Epigenetic Mechanismen Équipe an Ënnerscheed MDR1mRNA Ausdrock tëscht gastric an Colon Kriibs Zell Linnen an terme fir Medeziner chemotherapy

Epigenetic Mechanismen Équipe an Ënnerscheed MDR1 VerfÜgung mRNA Ausdrock tëscht gastric an Colon Kriibs Zell Linnen an terme fir Medeziner Chimiotherapie VerfÜgung méiglech VerfÜgung Background VerfÜgung d'Membran Transporter wéi P-glycoprotein (Pgp), de MDR1 VerfÜgung Gentherapie Produit, sinn eent vun Dout vu Behandlung Echec zu Kriibs Patienten. An dëser Etude, goufen d'epigenetic Mechanismen Équipe an Ënnerscheed MDR1 VerfÜgung mRNA Ausdrock tëscht 10 gastric an 9 Colon Kriibs Zell Linnen Verglach. VerfÜgung Method VerfÜgung D'mRNA Niveauen VerfÜgung MDR1 sech mat Hinnen alleguer alles an real-Zäit Hinnen alleguer assays nom ëmgekéierte Transkriptiouns. Cytotoxicity war mat der MTT assay gesuergt. Methylation Status vun quantification Hinnen alleguer-baséiert methylation an bisulfite DNA sequencing lant gouf analyséiert. VerfÜgung Resultater VerfÜgung D'MDR1 VerfÜgung mRNA Niveau vun 35 Zykle vun RT-Hinnen alleguer zu gastric Kriibs Zellen kritt huet just ähnlech wéi déi vun 22 kritt Zykle vun RT-Hinnen alleguer op Colon Kriibs Zellen. Real-Zäit RT-Hinnen alleguer Analyse Teamchef MDR1 VerfÜgung mRNA net an der 10 gastric Kriibs festgestallt gouf Zell Linnen mä ofwiesselnd MDR1 VerfÜgung mRNA Niveau vun 7 vun 9 Colon Kriibs Zell Linnen ausser der SNU-C5 an HT-29 Zellen . MTT assay zougedréckt datt Pgp inhibitors wéi cyclosporine A, verapamil an PSC833 Colo320HSR sensitized (Colon, héchste MDR1 VerfÜgung Ausdrock) awer net SNU-668 (gastric, héchsten) an SNU-C5 (gastric, keen Ausdrock) zu paclitaxel. Quantification Hinnen alleguer-baséiert methylation Analyse verroden, datt 90% vun gastric Kriibs Zellen, an 33% vun Colon Kriibs Zellen sech methylated, déi komplett mat der vun bisulfite DNA sequencing Analyse kritt Resultater reagéiert huet. 5-AZA-2'-deoxcytidine (5AC, eng DNA methyltransferase inhibitor) fräi MDR1 VerfÜgung mRNA Niveau vun 60% vun gastric Zellen, an zu 11% vun Colon Kriibs Zellen. Trichostatin A (TSA, histone deacetylase inhibitor) fräi MDR1 VerfÜgung mRNA Niveau vun 70% vun gastric Kriibs Zellen an 55% vun Zellen Colon Kriibs. D'kombinéiert Behandlung vun 5AC mat TSA fräi mRNA Niveauen VerfÜgung MDR1 additively zu 20% vun gastric Kriibs Zellen, mä synergistically zu 40% vun gastric an 11% vun Colon Kriibs Zellen. VerfÜgung Conclusioun VerfÜgung Dës Resultater weisen, datt der MDR1 VerfÜgung mRNA Niveauen an sinn gastric Kriibs Zellen wesentlech méi niddreg wéi déi vun Colon Kriibs Zellen, déi wéinst verschiddenen epigenetic Reglementer op d'mannst zu engem Deel ass wéi DNA methylation an /oder histone deacetylation. Dës Resultater kënnen e bessert Verständnis vun der Efficacitéit vun kombinéiert Chimiotherapie déi souwéi hir mëndlech bioavailability. VerfÜgung Background VerfÜgung Gastric an colorectal Cancers haut ee Grond vun morbidity a veruerteelt vun der Welt sinn. Wann e curative chirurgesch resection onméiglech ass, entspriechen dës Cancers ganz wéineg bis Chimiotherapie an doraus zu engem schlechte hätt. An gastric Kriibs Patienten, 5-fluorouracil (5-FU) baséiert geschéckt Chimiotherapie hunn fir d'Behandlung Resultater ze verbesseren [1] envisagéiert ginn. Mat colorectal Kriibs, huet 5-FU déi oft benotzt Drogenofhängeger ginn fir méi wéi 40 Joer. Mä aner Agenten wéi irinotecan oder oxaliplatin benotzt goufen d'antitumor Efficacitéit a Kombinatioun mat 5-FU [2] ze verbesseren. 5-FU interferes mat DNA Synthes vun der Produktioun vun pyrimidine Nukleotid dTMP aus dUMP erauszesichen während de Novo VerfÜgung DNA Synthes duerch d'inhibition vun thymidylate synthase souwéi duerch d'Aktivitéiten vun fluoro-nucleotides an der DNA an RNS [3]. VerfÜgung P-glycoprotein (Pgp) encoded vun der multidrug Resistenz 1 (MDR1 VerfÜgung) Gentherapie ass e Vertrieder Membran efflux Pompel vum ATP-verbindlech Kassett (ABC) Transporter [4-6]. Pgp Funktiounen als Energie-ofhängeg efflux Pompelen vun enger Rei vu strukturell verschiddenste chemotherapeutic Agenten wéi doxorubicin, vincristine, vinblastine, paclitaxel, colhicine, actinomycin D an mitomycin C [7], déi de intracellular Niveau vun Drogenofhängeger Heefung ofhuelen kann. Als Resultat, overexpression vun dësen Proteinen jidferengem fir Premier ze Kriibs Zellen vun der cytotoxic Auswierkunge vun Drogen hannerzéien. An der mënschlecher Daarm, ass Pgp op der enger steriler Uewerfläch vun der iwwerflächlech columnar epithelial Zellen vun der ileum an Colon staark ausgedréckt, an hiren Ausdrock Niveau erof lues proximally an der jejunum, Ausléiser an Mo [8]. Regulatioun vun der transcriptional Aktivitéit vun der Gentherapie MDR1 VerfÜgung ass ofhängeg op verschiddene Ziel-handele Proteinen datt de Konsens Well-Elementer [9] kruet. D'Accessibilitéit vun de Promoteur Elementer op hir obligatoresch Facteuren ass um Niveau vun chromatin Versammlungs- reegelen. Den Niveau vun béiden DNA methylation an histone deacetylation regléieren MDR1 VerfÜgung Gentherapie Ausdrock [10-12]. Sou wäit, déi transcriptional Regulatioun vun MDR1 VerfÜgung Gentherapie Ausdrock duerch epigenetic Mechanismen gouf an Ausdrock vun Colon Kriibs Zellen [13-16] mee keent vun gastric Cancers Zellen gemellt. Doriwwer eraus, hunn d'Relatiounen tëscht de transcriptional Ausdrock vun MDR1 VerfÜgung Gentherapie Ausdrock an epigenetic Mechanismen gastric an Colon Kriibs Zellen net verglach ginn. Dofir, et ass net kloer firwat hunn Chimiotherapie regimens anescht gastric an colorectal Cancers benotzt gi fir de Plëséier a firwat MDR1 VerfÜgung mRNA differentially zu gastric an colorectal Kriibs Zellen ausgedréckt gëtt. Dofir, dat studéieren iwwerpréift ob oder net d'Ausmooss vun methylation um Promoteur Site vun der MDR1 VerfÜgung Gentherapie enk mat MDR1 VerfÜgung Gentherapie Ausdrock vun zwou Kriibs Zellen. VerfÜgung Method VerfÜgung Zell Kultur VerfÜgung assoziéiert ass déi 10 Mënsch gastric Kriibs Zell Linnen (SNU-1, -5, -16, -216, -484, -601, -620, -638, -668 an -719) an 9 Colon Kriibs Zell Linnen (SNU-C1, -C4, -C5, Colo320HSR, LoVo, DLD-1, HT-29, HCT-8 an HCT-116) goufen aus der Cancer Research Center op Seoul National University (Südkorea) kritt. All d'Zellen sech cultured bei 37 ° C an engem 5% CO 2 Atmosphär benotzt RPMI 1640 mëttelfristeg (GibcoBRL, Gland Island, NY, USA) mat 10% Hëtzt inactivated An et Bovine serum (Fläch, ST. Louis, MO, USA). D'Zellen sech entweder als eng Dispens oder engem monolayer Kultur haten, an subcultured bis se Niewebaach erreecht. VerfÜgung Transkriptiouns-polymerase Kette Reaktioun (RT-Hinnen alleguer) assay Réckproduktioun VerfÜgung de ganzen RNS ofgebaut gouf benotzt MagExtractor ® fir der MFX-2100 (Toyobo, Rekorder, Japan) auto-Nukleinsaier Offäll System, no der Taktik vum Produzent. D'MDR1 VerfÜgung an β-actin VerfÜgung mRNA gët sech mat der RT-Hinnen alleguer assay fonnt. MDR1 VerfÜgung Ausdrock war mat der 5 erwëscht "an 3" primers entspriechend dem nucleotides 907-930 (5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 ") an 1179-1201 (5'-TGCCAAG-ACCTCTTCAGCTACTG-3"), respektiv, vun déi publizéiert cDNA Haaptrei [17], e 296-BP Hinnen alleguer Produit noginn. β-actin VerfÜgung mRNA Ausdrock war als Kontrollorgan fir d'Quantitéit vun RNS benotzt, a war mat der 5 erwëscht "an 3" primers entspriechende nucleotides 1912-1932 (5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 ") an 2392-2412 ( 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3 "), respektiv, vun der cDNA Haaptrei publizéiert [18], e 501-BP Hinnen alleguer Produit noginn. D'RNS aus all Prouf war ëmgedréint ausserdeem mat 200 Unitéiten vun Moloney murine transcriptase ëmgedréint Leukämie Virus (Gibco-Bethesta Research schafft, Grand Island, NY, USA) an 0,18 μg /ml oligo (DT 20) primer fir 1 HR am 37 ° C. Déi doraus resultéierend cDNA vun der gastric Kriibs Zellen (2-fantastesch cDNA am Colon Kriibs Zellen verdënntem) huet mat 1,25 Ënnerdeelunge vun Taq polymerase (PE Obwuel Biosystems, Foster City, CA, USA) Implikatioune verstärkt, 1 mm MgCl 2 an 10 pmole vun all primer zu enger thermesch LS (GeneAmp 2400, PE Obwuel Biosystems, Boston, mA, USA) fir 22 Zykle mat de Colon Kriibs Zellen mee 35 Zykle mat der gastric Kriibs Zellen fir MDR1 VerfÜgung an 17 Zykle fir β-actin VerfÜgung vun der mi denaturation (94 ° C fir 30 s), annealing (65 ° C fir MDR1 VerfÜgung, 53 ° C fir β-actin VerfÜgung), an Extensioun (72 ° C fir 30 s). No der Finale Zyklus, all waren der Hinnen alleguer Produiten zu enger definitiver Extensioun vun 5 min bei 72 ° C ënnerworf. Fir quantitation, 3 μCi vun [α- 32P] dCTP zu all Reaktioun Mëschung notéiert goufen. No Hinnen alleguer, goufen d'Hinnen alleguer Produiten kombinéiert an duerno op engem 7.5% nondenaturing polyacrylamide gelies electrophoresed. D'Bande ware mat engem densitometer (Pdi, Huntington Station, NY, USA) gescannt. D'Zomm vun all ët mRNA war normalized mat, datt vun all β-actin VerfÜgung mRNA. VerfÜgung Protein erauszéien a Western blot Analyse VerfÜgung Total Zell lysates Bereetschaft vun recoltéiert Zellen an Extraktioun gefiermt lysing (1% NP-40 , 0,5% Natrium deoxycholate, 0,1% SDS zu phosphate-gefiermt Salins) ergänzt mat 2 mm phenylmethylsulfonyl fluoride (Fläch) an 10 μg /ml leupeptin (Fläch). DNA war vun sonication a Western blotting Analyse sheared war mat engem liicht Modifikatioun vun der Method standing éischte vun Towbin beschriwwen et al. [19]. Proteinen sech op enger nitrocellulose Membran transferéierte electroblotting engem aktuellen vun 60 V Iwwernuechtung benotzt. D'Membran war zu erauszesichen Léisung (5% z'iesse Mëllech) fir 1 HR bei Raumtemperatur, gewäsch, incubated an duerno mat der Primärschoul Geess polyclonal antibody (1: 1000, Santa Cruz, Déi, CA, USA) incubated fir Pgp. D'Membran Katakombe a mat horseradish peroxidase-conjugated Secondaire antibody (verdënntem 1: 1000) incubated fir 1 HR géint all IgG fir Gäscht vun der Primärschoul antibodies. D'Membran war dann Kierchefënster mat der erkennen reagent vun der ECL erkennen Kit (Amersham, Piscataway, NJ, USA). VerfÜgung Real-Zäit Hinnen alleguer VerfÜgung Reduktioun vun mRNA Leeschtung war no der RNeasy proctocol (QIAGEN, Hilden, Däitschland ). One microgram vun insgesamt RNS war reversely ausserdeem an cDNA zu engem Volume vun 20 μl mat 200 Unitéiten vun Moloney murine Leukämie Virus ëmgedréint transcriptase (Gibco-Bethesta Research schafft, Grand Island, NY, USA) an 0,18 μg /ml oligo (DT 20) primers (Promega, Madison, USA) no der manueller d'Chimie. Real-Zäit Hinnen alleguer war mat der Light LS 2.0 Instrument (Roche, Mannheim, Däitschland) mat der Fast Start DNA Master SYBR Green ech Kit (Roche) gesuergt. Fir kënnen déi richteg amplification Produit, goufen PCRs op engem 2% agarose gelies analyséiert Kierchefënster mat ethidium bromide. De Message vun der primers sinn folgendermoossen: fir β-actin VerfÜgung, 5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 'an 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3 "; fir MDR1 VerfÜgung, 5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 'an 5'-TGCCAAGACCTCTTCAGCTACTG-3 ". All Reaktioun (20 μl) aus 4 μl cDNA (10-fantastesch dilution), 4 mm MgCl 2, 10 pmole vun all primer an 2 μl vun Fast Start DNA Master SYGR Green ech Mix wouvun Prellbock, dNTPs, SYBR Green Hoerfaarw an Tag polymerase. D'amplification Prozedur vun Zil- Genen huet wéi follegt: bei 95 ° C viraus-denaturing fir 10 min, 40 Zykle vun den 15 sec, annealing fir MDR1 VerfÜgung bei 67 ° C (β-actin VerfÜgung bei 95 ° C denaturing bei 55 ° C) fir 5 sec, an Extensioun bei 72 ° C fir 7 sec (β-actin VerfÜgung fir 21 sec). Melting rop Analyse war standing Produktioun vun engem eenzege Produit ze confirméieren. Negativ Kontrollen ouni Skelett sech fir all Course produzéiert. Gene Ausdrock Wäerter (relativ mRNA Niveauen) sinn esou nennen ausgedréckt (Ënnerscheed tëscht der CT Wäerter = D Punkt op der Linn vun deem Montant vun fluorescence séier ze klammen fänkt, meeschtens e puer Standard Hitparad virun der baseline, ass de loung Zyklus Limburg ( CT Wäert).) tëscht der Gentherapie interesséieren (MDR1 VerfÜgung mRNA) an eng intern Referenzmaterial Gentherapie (β-actin VerfÜgung mRNA), datt e normalization Faktor fir d'Quantitéit vun RNS déi aus engem specimen isoléiert. Hëllef MTT assay Analyse vun Donnéeën war mat Light LS Software Versioun 4.0 (Roche). VerfÜgung Cytotoxicity Test standing VerfÜgung D'kënschtlech VerfÜgung cytotoxicity vun den Drogen gemooss gouf en MTT assay benotzt, well soss beschriwwen [20]. D'Zellen sech bei engem 2 géint × 10 4cells /ml an Nuecht fir ausdrécken a Stabiliséierung ze erlaben incubated. D'Zellen sech fir 3 Deeg bei 37 ° C incubated, an MTT [3- (4,5-dimethylthiazole-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide, Fläch] Léisung ugebaut dann zu all gutt d'Zellen enthalen. No verzweifelt fir 1 min, war d'Schossel fir 5 HR incubated. Formazan Kristaller vun der Dispens Kultur sech zu 150 μl vun dimethylsulfoxide (DMSO) no leeën d'supernatant opgeléist. Déi optesch Dicht vun der Wells war mat engem microplate Lieser (μQuant, Bio-tek Instrumenter Galaxy Winooski, hu, USA) op 540 nm gemooss. VerfÜgung Quantification Hinnen alleguer-baséiert methylation Analyse VerfÜgung Five micrograms vun der Frankräich DNA war mat 50 u vun MSP verdaut VerfÜgung sin oder Hpa VerfÜgung II (Fermentas MBI, Vilnius, Litauen) bei 37 ° C fir 16 Stonnen, dobäi op eng 1/15 Volume vun 0,6 M Tris (pH 7.5) an 1,5 M NaCl, a mat 50 u vun Pompey verdaut VerfÜgung ech (New England Biolabs, MA, USA) bei 37 ° C fir 8 Stonnen. D'methylation Status vun der 5'CpG Promoteur Regioun VerfÜgung MDR1 war vun analyséiert 100 NG Restriktioun-verdaut DNA vun Hinnen alleguer zu 25 μL Reaktioune mat 1,25 Ënnerdeelunge vun Taq DNA polymerase an 10 pmole vun all primer iwwerpréift. D'quantification Hinnen alleguer-baséiert methylation Analyse huet laut virdrun Rapport zu der Method duerchgefouert [11]. D'Hinnen alleguer primers benotzt goufen 5'-TCTAGAGAGGTGCAACGGAAG-3 'an 5'-TCAGCCTCACCACAGATGAC-3 "fir d'MS1 methylation-senisitive primers (121 BP), 5'-TGAAGTCCTCTGGCAAGTCC-3' an 5'-ATTCTCCCTCCCGGTTCC-3" fir d'MS2 methylation-senisitive primers (206 BP), 5'-ATTTCACGTCTTGGTGGCC-3 'an 5'-TCCAGTGCCACTACGGTTT-G-3'for den MC positiver Kontroll primers (240 BP), an 5'-GGCGAAGGAGGT-TGTCTATTC-3 "a 5' -AACGTTCTAGGAGAGTCGGG-3 "fir Punktzuel negativ Kontroll primers (240 BP) aus der triosephosphate isomerase Gentherapie Promoteur Regioun ofgeleet. Amplification gouf zu engem DNA thermesch LS fir 35 Zykle vun der Punktzuel, MC, MS1 an MS2 primers sensibiliséieren an Haaptrei denaturation (95 ° C fir 30 s), annealing (60 ° C fir 30 s), an Extensioun (72 ° C gesuergt fir 30 s). No der Finale Zyklus, all d'Hinnen alleguer Produiten sech fir 5 min bei 72 ° C an enger final Extensioun ënnerworf. D'Hinnen alleguer Produiten goufe vun electrophoresis op 7% PAGE gels getrennt. D'gels sech dann mat ethidium bromide Kierchefënster, an fotografeschen vun enger Kodak Image Station benotzt 4000 MM (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA). Bisulfite DNA sequencing Analyse
One μg vu Frankräich DNA chemesch vun Natrium geännert huet bisulfite der EZ DNA Methylation Kit benotzt (Zymo Fuerschung, Orange, CA, USA) unmethylated cytosines zu uracils ze konvertéieren iwwerdeems methylated cytosines onverännert geklappt. D'bisulfite-geännert DNA war fir Hinnen alleguer amplification benotzt. Verlängert MS1 primer enthält 10 CpG Siten, an 2 SP-1 Siten déi obligatoresch sinn, fir déi funktionell MDR1 VerfÜgung Promoteur ageschalt ginn [21]. D'primer Message fir amplification vun bisulfite-behandelt strands (223 BP) sech wéi follegt zesummen: S: 5'-GGAAGTTAGAATATTTTTTTTGGAAAT-3 "; AS: 5'-ACCTCTACTTCTTTAAACTTAAAAAAACC-3 ". Amplification war an der selwechter Hinnen alleguer Konditiounen ausser 48 ° C annealing Temperatur an 45 Hinnen alleguer Zykle gesuergt. No der Finale Zyklus, all d'Hinnen alleguer Produiten sech fir 5 min bei 72 ° C an enger final Extensioun ënnerworf. Haaptrei vun Hinnen alleguer Produiten war mat eng automatiséiert sequencer (Obwuel Biosystems, Foster City, CA, USA) analyséiert. VerfÜgung statistique Analys VerfÜgung D'Resultater sinn als mengen ± SE virgestallt an d'Donnéeë war mat den T-Test d'Student analyséiert VerfÜgung. P Wäerter &Si besteet; 0,05 huet bedeitend considéréiert. VerfÜgung Resultater VerfÜgung Se Ausdrock Profiler vun MDR1 mRNA zu gastric an Colon Kriibs Zellen VerfÜgung MDR1 VerfÜgung mRNA Ausdrock war mat der RT-Hinnen alleguer assay mat dem Ausdrock Niveau analyséiert ginn normalized mat der β-actin VerfÜgung mRNA Niveauen no 17 Zykle vun Hinnen alleguer kritt. D'MDR1 VerfÜgung mRNA war net no 22 Zykle vun Hinnen alleguer an der 10 gastric Kriibs Zell Linnen nogewise konnt awer bei eis Niveauen no 35 Zykle vun Hinnen alleguer mat der Ausnam vun SNU-16 nogewise ginn, eng bedeitend niddereg Niveau vun MDR1 suggeréiert
mRNA Ausdrock vun der gastric Kriibs Zellen getest (Dorënner 1). Als zu Dorënner 1 gewisen, no der Platz fir déi MDR1-β-actin VerfÜgung Verhältnis zu der gastric Kriibs Zell Linnen ass wéi follegt zesummen: SNU-668 (1.51) > SNU-484 (1,37) > SNU-5 (0,63) > SNU-601 (0,33) > SNU-719 (0,32) > SNU-216 (0,29) > SNU-638 (0,07) > SNU-1 (0,04) > SNU-16 (0). Vun den 9 Colon Kriibs Zell Linnen, kéint eis MDR1 VerfÜgung mRNA Niveau vun 7 Colon Kriibs Zell Linnen no 22 Zykle vun Hinnen alleguer awer net zu der SNU-C5 an HT-29 Zellen nogewise ginn. D'MDR1 VerfÜgung mRNAs vun den zwee leschtgenannte Zellen kéint net och no 35 Zykle vun Hinnen alleguer festgestallt. Dës Resultater proposéiere engem relativ héijen Niveau vun MDR1 VerfÜgung mRNA Ausdrock trotz e puer Ausnahmen am Colon Kriibs Zellen. Als zu Dorënner 2 gewisen, no der Platz fir déi MDR1 VerfÜgung /β-actin VerfÜgung Verhältnis zu der Zell Linnen Colon Kriibs ass wéi follegt zesummen: Colo320HSR (0.90) > SNU-C4 (0.45) > HCT-8 (0,26) > SNU-C1 (0,12) > HCT-116 (0,11) > LoVo (0.10) > DLD-1 (0,07) > SNU-C5 (0) = HT-29 (0). Figur 1 MDR1 mRNA Ausdrock vun gastric Kriibs Zell Linnen. Den Niveau vun MDR1 VerfÜgung mRNA Ausdrock war vun RT-Hinnen alleguer alles, an déi, déi vun mRNA β-actin VerfÜgung normalized, déi als eng Kontroll fir RNS benotzt gouf. D'cDNA ëmgedréint-ausserdeem aus der mRNA separat mat all primer Brëll fir MDR1 VerfÜgung an β-actin VerfÜgung Genen Implikatioune verstärkt gouf. Aliquots vun all Hinnen alleguer Reaktioun Mëschung sech op 7% polyacrylamide gelies getrennt. D'gelies huet gedréchent an Nuecht op X-Ray Film ausgesat. VerfÜgung 2 MDR1 mRNA Ausdrock an der Zell Linnen Colon Kriibs Dorënner. D'selwecht Methodik Rapport Dorënner 1 ausgenotzt huet. VerfÜgung Mir standing erëm d'real-Zäit RT-Hinnen alleguer assay fir déi grouss Confirmatioun vun MDR1 VerfÜgung mRNA Niveau vun RT-Hinnen alleguer assay kritt. D'MDR1 VerfÜgung mRNA war net an der 10 gastric Kriibs Zell Linnen fonnt. Allerdéngs, vun der 9 Colon Kriibs Zell Linnen, Verännerlech MDR1 VerfÜgung mRNA Niveau vun 7 Colon Kriibs Zell Linnen ausser der SNU-C5 an HT-29 Zellen wéi d'RT-Hinnen alleguer Donnéeën (Dorënner 3) fonnt ginn hätt. Figur 3 MDR1 mRNA Ausdrock vun gastric an Colon Kriibs Zell Linnen. Den Niveau vun MDR1 VerfÜgung mRNA Ausdrock war vun real-Zäit RT-Hinnen alleguer alles, an déi, déi vun mRNA β-actin VerfÜgung normalized, déi als eng Kontroll fir RNS benotzt gouf. D'cDNA vum mRNA-ëmgedréint ausserdeem war separat mat all primer Brëll fir MDR1 VerfÜgung an β-actin VerfÜgung Genen Kick. Zesummen deelgeholl VerfÜgung, déi MDR1 VerfÜgung mRNA Niveauen am gastric Kriibs Zell goufe vill méi niddreg wéi déi vun de Colon Kriibs Zell Linnen. VerfÜgung Chemosensitizing Auswierkunge vun Pgp inhibitors zu gastric an Colon Kriibs Zellen VerfÜgung Obwuel d'FAQ Niveau waren an dëser Etude net iwwerpréift, funktionell Studien sech mat der Pgp inhibitors an der gastric opgeféiert an Colon Kriibs Linnen Zell den héchsten Niveau vun MDR1 VerfÜgung mRNA Ausdrock ausdrécken. Als zu Dorënner 4A gewisen, déi Colo320HSR Zellen (Colon, Mann- p53, héchste Ausdrock vun MDR1 VerfÜgung mRNA) goufen 14-fantastesch an > 200 Mol resistent paclitaxel wéi d'SNU-C5 an SNU-668 Zellen (gastric, Mann- p53, héchste Ausdrock vun MDR1 VerfÜgung mRNA) als Verglach op der Basis vun den IC 50 Wäerter, respektiv déi, déi e wesentlechen Ënnerscheed an der Pgp Niveauen. Ausserdeem war d'Resistenz vun de Colo320HSR Zellen ze paclitaxel vun der Pgp inhibitors dorënner cyclosporine A réckgängeg, verapamil, an PSC833 (Dorënner 4B). Allerdéngs war dës reversal net an der SNU-C5 (Colon, kee MDR1 VerfÜgung mRNA) Zellen souwéi SNU-668 observéiert. Dëst deit drophin, datt Pgp vun Colon Kriibs Zellen ausgedréckt awer net gastric Kriibs Zellen Wierker System an kann vun der Pgp inhibitors inhibited ginn. Figur 4 Se Pgp Ausdrock a Funktioun vun gastric an Colon Kriibs Zell Linnen. (A) Vergläichend Empfindlechkeet vun Colo320HSR (Colon, héchsten), SNU-668 (gastric, héchsten) an SNU-C5 (Colon, keen Ausdrock) zu paclitaxel; (B) Effects vun Pgp inhibitors op der Empfindlechkeet vun Colo320HSR, SNU-668 an SNU-C5 zu paclitaxel (IC10 Konzentratioun; 50 μM, 0.3 nm an 0,5 nm, bzw.). Sensibilitéit fir paclitaxel war mat MTT assay an der Presenz oder Feele vun der Pgp inhibitors (cyclosporin A, verapamil an PSC833 vun 0,8 μM all) sech. *, P &Si besteet;. 0,05 versus d'Kontroll VerfÜgung Se methylation Status vun MDR1 an huet gastric an Colon Kriibs Zellen VerfÜgung D'methylation Status vun quantification Hinnen alleguer-baséiert methylation Analyse fir eng CpG-räiche Domän alles ze ginn ongeféier 1 haltege kb Exon 1 an intron 1 ënnert dem Promoteur VerfÜgung MDR1. Fir den Ofschloss vun methylation vun der Gentherapie Promoteur Regioun, zwee primers (MS1 an MS2) wouvun der MSP VerfÜgung ech /Hpa VerfÜgung II Siten VerfÜgung MDR1 bestëmmen aus Exon 1 an intron 1, respektiv entworf goufen. D'primer Pair MC als eng positiv Kontroll benotzt gouf d'Qualitéit vun der Quell Frankräich DNA ze bestëmmen. Am Géigesaz, datt d'Punktzuel déi ech /Hpa VerfÜgung II Site bei der triosephosphate isomerase Gentherapie Promoteur Regioun VerfÜgung MSP Kräizer an ass ni war den negativen Kontroll benotzt methylated. Figur 5B weist typesch quantification Hinnen alleguer-baséiert methylation Analyse Biller vun der SNU-5 (gastric) an HT-29 (Colon) Zellen. D'quantification Hinnen alleguer-baséiert methylation Analyse verroden, datt all Hinnen alleguer Produiten fir d'MS1 an MS2 sech net aus Pompey produzéiert VerfÜgung 1-verdaut Frankräich DNA mat MSP behandelt VerfÜgung ech (methylation-Géigestand seng Identitéit verléiert Aktivitéit). Wéinst dem Hinnen alleguer Produiten fir béid MS1 an MS2 an der SNU-5 Zellen, mä e Hinnen alleguer Produit fir d'MS1 gehalen an der HT-29 Zellen sech no Hpa VerfÜgung II (methylation-senisitive Aktivitéit) Behandlung kritt, déi besot methylation vun CpG um MS1 an MS2 Siten an der SNU-5 Zellen an nëmmen um MS2 Site vun der HT-29 Zellen. Wéi an Table 1 zesummegefaasst, war methylation um MS1 an MS2 Siten vun den 9 gastric Kriibs Zell Linnen mat der Ausnam vun SNU-484, mä 2 (SNU-C5 an HCT-116) vun der 9 Colon Kriibs Zell Linnen fonnt. Op der aner Hand, goufen d'HT-29 Zellen nëmmen um MS2 Site methylated. D'SNU-C5, HT-29 (Colon) an SNU-16 (gastric) Zellen MDR1 VerfÜgung mRNA net sech ausdrécke methylated. Bisulfite DNA sequencing Analyse war standing der methylation ze confirméieren. Als weisen an Table 1, methylation Diplome (%) vun 10 CpG Siten op der MS1 är Site misst mat de Resultater vun quantification Hinnen alleguer-baséiert methylation analysis.Table 1 Methylation Status an d'Auswierkunge vun 5AC an /oder TSA op MDR1 kritt stemmt ass
mRNA Ausdrock an zu verschiddenen gastric an Colon Kriibs Zell Linnen VerfÜgung zu zu zu zu DNA methylation assay
zu zu zu zu Ray
Zell Linn
5AC
Restriktioun Aktivitéit
Natrium Bisulfite
TSA VerfÜgung
5AC + TSA
zu zu falen
Effekt
Site VerfÜgung studéiert VerfÜgung (%)1

Fold

Effect

Fold

Effect

Gastric
SNU-1
32.6
O
MS1
MS2
100
20.7
O
+23.6
D
SNU-5 zur VerfÜgung 5.8 VerfÜgung O VerfÜgung MS1 VerfÜgung MS2 VerfÜgung 100 VerfÜgung 1,03 VerfÜgung X VerfÜgung 6,8 VerfÜgung A VerfÜgung SNU-16 VerfÜgung rg
X VerfÜgung MS1 VerfÜgung MS2 VerfÜgung 60 VerfÜgung 8.4 VerfÜgung O VerfÜgung 28,9 VerfÜgung S VerfÜgung SNU-216 VerfÜgung -1,0 VerfÜgung X VerfÜgung MS1 VerfÜgung MS2 VerfÜgung 50 VerfÜgung 8.4 VerfÜgung O VerfÜgung 8.2 VerfÜgung N VerfÜgung SNU-484 VerfÜgung -1,3 VerfÜgung X VerfÜgung - VerfÜgung - VerfÜgung 0 VerfÜgung -5,1 VerfÜgung X VerfÜgung -0,17 VerfÜgung - VerfÜgung SNU-601 VerfÜgung 3,2 VerfÜgung O VerfÜgung MS1 VerfÜgung MS2 VerfÜgung 100 VerfÜgung 3,3
O VerfÜgung 13,7 VerfÜgung S VerfÜgung SNU-620 VerfÜgung 67,6 VerfÜgung O VerfÜgung MS1 VerfÜgung MS2 VerfÜgung 100 VerfÜgung * VerfÜgung X VerfÜgung *
* VerfÜgung SNU-638 VerfÜgung 68,9 VerfÜgung O VerfÜgung MS1 VerfÜgung MS2 VerfÜgung 100 VerfÜgung 5,7 VerfÜgung O VerfÜgung 72,9 VerfÜgung A VerfÜgung SNU- 668 VerfÜgung -1,0 VerfÜgung X VerfÜgung MS1 VerfÜgung MS2 VerfÜgung 80 VerfÜgung 1,8 VerfÜgung O VerfÜgung 4,4 VerfÜgung S VerfÜgung SNU-719
5.8
O
MS1
MS2
100
4.2
O
12.4
S
Colon
SNU-C1
-1.96
X
n.d.
n.d.
0
1.7
O
+1.0
D
SNU-C4 VerfÜgung 1.0 VerfÜgung X VerfÜgung rg VerfÜgung rg VerfÜgung 0 VerfÜgung -1 VerfÜgung X VerfÜgung -1,6 VerfÜgung N VerfÜgung SNU-C5 VerfÜgung rg VerfÜgung X VerfÜgung MS1 VerfÜgung MS2 VerfÜgung 100 VerfÜgung rg VerfÜgung X VerfÜgung 8 VerfÜgung S VerfÜgung Colo320HSR VerfÜgung 1,4 VerfÜgung X VerfÜgung rg
rg VerfÜgung 0 VerfÜgung 1,6 VerfÜgung O VerfÜgung +1,3 VerfÜgung D VerfÜgung LoVo VerfÜgung -1,9 VerfÜgung X VerfÜgung rg VerfÜgung rg VerfÜgung 0
1,1 VerfÜgung X VerfÜgung -2 VerfÜgung N VerfÜgung DLD-1 VerfÜgung 1,1 VerfÜgung X VerfÜgung rg VerfÜgung rg VerfÜgung 0 VerfÜgung 3,5 VerfÜgung O VerfÜgung +1,1 VerfÜgung D VerfÜgung HT-29 VerfÜgung * VerfÜgung X VerfÜgung rg VerfÜgung MS2 VerfÜgung 0 VerfÜgung ∞ VerfÜgung O VerfÜgung * VerfÜgung * VerfÜgung HCT-8 VerfÜgung 1.0 VerfÜgung X VerfÜgung rg VerfÜgung rg VerfÜgung 0 VerfÜgung 1.0 VerfÜgung X VerfÜgung 1,1 VerfÜgung N VerfÜgung HCT-116
1,7 VerfÜgung O VerfÜgung MS1 VerfÜgung MS2 VerfÜgung 100 VerfÜgung 1,6 VerfÜgung O VerfÜgung 1,6 VerfÜgung N VerfÜgung 1Sequence analyséiert war mat Hinnen alleguer Produiten der verlängert MS1 Site wouvun datt gouf eng wichteg Roll an MDR1 VerfÜgung mRNA Ausdrock dës Distanz ze spillen. n.d., net fonnt; *, Héichgradeg cytotoxic; ∞, eng Hausse am Verglach mat kee MDR1 mRNA VerfÜgung Ausdrock; D, ofgeholl; A, additive; S, synergistic; N, net VerfÜgung Dorënner 5 D'quantification Hinnen alleguer-baséiert methylation Analyse vun gastric an Colon Kriibs Zell Linnen geännert. (A) CpG Siten an Hpa II VerfÜgung /MSP ech VerfÜgung Siten an de Mënsch MDR1 VerfÜgung Promoteur Regioun. Top: D'CpG Emplacementer vun de kuerzen vertikalen Baren vertrueden. D'Positioune vun exons 1 an 2 sinn als zougemaach Këschte uginn. D'Positioun zu dëse Fragmenter entspriechend uginn. Mëttelalter: Hpa II VerfÜgung /MSP ech VerfÜgung Unerkennung Siten déi kuerz vertikalen Baren vertruede sinn. Ënnen, Hinnen alleguer primers zu methylation Analyse benotzt. (B) Vertriederin methylation Zoustand vun de Promoteur Regioun vun quantification Hinnen alleguer-baséiert methylation Analyse vun SNU-5 (gastric) an HT-29 (Colon) VerfÜgung MDR1. 1: Punktzuel, Nie-methylated Hpa II VerfÜgung /MSP ech VerfÜgung Site bei der triosephosphate isomerase Gentherapie Promoteur Regioun (negativ Kontroll) (240 BP); 2: MC, déi positiv Kontroll primer Pair (240 BP); 3: MS1, Hpa II VerfÜgung /MSP ech VerfÜgung Site 1 (121 BP); 4: MS2, Hpa II VerfÜgung /MSP ech VerfÜgung Site 2 (206 BP) VerfÜgung Effects vun 5-AZA-2'-deoxcytidine (5AC) an /oder trichostatin A (TSA) op den Ausdrock vun. MDR1 mRNA zu gastric an Colon Kriibs Zell Linnen VerfÜgung d'inhibitor 5AC DNA methyltransferase an der histone deacetylase (HDAC) inhibitor TSA gewiescht bekannt ze epigenetic Gentherapie Repressioun [22] entlaaschten. Dës Etude iwwerpréift den Effet vun 5AC an /oder TSA op MDR1 VerfÜgung mRNA Ausdrock vun der gastric an Colon Kriibs Linnen. An 10 gastric an 9 Colon Kriibs Zellen, war MDR1 VerfÜgung mRNA Ausdrock vun RT-Hinnen alleguer sech no hinnen mat 2,5 μM 5AC fir 96 HR an /oder 100 Dummeldéng /ml TSA fir 48 HR bestéet. Eng Hausse gouf a Fäll definéiert méi wéi eng 1,5-fantastesch Erhéijung weist. Wéi an Table 1 gewisen, fräi 5AC Behandlung der mRNA Niveauen VerfÜgung MDR1 an der SNU-1, -5, -601, -620, -638 an -719 gastric Kriibs Zell Linnen, an dass an der HCT-116 Colon Kriibs Zell Linn (Sauerdall 6 a 7). Allerdéngs huet 5AC net MDR1 VerfÜgung mRNA Ausdrock och an der SNU-16 an SNU-C5 an HT-29 Zellen hir MDR1 VerfÜgung Gentherapie methylated war induce. D'TSA Behandlung fräi MDR1 VerfÜgung mRNA Niveauen am SNU-1, -16, -216, -601, -638, -668 an -719 gastric Kriibs Zell Linnen an der SNU-C1, Colo320HSR, DLD-1, H29 an HCT-116 Colon Kriibs Zell Linnen (Dorënner 6 a 7). 5AC zougedréckt héich cytotoxicity eleng oder a Kombinatioun mat TSA, besonnesch an der HT-29 Zellen. Och, zougedréckt TSA héich cytotoxic Aktivitéit eleng oder a Kombinatioun mat 5AC, besonnesch an der SNU-620 Zellen. Dës Etude iwwerpréift och d'Auswierkunge vun der kombinéiert Behandlung vun 5AC mat TSA, déi de MDR1 VerfÜgung mRNA Niveauen additively an der SNU-5 an -638 Zellen fräi mä synergistically an der SNU-16, -601, -668, -719 an SNU-C5 Zellen (Table 1). Figur 6 Activatiounscode vun MDR1 mRNA Ausdrock vun 5AC an /oder TSA zu gastric Kriibs Zellen. Den Ausdrock Niveau ass wéi d'Verhältnis vun MDR1 VerfÜgung /β-actin gemellt. D'total RNS war fir 96 HR mat 2,5 μM 5AC der Behandlung isoléiert an /oder 100 Dummeldéng /ml TSA fir 48 HR. RT-Hinnen alleguer war mat der selwechter Methodik an Dorënner 1. VerfÜgung Dorënner 7 Activatiounscode vun MDR1 mRNA gemellt standing Ausdrock vun 5AC an /oder TSA zu verschiddenen Colon Kriibs Zell Linnen. RT-Hinnen alleguer assay no der Zellen mat 5AC bestéet an /oder TSA déi selwecht Method an Dorënner beschriwwen benotzt 6. D'MDR1 /β-actin VerfÜgung Verhältnis kritt duerch 35-Zyklus Hinnen alleguer no TSA a Kombinatioun mat 5AC, an dësen SNU -C5 an HT-29 keen MDR1 VerfÜgung mRNA ausdrécken, respektiv, war an der ugëtt goufen ewech gelooss. VerfÜgung Dës Resultater hindeit, datt MDR1 VerfÜgung mRNA Ausdrock ass zu gastric an Colon Kriibs Zellen mat Respekt fir den silencing differentially reegelen vun MDR1 VerfÜgung Ausdrock duerch epigenetic Mechanismen wéi DNA methylation an /oder histone deacetylation. VerfÜgung Diskussioun VerfÜgung an dëser Etude, fonnt mir datt de MDR1 VerfÜgung mRNA Niveauen an der gastric Kriibs Zell Linnen ewéi déi wesentlech manner huet an der Zell Linnen Colon Kriibs, obwuel et e puer Ännerungen. Des Resultater sinn konsequent mat engem Rapport weist, datt Pgp staark op der ileum an Colon ausgedréckt ass, op engem Niveau, dass lues a lues proximally an der jejunum Verloschter, Ausléiser an Mo [8]. Zanter de Mo a Colon grouss Roll an unzereegen an Tellur spillen, respektiv, ass et net aussergewéinlech, dass Transporter wéi Pgp differentially am zwou normal Stoffer ausgedréckt huet. Eis fannen dass den Ënnerscheed Ausdrock vun MDR1 VerfÜgung mRNA zu Kriibs Zell Linnen ofgeleet vun de Mo a Colon mat publizéiert Rapporten och konsequent ass [23-26]. Immunopathological Studien Teamchef Pgp Ausdrock op mënschlech erhéijen war déi allgemeng am Colon, keen Auto fonnt, an adrenal carcinomas mee selten an haett an gastric carcinomas a bestëmmte meeschten Zell erhéijen [27]. VerfÜgung Déi dräi-Manéier Verbindung tëscht DNA methylation, chromatin Struktur an der Gentherapie Ausdrock war kierzlech gekuckt [28-30]. Eng wichteg Konsequenz vun CpG methylation ass d'lokal silencing vun der Gentherapie Ausdrock, deen duerch déi direkt Amëschung vun methylation mat der bindend vun verschiddenen Transkriptiouns Faktoren mediated kënnen. De grousse Volet vun der Gentherapie Ausdrock vun silencing schéngt d'Modalitéite vun Duerch-CpG-verbindlech FAQ 2 (MeCp2), déi fir Duerch-CpG [31, 32] eng Affinitéit huet gin. DNA demethylation vun 5AC Ursaachen der Verëffentlechung vun der MeCp2 vun de Promoteur, deen Ausdrock transcriptional Gentherapie activéiert [10]. Et ass bekannt, datt MeCp2 och op de Promoteur VerfÜgung MDR1 beräichert gëtt an ass un sengen silencing Zesummenhang [33]. 5AC Mäe der methylation Muster vun der fir Premier VerfÜgung 1 Promoteur am Pgp-negativ Zellen déi vun Pgp-positiv Zellen ze gläichen an activéiert de Promoteur, sou datt MDR1 VerfÜgung mRNA Magnéitfeld [34] ass. VerfÜgung An dëser Etude, der methylation Zoustand war och fir ze analyséieren ob d'silencing zu hypermethylation vun de Promoteur Regioun wéinst VerfÜgung MDR1 fir festzestellen ass.

• Imaging zu hepatic an peritoneal Investitiounen vun gastric Kriibs Fliessband: eng systematesch review
• Gastric Rouer Enregistréiere direkt ënner Visioun mat de Kinnek Vision ™ Video laryngoscope: eng zoufälleg mèi, Medeziner Prozess