Förändringar i gastrisk enteriska nervsystemet och muskel: en fallrapport om två patienter med diabetes gastroparesis

förändringar i mag enteriska nervsystemet och muskel: en fallrapport om två patienter med diabetesrelaterad gastro Bild Sammanfattning
Bakgrund
patofysiologiska grund av diabetesrelaterad gastro är dåligt förstådd, till stor del på grund av den nästan totala avsaknaden av uppgifter om neuropatologiska och molekylära förändringar i magen på patienterna. Experimentella modeller indikerar olika skador som påverkar vagus, muskel, enter neuroner, interstitiella celler av Cajal (ICC) eller andra cellulära komponenter. Syftet med denna studie var att använda moderna analytiska metoder för att bestämma morfologiska och molekylära förändringar i magväggen hos patienter med diabetesrelaterad gastro.
Metoder
full tjocklek gastric biopsier erhölls laparoscopically från två gastroparetic patienter som genomgår kirurgiska ingrepp och från sjukdomsfria områden av kontrollpersoner som genomgår andra former av magoperationer. Prover bearbetades för histologisk och immunhistokemisk undersökning.
Resultat
Även om båda patienterna hade svåra eldfasta symptom med undernäring, kräver placering av en gastrisk stimulator, en av dem hade inga signifikanta förändringar jämfört med kontroller. Denna patient hade en abrupt början av symptom med en relativt kort varaktighet av diabetes som var väl kontrollerad. Däremot hade den andra patienten långvariga sköra och dåligt kontrollerad diabetes med många episoder av diabetisk ketoacidos och ofta hypoglykemiska episoder. Histologisk undersökning i denna patientgrupp avslöjade ökad fibros i muskelskikt samt betydligt färre nervtrådar och myenteric nervceller som bedöms av PGP9.5 färgning. Vidare tillsattes betydande minskning ses i färgning för neuronal kväveoxidsyntas, heme oxygenas-2, tyrosinhydroxylas såväl som för c-KIT.
Slutsats
Vi drar slutsatsen att dålig metabol kontroll associerad med signifikanta patologiska förändringar i magväggen som påverkar alla viktiga komponenter såsom muskel, neuroner och ICC. Svåra symtom kan förekomma i frånvaro av dessa förändringar, dock och kan återspegla vagala, centrala eller hormonell påverkan. Gastroparesis är därför sannolikt att vara en heterogen sjukdom. Noggrann molekylära och patologiska analys kan ge mer exakt fenotypisk differentiering och sprida insikt i de bakomliggande mekanismerna samt identifiera nya terapeutiska mål.
Bakgrund
långvariga och dåligt kontrollerad diabetes kan leda till många störningar i mag-tarmfunktion vilket gastropares är en av de vanligaste. I tertiära hänvisningscentra gastropares ses i 20-55% av patienter med typ I och upp till 30% av patienter med typ Il-diabetes [1]. Patogenesen av gastropares är dåligt förstådd, delvis på grund av en brist på presumtiva omfattande studier av gastrisk patologi hos dessa patienter. Vidare, medan djurmodeller tyder på att patogenesen av diabetisk gastro är sannolikt att vara beroende av flera faktorer som involverar vagus, inneboende nerver, interstitiella celler och glatt muskulatur i magen, den relativa betydelsen av dessa faktorer för att förklara variationer i den kliniska presentationen och naturhistoria patienter är okänd [2]. Här rapporterar vi den första systematiska analysen av gastrisk patologi i två människor med diabetesrelaterad gastro, med hjälp av histologiska och immunhistokemiska tekniker. Våra resultat understryker heterogenitet detta syndrom och ge flera hypoteser för framtida studier.
Metoder
Patienter
Båda patienterna rapporterade här hänvisades till University of Texas Medical Branch (UTMB) med en diagnos av diabetisk gastropares och eldfasta symptom. Patienterna samtyckt till att delta i en prospektiv studie av full tjocklek gastric biopsier erhölls laparoscopically vid tidpunkten för kirurgisk placering av en jejunal rör eller gastrisk elektrisk stimulator placering. Alla åldrar redovisas här är vid tidpunkten för den gastriska biopsi.
Full tjocklek gastric biopsi
full tjocklek vävnadsbitar (1 x 2 cm i storlek) togs av kirurgen (GG) ovanför nivån för incisura i den främre väggen av den mellersta kropps av magen. Kontrollprover (n = 2) erhölls från motsvarande område i icke-diabetiska feta patienter som genomgår gastric bypass operation av samma kirurg.
Patologisk och immunhistokemisk undersökning av vävnads
för immunohistokemi studier var biopsiprov fixerades i 4 % paraformaldehyd (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) i 1 × fosfatbuffertlösning, sköljdes i en × fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och nedsänktes över natten i en × PBS-lösning innehållande 30% sackaros (Sigma-Aldrich, St. Louis , MO). Alla inkubationer genomfördes vid 4 ° C. Biopsiema skars i tvärsnitt och frystes i Tissue-Tek OCT-förening (elektronmikroskopi Sciences, Hatfield, PA). 12 | j, m tjocka kryostatsnitt skars. En standard H & E och Trichrome fläck protokoll avslutades på sektionerna. Närvaron av fibros bedömdes med hjälp Massons trikrom-färgning. För immunohistokemi sex olika antikroppar användes enligt samma protokoll som beskrivs nedan. Antikropparna som användes var en polyklonal kanin-anti-humant protein-genprodukten 9,5 (PGP 9,5) (1: 2000, ABD Serotec, Oxford, UK), polyklonal kanin-anti-human neuronal kväveoxidsyntas (nNOS) (1: 4000, Chemicon, Temecula, CA), polyklonal får-anti-rått-tyrosinhydroxylas (TH) (1: 200), polyklonala kanin-anti-substans P (1: 1200, Chemicon, Temecula, CA), kanin-anti-human-heme oxygenas II (HO-2 ) (1: 10000, vänlig gåva från Dr. Snyder, Johns Hopkins University, Baltimore, MA), polyklonal kanin-anti-human-c-Kit (2 ng /| il, MBL, Nagoya, Japan). Objektglasen först sköljdes två gånger i 1 x PBS följt av ett blockeringssteg för icke-specifik sekundär antikroppsbindning genom att inkubera vävnaden med en 1 x PBS, 10% normalt donkey serum (NDS; Jackson ImmunoResearch Lab, Inc., West Grove, PA) och 0,3% Triton × -100 (Pierce, Rockford, IL) lösning under en timme. Den lämpliga primära antikroppen späddes sedan i en × PBS, 5% NDS, 0,3% Triton × -100 och inkuberades över natten vid 4 ° C. En Cy3 konjugerad åsne-anti-kanin sekundär antikropp eller en Cy3 konjugerad åsne-anti-får sekundär antikropp (Jackson ImmunoResearch Lab, Inc., West Grove, PA) utspädd i 1 x PBS, 2,5% NDS, 0,3% Triton × -100 lösning var används för att visualisera immun positiva strukturer.
institutionella godkännande
studien godkändes av Institutional Review Board vid University of Texas Medical Branch och Mayo Clinic College of Medicine. Informerat samtycke erhölls från alla patienter och kontroller.
Resultat
Kliniska presentationer Bild Case 1 Review, är detta var en 37-årig vit kvinna som utvecklade typ 1-diabetes cirka tre år före biopsi. Gastroparetic symptom som illamående och kräkningar var närvarande vid ungefär samma tid. Trots olika terapier, fortsatte hon att ha svårt illamående och kräkningar, tillsammans med viktminskning. Men förblev hennes diabetes välkontrollerade hela med en HbA1c på 6,2% vid första presentationen. Bild Case 2 Review Detta var en 32 år gammal vit kvinna med en historia av typ I-diabetes för ungefär ett decennium. Diabetes var relativt svårt att kontrollera med många episoder av diabetisk ketoacidos och ofta hypoglykemiska episoder. Vid tidpunkten för presentationen hennes HbA1c varierade mellan 6,6 till 7%. För mer än ett år före placering av en gastrisk elektrisk stimulator, hade patienten svår symtom som illamående, kräkningar och smärta med täta sjukhus.
Båda patienterna hade radiologiska och /eller scintigrafisk bevis för kraftigt fördröjd magtömning. Även formell testning av det autonoma nervsystemet inte genomfördes också både patienter hade vilar takykardi när de var förhållandevis väl, i avsaknad av öppen uttorkning. Slutligen, på lång sikt (> 1 år) som svar på gastrisk elektrisk stimulering skilde sig markant med patient 1 rapporterar en förbättring av symtomen mer än 50% jämfört med baseline medan patienten två upplevde ingen väsentlig förändring i sin kliniska förloppet Patologiska förändringar i magen
Bedömning av fibros (Figur 1) Review Figur 1 Färgning för fibros och för neuronala strukturer. Fälten A-C. Trikromfläckning. Kontroll (A) och sektioner från fall 1 (B) visade ingen ökning av fibros, medan sektioner från fall 2 (C) visade en ökning i fibros i både muskellager och längs den myenteriska plexus. Skalstock 200 um. Panelerna D-F. PGP 9,5 immunreaktivitet. PGP9.5 immunreaktivitet som en markör för neuronala strukturer var normal kontroll (D) och i fall en (E). Det var en minskning i PGP 9,5 immunoreaktivitet i både muskelskikten och myenteric plexus i sektioner från fall 2 (F) vilket tyder på en förlust av neuronala strukturer. Paneler G-I. Tyrosinhydroxylas immunreaktivitet. Tyrosinhydroxylas immunoreaktivitet var normal i kontroll (G). Sektioner från fall ett (H) visar normal tyrosinhydroxylas immunreaktivitet runt myenteric plexus med en lsight minskning av tyrosinhydroxylas immunreaktivitet i muskelskikt. Sektioner från fall 2 (I) visade en markant förlust av tyrosinhydroxylas immunreaktivitet i alla regioner tyder på en förlust av yttre nervfibrer. Skalstock 100 um. Cirkulär muskel (CM), myenteric plexus (MP), längsgående muskel (LM). Bild Case 1
Sektioner från patienten med välkontrollerade diabetes visade en normal färgningsmönster utan tecken på ökad fibros i muskelskikt. Bild Case 2 Review däremot delar från vävnad erhållen från patienten med dåligt kontrollerad diabetes visade en markant ökning av fibros i både muskelskikten och runt myenteric plexus.
Enter nerver (Figur 1)
Antalet nervcellkroppar och fibrer bedömdes med hjälp av antikroppar mot den pan-neuronala tillverkare PGP 9,5. Bild Case 1
Antalet nervfibrer i de cirkulära och longitudinella muskelskikt var normal i sektioner från patienten med välkontrollerade diabetes i jämförelse med kontrollerna. Bild Case 2
det fanns en 40-50% minskning av antalet nervfibrer i patienten med dåligt kontrollerad diabetes i jämförelse med kontroller.
Förändringar i uttrycket av signalsubstanser och besläktade proteiner (Figur 2) Review Figur 2 Immunoreactiivty för nNOS, SP och HO2 som markörer för hämmande och excitatoriska nervcellskroppar och fibrer. Fälten A-C. Normal immunoreaktivitet för nNOS kontroll (A) och fall en (B). nNOS immunoreaktivitet markant minskar vid 2 (C). Panelerna D-F. Substans P expression var normal i kontrollen (D), fall 1 (E), och fall 2 (F). Paneler G-I. Heme oxygenas II (HO-2) immunreaktivitet var normal kontroll (G) och fall ett (H). Sektioner från Case 2 (I) uppvisade en förlust av HO-2-immunreaktivitet som tillsammans med minskningen i nNOS immunoreactivty antyder en förlust av inhibitorisk inmatning ot glatt muskulatur. Skalstock 100 um. Cirkulär muskel (CM), längsgående muskel (LM).
Experiment utfördes därefter riktas för att bestämma om förlusten av nervfibrer sett var specifika för en viss undergrupp av nervfibrer. Antikroppar mot tyrosinhydroxylas (TH) användes för att immunolabel yttre nervfibrer. Antikroppar mot substans P (SP) och neuronal kväveoxidsyntas (nNOS) användes för att immunolabel excitatoriska nerver och hämmande nerver respektive. Antikroppar till heme oxygenas-2 (HO2) användes för att märka nerver och ICC som innehåller heme oxygenas, ett enzym som ger upphov till kolmonoxid, kända för att reglera neurotransmission och glatt muskulatur membranpotential [3, 4]. Bild Case 1
Inga förändringar i uttryck av SP, nNOS, H02 (Figur 2) noterades i avsnitt från patienten med väl kontrollerad diabetes jämfört med kontroller. Det fanns en liten minskning av antalet TH positiva fibrer i muskelskikten i denna patient; dock TH immunoreaktivitet runt ganglier var normala, vilket tyder på en intakt yttre innervation till den inneboende nervsystemet (Figur 1). Bild Case 2 Review Inga väsentliga förändringar sågs med SP antikroppen men immunmärkningen för nNOS, H02 (Figur 2 ) och TH (Figur 1) minskades (med 40-50%) i patienten med dåligt kontrollerad diabetes.
interstitiella celler i Cajal
Human gastric ICC är av två större typer-de som är spridda över hela magen i båda skikten av muskel (ICC-IM) och de som är associerade med plexus myentericus (ICC-MY) i kroppen och antrum, men inte i de mer proximala magen. I denna studie var ICC immunolabeled användning av en antikropp till c-Kit. ICC-MY inte visualiseras antingen patienten eller i kontrollvävnad i denna region i magen. Bild Case 1
Fördelning av ICC-IM var normal i patienten med väl kontrollerad diabetes med normala antal ICC (Figur 3 ). Figur 3 c-Kit uttryck som en markör för interstitiella celler i Cajal. Kontroll (A) och fall en (B) visade normala c-Kit immunreaktivitet medan i fall 2 (C) var det en förlust av c-Kit immunreaktivitet antyder ett minskat antal ICC. Skalstock 100 um. Cirkulär muskel (CM), längsgående muskel (LM). Bild Case 2 Review I patienten med dåligt kontrollerad diabetes antalet c-Kit positiv ICC-IM minskades i båda muskelskikt (med 30-40%, Figur 3).
Diskussion
Trots dess existens som ett kliniskt syndrom för mer än ett halvt århundrade [5], patogenesen av diabetesrelaterad gastro förblir okänd. Studier på experimentmodeller av diabetes har varit relativt snävt inriktad på de intressen som enskilda laboratorier och indikerar inblandning av flera celltyper (nervceller, ICC, muskel), som nyligen granskat [2]. De två mest konsekventa resultaten tycks innebära förändringar i neuronal nNOS uttryck och ICC. Emellertid har en röd tråd eller hypotes för dessa fynd fortfarande inte dykt upp i en del på grund av oförmågan att validera dem hos människor, i vilka tillgång till djupare intramural strukturerna kräver i allmänhet kirurgi. De få studier som har erhållits gastric vävnad på detta sätt var i allmänhet gjort i en tid då avancerade bild- och molekylära tekniker inte existerade och har gett resultat som är oförenliga i bästa fall. Vi rapporterar en systematisk analys av mag enteriska nervsystemet och muskler av två patienter med diabetesrelaterad gastro jämfört med motsvarande vävnaderna från feta kontroller. Slående förändringar sågs hos en patient; Dessa inkluderade en betydande grad av fibros involverar muskelskiktet, vilket sannolikt återspeglar konsekvenserna av allvarlig och kanske upprepad vävnadsskada från metaboliska, vaskulära eller andra komplikationer av diabetes.
Dessa förändringar är i linje med en tidigare rapport som visar kraftig kollagendeponering och fibros i 4 patienter med refraktär diabetesrelaterad gastro [6, 7]. Å andra sidan, en annan studie av 16 patienter med långvariga diabetes (varav fem hade gastro) visade inga avvikelser i den glatta muskulaturen (eller andra strukturer) [8]. Vidare, ingen av dessa studier funnit några betydande förändringar i myenteric plexus, som är i motsats till våra resultat i mål 2, där en betydande minskning av myenteric neuronal färgning sågs tillsammans med en minskning av markörer för hämmande signalsubstanser. Även om vi inte studerar markörer för apoptos eller celldöd i denna studie tyder upptäckten av minskad PGP9.5 märkning att dessa förändringar återspeglar en grad av neuronal förlust och inte bara bara förlust av uttryck av den syntetiska enzymet eller signalsubstans. Dock har bevis för faktisk gastric neuronal förlust i diabetes inte rapporterats antingen djur eller patienter [2], även om en enda fallstudie av en patient med idiopatisk gastropares avslöjade markant minskat antal av PGP 9,5-positiva myenteric neuroner [9].
Kväveoxid är en av de viktigaste signalsubstanser för bibehållande av normal gastrisk motilitet och det finns en stor experimentell litteratur blandar en roll för dess förlust i patogenesen av fördröjd magsäckstömning [10-19]. Senast, en studie av 36 manliga diabetespatienter som genomgår gastric resektion visade betydande förlust av nNOS samt SP uttryck; men det fanns ingen information om huruvida dessa patienter var symtomatisk eller hade nedsatt gastrisk motilitet [20]. I vår patient med dåligt kontrollerad diabetes, var minskningen i den totala neuronala färgning åtföljd av en betydande förlust av nNOS, men inte SP uttryck, vilket tyder på relativt specifik skada hämmande nervceller. I detta sammanhang är vår studie också den första att rapportera förändringar i HO-2, den konstitutiva formen av heme oxygenas som är till stor del ansvarig för produktion av kolmonoxid, en annan endogen gasformig neuromodulator av stor betydelse i den hämmande kontrollen av gastrointestinal motilitet [3 , 21-25]. Den kombinerade förlusten av både hämmande molekyler därmed förväntas orsaka en djupgående störningar av gastric fysiologi som sågs i vår patient (Fall 2). Detta fall visar också skillnader och likheter mellan förändringar i diabetes gastropati jämfört med diabetiker enteropati. Det senare är också förknippat med förlust av nNOS och TH uttryck men däremot uppvisar ökat uttryck av SP [26], vilket tyder på regionala skillnader i effekterna av diabetes på det enteriska nervsystemet.
Slutligen har också tittat vi på förändringar i ICC med hjälp av c-Kit som en markör. ICC spelar flera viktiga roller i gastrointestinalfysiologi inklusive inställning pacemakern rytm, och deltagande i neurotransmission och mechanosensitivity [21, 27-29]. Både in vivo och in vitro-studier av experimentell diabetesrapport ICC utarmning, kanske sekundärt till förlust av insulin /IGF och /eller kväveoxid eller andra ännu obestämd, överlevnadsfaktorer [7, 30-32]. Våra resultat av betydande förlust av c-Kit uttryck i mål 2 är förenliga med andra förändringar noteras i denna patient liksom med nya rapporter hos människor. Således, fyra av nio patienter med refraktär diabetesrelaterad gastro befanns ha betydande förlust av ICC [33]. En minskning av c-Kit färgning noterades även i studien på diabetespatienter som genomgår gastric resektion för cancer [20].
Vår studie är viktigt eftersom det ger en sällsynt inblick i den patologiska samt molekylära förändringar av potentiell betydelse i patogenesen av diabetesrelaterad gastro. Dessutom finns det flera anmärkningsvärda lärdomar från dessa fall. Till att börja med, det verkade vara ett tydligt samband mellan de histologiska förändringar konstaterats och det kliniska förloppet av diabetes, kanske om vikten av dålig glykemisk kontroll i deras utveckling. Förekomsten av fördröjd magtömning korrelerar svagt med varaktigheten av diabetes [34]. Relaterade faktorer, såsom extrem hyper- eller hypoglykemi, även om kortlivade, kan vara ännu viktigare eftersom båda villkoren har visats experimentellt att orsaka nervskada och dödsfall (även om hyperglykemi inte har visats påverka ICC i en djurmodell) [31, 35, 36]. Det är därför möjligt att patient 1 var skonas stora förändringar i gastric patologi eftersom hon upplevde en kortare och metaboliskt stabilare kurs av diabetes än patienten 2. Den enda slutsatsen att notera i vävnad från denna patient var en liten minskning i TH immunoreaktivitet i cirkulär muskelskiktet men inte i myenteric plexus. Eftersom den yttre nervsystemet inte direkt innerverar glatt muskulatur, kan dessa fibrer representerar nerver traversera sin väg till submukosala plexus. Alternativt, dessa kan också vara processer från inneboende neuron eftersom det är en delmängd av enter nerver som också uttrycker TH [37]. Oavsett förblir oklart klinisk-patologisk konsekvenserna av detta konstaterande.
Mer anmärkningsvärt än ovanstående observation, var dock det faktum att förändringarna i magen väggen verkade inte ha någon relation till kliniska symtom. Således, trots jämförbar klinisk svårighetsgrad, de två patienter hade dramatiskt skillnader i gastrisk patologi, med ett är väsentligen normal och den andra visar ett spektrum av avvikelser som påverkar nerver, muskler och ICC. Dessa resultat ger utrymme för flera olika spekulationer. För det första är det möjligt att förändringarna i mål 2 representerar "slutstadiet" patologi till följd av kumulativa och repetitiva metabola förolämpningar. Som sådan kan deras stora kliniska betydelsen är att förutsäga intractability snarare än orsakssamband, vilket säkerligen föreslås av misslyckande denna patient att svara på alla interventioner, däribland gastric elektrisk stimulering. Om detta är sant, då gastroparesis symptom själva kan bero på förändringar som antingen inträffar tidigare (t.ex. kanske den lilla förlusten av TH immunoreaktiva fibrer i den cirkulära muskelskiktet) eller alltför subtil för att upptäckas av de tekniker vi har använt (t.ex. avvikelser i subcellulära signalvägar i avsaknad av morfologiska förändringar, som har beskrivits i gastric muskler från diabetiska djur [38]. sälja andra kan det hävdas att våra patienters symptom inblandade mekanismer som vi inte undersöka, såsom vagal dysfunktion (föreslagits av närvaron av vilar takykardi i båda fallen). Förändringar i vagal funktion har traditionellt varit inblandad i patogenesen av gastro, även fast bevis saknas och korrelationen mellan autonom dysfunktion och fördröjd magtömning är blygsam i bästa fall [2 ,. Slutligen är 34] det möjligt att diabetesrelaterad gastro är verkligen en heterogen sjukdom och att medan vissa patienter har uppenbara gastric patologi (som i fallet 2), andra kan utveckla en pathophysiologically distinkt form av gastro följd av cirkulerande autoimmuna faktorer som kan orsaka dysfunktion men inte sönderdelning av nerver eller muskler, såsom har beskrivits [39, 40].
slutsats
Sammanfattningsvis har vi beskrivit en noggranna patologiska undersökningar av två patienter med diabetisk gastropares. Även om det är svårt att generalisera på grundval av ett så litet antal, dessa fall ger en inblick i patogenesen av gastro och även ligga till grund för flera viktiga hypotes för framtida studier
Förkortningar
nNOS.
neuronal kväveoxidsyntas
HO-2:
heme oxygenas-2
ICC:
interstitiella celler av Cajal
SP:
substans P.
förklaringar
Tack
Detta arbete stöddes delvis av NIDDK U01 DK073983-01 ( PJP, GF) och DK DK68055 och DK57061 (GF) Review författarnas ursprungliga inlämnade handlingarna Images of Nedan finns länkar till författarnas ursprungliga inlämnade filer för bilder. 12876_2007_254_MOESM1_ESM.jpeg Författaroriginalfilen för figur 1 12876_2007_254_MOESM2_ESM.tiff Författaroriginalfilen för figur 2 12876_2007_254_MOESM3_ESM.tiff Författaroriginalfilen för figur 3 konkurrerande intressen
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.

• Värdet av serum pepsinogen nivåerna för diagnos av magsjukdomar på kinesiska Han människor i Midsouth Kina
• Marginell grumlig band och ljusblå vapen, skyltar observerats i förstoringsglas smalbands imaging endoskopi, indikerar gastric intestinal metaplasi