCC-3' for MS2 metylering-sensitive primere (206 bp), 5'-ATTTCACGTCTTGGTGGCC-3 'og 5'-TCCAGTGCCACTACGGTTT-G-3'for MC positiv kontroll primere (240 bp), og 5'-GGCGAAGGAGGT-TGTCTATTC-3' og 5 ' -AACGTTCTAGGAGAGTCGGG-3 'for MN negativ kontroll primere (240 bp) avledet fra den triosefosfat-isomerase-genet promoter-regionen. Amplifikasjon ble utført i en DNA thermal cycler for 35 sykluser for MN, MC, MS1 og MS2 primere som omfatter i sekvens denaturering (95 ° C i 30 s), annealing (60 ° C i 30 s), og forlengelsen (72 ° C i 30 s). Etter den siste syklus, ble alle PCR-produktene underkastes en endelig forlengelse i 5 minutter ved 72 ° C. PCR-produktene ble separert ved elektroforese på 7% PAGE-geler. Gelene ble deretter farget med etidiumbromid, og fotografert ved anvendelse av en Kodak Image Station 4000 MM (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA).
Bisulfite DNA-sekvensanalyse
Ett pg av genomisk DNA ble kjemisk modifisert med natrium bisulfit bruke EZ DNA Metylering kit (Zymo Research, Orange, CA, USA) for å konvertere unmethylated cytosines å uraciler samtidig la denaturert cytosines uendret. Bisulfitt-modifiserte DNA ble anvendt for PCR-amplifikasjon. Utvidet MS1 primer inneholder 10 CpG områder, og 2 SP-1 områder som er obligatorisk for den funksjonelle MDR1
arrangøren skal aktiveres [21]. Primersekvensene for amplifisering av bisulfitt-behandlede tråder (223 bp) var som følger: S: 5'-GGAAGTTAGAATATTTTTTTTGGAAAT-3 '; AS: 5'-ACCTCTACTTCTTTAAACTTAAAAAAACC-3 '. Amplifikasjon ble utført i de samme PCR-betingelser, bortsett fra 48 ° C glødetemperatur og 45 PCR-sykluser. Etter den siste syklus, ble alle PCR-produktene underkastes en endelig forlengelse ved 72 ° C i 5 minutter. Sekvens av PCR produktene ble analysert ved hjelp av en automatisert sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) Statistical Analysis.
Resultatene er presentert som et gjennomsnitt ± SE og dataene ble analysert ved hjelp av t-test
. P-verdiene < 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater Host Sammenligning av uttrykk profiler av MDR1 mRNA i mage og tykktarm kreft celler
MDR1
mRNA uttrykk ble analysert ved hjelp av RT-PCR-analyse med uttrykket nivået er normalisert med p-aktin
mRNA nivåer oppnås etter 17 sykluser av PCR. MDR1
mRNA ble ikke detektert etter 22 sykluser med PCR i 10 magekreftcellelinjer, men kan bli detektert ved varierende nivåer etter 35 sykluser med PCR med unntak av SNU-16, noe som tyder på en vesentlig lavt nivå av MDR1
mRNA uttrykk i magekreftceller testet (figur 1). Som vist i figur 1, er rang rekkefølge i henhold til den MDR1-β-aktin
-forholdet i magekreftcellelinjer er som følger: SNU-668 (1,51) > SNU-484 (1,37) > SNU-5 (0,63) > SNU-601 (0,33) > SNU-719 (0,32) > SNU-216 (0,29) > SNU-638 (0,07) > SNU-1 (0,04) > SNU-16 (0). Av de ni tykktarm kreft cellelinjer, kan variabel MDR1
mRNA nivåer påvises i 7 tykktarmskreft cellelinjer etter 22 sykluser av PCR, men ikke i SNU-C5 og HT-29 celler. MDR1
mRNA i de to sistnevnte cellene kunne ikke påvises selv etter 35 sykluser med PCR. Disse resultatene tyder på et relativt høyt nivå av MDR1
mRNA-ekspresjon, til tross for noen unntak i tykktarmskreftceller. Som vist i figur 2, rang rekkefølge i henhold til den MDR1
/β-aktin
forholdet i tykktarmskreftcellelinjer er som følger: Colo320HSR (0,90) > SNU-C4 (0,45) > HCT-8 (0,26) > SNU-C1 (0,12) > HCT-116 (0,11) > LoVo (0,10) > DLD-1 (0,07) > SNU-C5 (0) = HT-29 (0). Figur 1 MDR1 mRNA uttrykk i mage kreft cellelinjer. Nivået av MDR1
mRNA-ekspresjon ble bestemt ved hjelp av RT-PCR, og normalisert ved at av mRNA β-actin
, som ble anvendt som en kontroll for RNA. CDNA revers-transkribert fra mRNA ble forsterket separat med hvert primerpar for MDR1 Hotell og p-aktin
gener. Porsjoner av hver PCR-reaksjonsblanding ble separert på 7% polyakrylamidgel. Gelen ble tørket og eksponert på røntgenfilm over natten.
Figur 2 MDR1 mRNA-ekspresjon i tykktarmskreftcellelinjer. Den samme metoden som angitt i figur 1 ble anvendt.
Vi utførte igjen sanntids RT-PCR-analyse for kvantitativ validering av MDR1
mRNA-nivåer som oppnås fra RT-PCR-analyse. MDR1
mRNA ble ikke påvist i 10 mage kreft cellelinjer. Men av de ni tykktarmskreft cellelinjer, variabel MDR1
mRNA nivåer kunne påvises i 7 tykktarm kreft cellelinjer, bortsett fra SNU-C5 og HT-29 celler som de RT-PCR data (figur 3). Figur 3 MDR1 mRNA uttrykk i mage og tykktarm kreft cellelinjer. Nivået av MDR1
mRNA-ekspresjon ble bestemt ved sanntids RT-PCR, og normalisert ved at av mRNA β-actin
, som ble anvendt som en kontroll for RNA. CDNA revers-transkribert fra mRNA ble forsterket separat med hvert primerpar for MDR1 Hotell og p-aktin
gener.
Til sammen MDR1
mRNA nivåer i mage kreft cellelinjer var signifikant lavere enn de i tykktarmskreft cellelinjer.
kjemosensibiliserende effekter av Pgp-hemmere i mage og tykktarm kreft celler
Selv om protein nivåer ikke ble undersøkt i denne studien ble funksjonelle studier utført ved hjelp PGP-hemmere i mage og tykktarmskreft cellelinjer som uttrykker det høyeste nivået av MDR1
mRNA uttrykk. Som vist i figur 4A, er Colo320HSR celler (kolon, mutant p53, høyeste ekspresjon av MDR1
mRNA) var 14 ganger og > 200 ganger resistente mot paclitaxel enn SNU-C5 og SNU-668-celler (gastrisk, mutant p53, høyeste ekspresjon av MDR1
mRNA) sammenlignet på grunnlag av IC 50-verdier, henholdsvis, som representerer en signifikant forskjell i PGP nivåer. I tillegg ble motstanden i Colo320HSR cellene til paclitaxel reverseres ved PGP-inhibitorer, inkludert cyklosporin A, verapamil, og PSC833 (figur 4B). Men dette reversering ble ikke observert i SNU-C5 (colon, ingen MDR1
mRNA) celler samt SNU-668. Dette tyder på at Pgp uttrykkes i tykktarmskreftceller, men ikke magekreftceller virker funksjonelt og kan bli inhibert av Pgp-inhibitorer. Figur 4 Sammenligning av Pgp uttrykk og funksjon i mage og tykktarm kreft cellelinjer. (A) Sammen følsomheten Colo320HSR (colon, høyest), SNU-668 (mage, høyest) og SNU-C5 (colon, ingen uttrykk) til paclitaxel; (B) Effekter av Pgp-hemmere på følsomheten Colo320HSR, SNU-668 og SNU-C5 til paclitaxel (IC10 konsentrasjon, 50 M, 0,3 nM og 0,5 nM). Følsomhet for paclitaxel ble bestemt ved anvendelse av MTT-analysen i nærvær eller fravær av Pgp-inhibitorer (cyklosporin A, verapamil og PSC833 av 0,8 pM hver). *, P <. 0,05 versus kontroll
Sammenligning av metylering status for MDR1 i mage og tykktarm kreft celler
metylering status ble bestemt ved kvantifisering PCR-basert metylering analyse for en CpG-rik domenenavn å være ca 1 Kb inneholder exon 1 og intron 1 blant MDR1
promoter. For å fastslå graden av metylering av MDR1
genet promoter-regionen, to primere (MS1 og MS2) som inneholder Msp
I /Hpa
II nettsider ble utformet fra exon 1 og intron 1, henholdsvis. Den primer-par MC ble anvendt som en positiv kontroll for å bestemme kvaliteten på kilden genomisk DNA. I motsetning til dette ble det MN som krysser MSP
I /Hpa
II-sete ved triosefosfat-isomerase-genet promoter-regionen og blir aldri denaturert anvendt som den negative kontroll. Figur 5B viser et typisk mengde PCR-basert analyse metylering bilder av SNU-5 (gastrisk) og HT-29 (kolon) celler. Kvantifiseringen PCR-basert metylering analyse avdekket at noen PCR-produkter for MS1 og MS2 ikke ble produsert fra Pst
1-fordøyd genomisk DNA behandlet med Msp
I (metylering-insensitive enzym). På den annen side, ble PCR-produktene både MS1 og MS2 i SNU-5-celler, men et PCR-produkt for MS1 alene i HT-29-celler ble oppnådd etter Hpa
II (metylering-sensitive enzym) behandling, noe som indikerer metylering av CpG på MS1 og MS2 steder i SNU-5 celler og bare på MS2 området i HT-29 celler. Som oppsummert i tabell 1, ble metylering detektert på MS1 og MS2 områder av de 9 magecancercellelinjer med unntak av SNU-484, men 2 (SNU-C5 og HCT-116) av de ni koloncancercellelinjer. På den annen side ble de HT-29-celler metylert bare på MS2 området. SNU-C5, HT-29 (colon) og SNU-16 (mage) celler ikke uttrykker MDR1
mRNA ble metylert. Bisulfitt DNA-sekvensanalyse ble utført for å bekrefte den metylering. Som show i tabell 1, metylering grad (%) av 10 CpG steder på brukt MS1 nettstedet er helt samsvarte med resultatene som er oppnådd ved kvantifisering PCR-basert metylering analysis.Table en Metylering status og effekter av 5AC og /eller TSA om MDR1
mRNA uttrykk og i ulike mage og tykktarm kreft cellelinjer




DNA metylering analyse




Tissue
Cell linje
5AC
restriksjonsenzym
Sodium Bisulfite
TSA

5AC + TSA


Brett
Effect FBT-Parts.com Site
Degree (%)1

Fold

Effect

Fold

Effect

Gastric
SNU-1
32.6
O
MS1
MS2
100
20.7
O
+23.6
D
SNU-5
5,8
O
MS1
MS2
100
1,03
X
6,8
A
SNU-16
nd
X
MS1
MS2
60
8,4
O
28,9
S
SNU-216
-1,0
X
MS1
MS2
50
8,4
O
8,2
N
SNU-484
-1,3
X -
-
0
-5,1
X
-0,17 -
SNU-601
3,2
O
MS1
MS2
100
3,3
O
13,7
S
SNU-620
67,6
O
MS1
MS2
100 product: *
X product: *
*
SNU-638
68,9
O
MS1
MS2
100
5,7
O
72,9
A
SNU- 668
-1,0
X
MS1
MS2
80
1,8
O
4,4
S
SNU-719
5.8
O
MS1
MS2
100
4.2
O
12.4
S
Colon
SNU-C1
-1.96
X
n.d.
n.d.
0
1.7
O
+1.0
D
SNU-C4
1,0
X
nd
nd
0
-1
X
-1,6
N
SNU-C5
nd
X
MS1
MS2
100
nd
X
8
S
Colo320HSR
1,4
X
nd
nd
0
1,6
O
1,3
D
LoVo
-1,9
X
nd
nd
0
1,1
X
-2
N
DLD-en
1.1
X
nd
nd
0
3,5
O
1,1
D
HT-29 product: *
X
nd
MS2
0
∞
O product: *
*
HCT-8
1,0
X
nd
nd
0
1,0
X
1.1
N
HCT-116
1,7
O
MS1
MS2
100
1,6
O
1,6
N
1Sequence ble analysert ved hjelp av PCR-produkter som inneholder den utvidede MS1 området som har vist seg å spille en viktig rolle i MDR1
mRNA-ekspresjon. n.d., ikke oppdaget; *, Svært cytotoksiske; ∞, en økning sammenlignet med ingen MDR1 mRNA
uttrykk; D, redusert; A, additiv; S, synergistisk; N, ikke endret
Figur 5 Kvantifiseringen PCR-basert metylering analyse av mage og tykktarm kreft cellelinjer. (A) CpG områder og Hpa II Twitter /Msp I
steder i menneske MDR1
promoter-regionen. Top: CPG sider er representert ved de korte vertikale linjene. Posisjonene av eksoner 1 og 2 er angitt som lukkede bokser. Den stilling som svarer til disse fragmentene er angitt. Midten: Hpa II Twitter /Msp I
gjenkjenningsseter er representert med korte loddrette streker. Bottom, PCR primere som brukes i metylering analyse. (B) Representative metylering status av MDR1
promotorområdet ved kvantifisering PCR-basert analyse metylering i SNU-5 (gastrisk) og HT-29 (colon). 1: MN, Never-metylert Hpa II Twitter /Msp I
nettstedet på triosefosfatisomerase genet promoter-regionen (negativ kontroll) (240 bp); 2: MC, den positive kontroll primerpar (240 bp); 3: MS1, Hpa II Twitter /Msp I
for 1. (121 bp); 4: MS2, Hpa II
/MSP I
område 2 (206 bp)
Effekter av 5-aza-2'-deoxcytidine (5AC) og /eller trichostatin A (TSA) på ekspresjon av. MDR1 mRNA i mage og tykktarm kreft cellelinjer
DNA metyltransferase inhibitor 5AC og histondeacetylase (HDAC) inhibitor TSA har blitt godt kjent for å lindre epigenetisk gen undertrykkelse [22]. Denne studien undersøkte effekten av 5AC og /eller TSA på MDR1
mRNA uttrykk i mage og tykktarm kreft linjer. I 10 mage og 9 kolon kreftceller, ble MDR1
mRNA ekspresjon bestemt ved RT-PCR etter å behandle dem med 2,5 uM 5AC i 96 timer og /eller 100 ng /ml TSA i 48 timer. En økning ble definert i tilfeller som viser mer enn en 1,5 ganger økning. Som vist i tabell 1 og 5AC behandlingen økte MDR1
mRNA-nivåer i SNU-1, -5, -601, -620, -638 og -719 gastrisk cancer cellelinjer, og at i HCT-116 colon kreftcellelinje (figur 6 og 7). Men 5AC fremkalte ikke MDR1
mRNA uttrykk selv i SNU-16 og SNU-C5 og HT-29 celler hvis MDR1
genet ble metylert. TSA behandling økt MDR1
mRNA nivåer i SNU-1, -16, -216, -601, -638, -668 og -719 mage kreft cellelinjer og SNU-C1, Colo320HSR, DLD-en, H29 og HCT-116 colon cancer-cellelinjer (figur 6 og 7). 5AC viste høy cytotoksisitet alene eller i kombinasjon med TSA, spesielt i HT-29-celler. Også, TSA viste svært cytotoksisk aktivitet alene eller i kombinasjon med 5AC, spesielt i de SNU-620-celler. Denne studien undersøkte også effekten av den kombinerte behandling av 5AC med TSA, noe som økte MDR1
mRNA-nivåer additivt i SNU-5 og -638 celler, men synergistisk i den SNU-16, -601, -668, -719 og SNU-C5-celler (tabell 1). Figur 6 Aktivering av MDR1 mRNA uttrykk av 5AC og /eller TSA i magekreftceller. Ekspresjonsnivået angis som forholdet mellom MDR1
/β-aktin. Det totale RNA ble isolert etter behandling med 2,5 uM 5AC i 96 timer og /eller 100 ng /ml TSA i 48 timer. RT-PCR ble utført ved anvendelse av samme metode rapportert i figur 1. Figur 7
Aktivering av MDR1 mRNA ekspresjon ved 5AC og /eller TSA i forskjellige tykktarmskreftcellelinjer. RT-PCR-analyse etter behandling av cellene med 5AC og /eller TSA ved hjelp av samme metode som er beskrevet i figur 6. MDR1 /β-actin
forhold oppnås gjennom 35-syklus PCR etter TSA i kombinasjon med 5AC, og alene i SNU C5 og HT-29 uttrykker ikke MDR1
mRNA, henholdsvis, ble utelatt i histogrammet.
Disse resultatene tyder på at MDR1
mRNA ekspresjon differensielt regulert i mage og tykktarm kreftceller med hensyn til å stanse all MDR1
uttrykk gjennom epigenetiske mekanismer som DNA metylering og /eller histon deacetylering.
diskusjon
i denne studien fant vi at MDR1
mRNA nivåer i mage kreft cellelinjer var betydelig lavere enn de i colon cancercellelinjene, selv om det var noen variasjoner. Disse resultatene er i overensstemmelse med en rapport som viser at Pgp er sterkt uttrykt på ileum og kolon, på et nivå som gradvis avtar proksimalt inn i jejunum, tolvfingertarmen og mage [8]. Siden mage og tykktarm spille viktige roller i fordøyelse og absorpsjon, henholdsvis, er det ikke overraskende at transportører som Pgp ble uttrykt forskjellig i de to normale vev. Våre funn at differensial uttrykk for MDR1
mRNA i kreftcellelinjer avledet fra magen og tykktarmen er også konsistent med publiserte rapporter [23-26]. Immunpatologiske undersøkelser avdekket at Pgp uttrykk på humane tumorer ble oftest påvist i kolon, nyre og adrenal karsinom, men sjelden i lunge og mage karsinomer og visse bakterie celle svulster [27].
Treveis sammenheng mellom DNA metylering, kromatin struktur og genekspresjon ble nylig anmeldt [28-30]. En viktig konsekvens av CpG metylering er den lokale stanse av genekspresjon, som kan bli formidlet ved direkte innblanding av metylering med bindingen av forskjellige transkripsjonsfaktorer. Hovedkomponenten lyddemping av genuttrykk synes å være bindingen av metyl-CpG-bindende protein 2 (MeCp2), som har en affinitet for metyl-CpG [31, 32]. DNA-demetylering av 5AC bevirker frigjøring av MeCp2 fra promoteren, som aktiverer transkripsjonen genekspresjon [10]. Det er kjent at MeCp2 også er anriket på MDR1
promoteren og er relatert til dens stanse [33]. 5AC endrer metylering mønster av MDR
en promoter i Pgp-negative celler for å ligne av Pgp-positive celler og aktiverer promoteren slik at MDR1
mRNA kan detekteres [34].
I denne studien metyleringen status ble også analysert for å bestemme om den MDR1
lyddemping skyldes hypermethylation av promotorområdet.

• Imaging i å vurdere nedsatt lever- og peritoneal metastaser av magekreft: en systematisk
• Magesonde innsetting under direkte visjon hjelp Kongen Vision ™ video laryngoskop: en randomisert, prospektiv, klinisk studie